Nghiên cứu hoạt tính gây độc của hợp chất phân lập từ san hô mềm Sinularia đối với tế bào ung thư

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết,

• Tác giả: Ninh Thị Ngọc
• Người hướng dẫn: Nguyễn Hoài Nam
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu độc tính của hợp chất từ san hô mềm Sinularia đối với tế bào ung thư
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 1.1. Các dòng tế bào ung thư
• 1.2. Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống ung thư
• 1.3. Cơ chế diệt tế bào ung thư dựa trên apoptosis
• 1.4. Cơ chế diệt tế bào ung thư liên quan tới chu kỳ tế bào
• 1.5. Các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển trong điều trị ung thư
• 1.6. Tình hình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc từ sinh vật biển
• 1.7. Tình hình nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính chống ung thư từ san hô mềm của Việt Nam
• 1.8. Giới thiệu chung về san hô mềm
• 1.9. Đặc điểm của san hô mềm
• 1.10. Tổng quan về chi Sinularia
• 1.11. Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại san hô mềm
• 1.12. Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ các loài san hô mềm thuộc chi Sinularia
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Loài san hô mềm S.
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Xác định tên khoa học của các mẫu san hô mềm
• 2.3.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
• 2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào ung thư
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Xác định loài bằng chỉ thị phân tử
• 3.1.1. Giải trình tự đoạn gen 28S rARN và msh1 của 3 mẫu san hô mềm
• 3.1.2. So sánh trình tự của 3 mẫu san hô mềm bằng chương trình BLAST
• 3.2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
• 3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ mẫu san hô mềm S.
• 3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ các mẫu san hô mềm
• 3.2.3. Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của hợp chất SLE 27 và hợp chất SCO 27
• 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Xác định loài của các mẫu san hô mềm dựa vào các trình tự ADN chỉ thị
• 4.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S.
• 4.2.1. Hợp chất SN 8: 3β,4α-dihydroxyergosta-5,24(28)-diene (hợp chất mới)
• 4.2.2. Hợp chất SN 6: 24(S),28-epoxyergost-5-ene-3β,4α-diol (hợp chất mới)
• 4.2.3. Hợp chất SN 20: Nanolobatol B (hợp chất mới)
• 4.2.4. Hợp chất SN 30: Nanolobatol A (hợp chất mới)
• 4.2.5. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại
• 4.2.6. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S.
• 4.2.7. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S.
• 4.2.8. Hợp chất SLE 10: Leptosteroid (chất mới)
• 4.2.9. Hợp chất SLE 21: 5,6β-epoxygorgosterol (chất mới)
• 4.2.10. Hợp chất SLE 27: Ergosta-5,24(28)-dien-3β,7β-diol
• 4.2.11. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại
• 4.2.12. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S.
• 4.2.13. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ S.
• 4.2.14. Hợp chất SCO 29: 7α-methoxygorgosterol (chất mới)
• 4.2.15. Hợp chất SCO 30: 7α-Methoxy-ergosta-5-ene-3β-ol (chất mới)
• 4.2.16. Hợp chất SCO 44: 3β-hydroxyergosta-4-en-6-one (chất mới)
• 4.2.17. Hợp chất SCO 42: ergost-24(28)-ene-3β,5α,6β-triol-3-acetate (chất mới)
• 4.2.18. Hợp chất SCO 32: 3β-hydroxyergosta-4,24(28)-dien-6-one (chất mới)
• 4.2.19. Hợp chất SCO 27: 24-methylenecholestane-3β,5α,6β-triol-6-monoacetate
• 4.2.20. Xác định cấu trúc của các hợp chất còn lại
• 4.2.21. Thống kê các hợp chất phân lập được từ loài S.
• 4.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được
• 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài S.
• 4.3.2. Nghiên cứu cơ chế chống ung thư của hợp chất SLE 27 và SCO 27
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về độc tính của hợp chất từ san hô mềm Sinularia

Nghiên cứu về độc tính của các hợp chất từ san hô mềm Sinularia đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trong lĩnh vực sinh học và dược học. Các hợp chất này được chiết xuất từ các loài san hô mềm như Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, và Sinularia conferta. Chúng có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất này có khả năng gây độc tế bào, đặc biệt là đối với các dòng tế bào ung thư như A549 và MCF-7. Việc tìm hiểu tác động của các hợp chất này đến tế bào ung thư không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của chúng mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị ung thư.

II. Phương pháp nghiên cứu và phân tích độc tính

Phương pháp nghiên cứu bao gồm việc phân lập các hợp chất từ san hô mềm và đánh giá độc tính tế bào thông qua các thử nghiệm sinh học. Các dòng tế bào ung thư được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm A549 (tế bào ung thư phổi) và MCF-7 (tế bào ung thư vú). Kết quả cho thấy rằng các hợp chất từ Sinularia có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, với giá trị IC50 được xác định cho từng hợp chất. Việc sử dụng các phương pháp như nhuộm Annexin V/PI giúp xác định tỷ lệ tế bào apoptosis, từ đó đánh giá hiệu quả của các hợp chất trong việc gây độc tế bào. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về tác động của các hợp chất mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới.

III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất từ san hô mềm Sinularia có hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ. Cụ thể, hợp chất SLE 27 và SCO 27 đã cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư một cách hiệu quả. Các thử nghiệm cho thấy rằng tỷ lệ tế bào apoptosis tăng lên đáng kể khi điều trị với các hợp chất này. Điều này cho thấy rằng các hợp chất này có thể hoạt động thông qua cơ chế apoptosis, một quá trình quan trọng trong việc loại bỏ tế bào ung thư. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ san hô mềm có thể là một hướng đi tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới.

IV. Giá trị thực tiễn và ứng dụng

Nghiên cứu về độc tính của hợp chất từ san hô mềm Sinularia không chỉ có giá trị trong lĩnh vực khoa học mà còn có ứng dụng thực tiễn trong y học. Các hợp chất này có thể được phát triển thành các loại thuốc mới, giúp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân ung thư. Việc tìm kiếm và phát triển các hợp chất tự nhiên từ sinh vật biển là một lĩnh vực đầy tiềm năng, đặc biệt là trong bối cảnh hiện nay khi mà các phương pháp điều trị ung thư truyền thống vẫn còn nhiều hạn chế. Nghiên cứu này mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới, an toàn và hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Hóa sinh học (mã số 9.16) của nghiên cứu sinh Ninh Thị Ngọc có tiêu đề: "Nghiên cứu hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados, Sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam". Công trình được thực hiện tại Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hoài Nam và TS. Trần Mỹ Linh, bảo vệ năm 2021 tại Học viện Khoa học và Công nghệ.

Về tính cấp thiết, các bệnh hiểm nghèo như ung thư tiếp tục là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu, đòi hỏi việc tìm kiếm các hoạt chất mới có khả năng ức chế tế bào khối u và giảm thiểu tác dụng phụ. Sinh vật biển, đặc biệt là các loài sống ở đáy biển sâu với điều kiện cạnh tranh sinh thái cao, là nguồn cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp có cấu trúc đặc thù và hoạt tính sinh học chọn lọc. Việt Nam có bờ biển dài trên 3.260 km cùng hệ thống đảo và vịnh phong phú, song các nghiên cứu về hóa sinh biển trong nước trước đây chủ yếu dừng lại ở việc sàng lọc sơ bộ hoạt tính in vitro, còn hạn chế về nghiên cứu cơ chế phân tử và thử nghiệm in vivo. Chi san hô mềm Sinularia (họ Alcyoniidae) phân bố rộng và có sinh khối lớn tại vùng biển nhiệt đới, nổi tiếng với các hợp chất sesquiterpen, diterpen và steroid. Tuy nhiên, ba loài Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados và Sinularia conferta tại vùng biển Việt Nam hầu như chưa được khảo sát một cách có hệ thống về thành phần hóa học cũng như hoạt tính gây độc tế bào ung thư.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 điểm:

1. Xác định được thành phần hóa học của ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados và Sinularia conferta thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam.
2. Phát hiện được các hoạt chất có hoạt tính gây độc tế bào có trong các loài san hô mềm nghiên cứu, định hướng ứng dụng cho các nghiên cứu y sinh dược học.

Nội dung nghiên cứu của luận án gồm 4 phần chính:

1. Xác định tên khoa học của ba loài san hô mềm thu thập ở vùng biển Trung Bộ Việt Nam bằng chỉ thị phân tử.
2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ ba loài san hô mềm S. nanolobata, S. leptoclados, S. conferta.
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được.
4. Đánh giá cơ chế gây độc tế bào của một số hợp chất tiêu biểu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Ba loài san hô mềm thuộc chi Sinularia, bao gồm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados và Sinularia conferta.
• Phạm vi không gian: Mẫu S. nanolobata được thu thập tại vùng biển Lăng Cô (tỉnh Thừa Thiên Huế); các mẫu S. leptoclados và S. conferta được thu thập tại vùng biển đảo Cồn Cỏ (tỉnh Quảng Trị).
• Phạm vi nội dung: Giám định loài bằng trình tự gen 28S rARN và msh1; chiết tách, phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết; đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người (in vitro) và phân tích cơ chế gây chết tế bào theo con đường apoptosis và điều hòa chu kỳ tế bào.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án điểm lại lịch sử phát triển của các dòng tế bào ung thư từ mốc lịch sử nuôi cấy tế bào HeLa năm 1951 bởi George Otto Gey, việc sử dụng tế bào HeLa của Jonas Salk (1954) để phát triển vắc xin bại liệt, đến việc thiết lập bảng 60 dòng tế bào (NCI60) của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, bảng 45 dòng tế bào (JFCR-45) của Nakatsu và cộng sự (2005), cùng nghiên cứu sàng lọc 130 loại thuốc trên hàng trăm dòng tế bào của Garnett và cộng sự (2012). Tác giả tổng hợp số liệu thống kê từ Blunt và cộng sự về tỷ lệ nguồn dược liệu biển: Động vật thân lỗ chiếm 37%, Động vật ruột khoang chiếm 21%, Vi sinh vật chiếm 18%, Tảo chiếm 9%, Động vật da gai chiếm 6%, Tunicate chiếm 6%, Động vật thân mềm chiếm 2% và Động vật hình rêu chiếm 1%.

Văn bản hệ thống hóa các loại thuốc chống ung thư có nguồn gốc sinh vật biển đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) phê duyệt lâm sàng:

Tên hợp chất	Tên thuốc	Nguồn sinh vật biển	Lớp chất	Cơ chế tác động	Tài liệu tham khảo
Cytarabine (Ara-C)	Cytosar-U®	Hải miên	Nucleoside	Ức chế ADN polymerase	[28, 29, 30]
Eribulin Mesylate (E7389)	Halaven®	Hải miên	Macrolide	Tác động vi ống (Microtubules)	[32]
Trabectedin (ET-743)	Yondelis®	Hải tiêu	Alkaloid	Liên kết rãnh nhỏ của ADN	[31]
Brentuximab vedotin (SGN-35)	Adcetris®	Động vật thân mềm / Vi khuẩn lam	Liên hợp kháng thể - thuốc (MMAE)	Kháng CD30 & ức chế vi ống	[33, 34]
Plitidepsin	Aplidin®	Hải tiêu	Depsipeptide	Kích hoạt Rac1 & JNK	[35]
Polatuzumab vedotin	Polivy™	Động vật thân mềm / Vi khuẩn lam	Liên hợp kháng thể - thuốc	Kháng CD79b & ức chế vi ống	[36]
Enfortumab vedotin	PADCEV™	Động vật thân mềm / Vi khuẩn lam	Liên hợp kháng thể - thuốc	Kháng Nectin-4 & ức chế vi ống	[37]
Belantamab mafodotin	Blenrep™	Động vật thân mềm / Vi khuẩn lam	Liên hợp kháng thể - thuốc (MMAF)	Tác động vi ống	[38]
Lurbinectedin	Zepzelca™	Hải tiêu	Alkaloid	Liên kết rãnh nhỏ của ADN	[39]

Về chi Sinularia, thế giới đã mô tả khoảng 138 loài (50 loài đã được khảo sát hóa học và hoạt tính sinh học), trong khi tại Việt Nam ghi nhận khoảng 66 loài nhưng mới có 6 loài được nghiên cứu. Các công trình trước đây về các nhóm chất chính từ chi Sinularia được luận án tổng quan gồm:

• Hợp chất sesquiterpen: Hợp chất furanosesquiterpen (3) từ S. kavarittiensis gây độc tế bào THP-1 với $IC_{50} = 29,59\ \mu\text{M}$ qua con đường ty thể; peroxygibberol (4) từ S. gibberosa ($IC_{50} = 8,2\ \mu\text{g/mL}$ trên tế bào gan); hợp chất 5 và 6 từ Sinularia sp. biển Hải Nam; $\Delta^9(15)$-africanene (9) từ S. polydactyla (Brackman 1980, Reddy và cs. 1999) gây độc tế bào EAC và DLAT; nanonorcaryophyllenes B (8) từ S. nanolobata; scabralin A (10) từ S. erecta và S. scabra; lochmolin A–D (11–14) từ S. lochmodes.
• Hợp chất diterpen (nhóm cembranoid và norcembranoid): Sinularin (18), dihydrosinularin (19) và sinulariolide (20) từ S. flexibilis (Weinheimer 1977); nghiên cứu cơ chế của sinularin (18) trên tế bào ung thư dạ dày AGS/NIC-N87 qua trục PI3K/Akt/mTOR (Yu-Jen Wu 2016), trên tế bào melanoma A2058 (Tzu-Rong Su), tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 (Ting-Wen Chung 2017) và ung thư vú SKBR3 (Hurng-Wern Huang 2018); sinulariolide (20) trên tế bào ung thư bàng quang TSGH thông qua ty thể và p38MAPK; các hợp chất sinularolide A–E (24–28) từ S. gibberosa; sinuflexiolide D–E (30–31) từ S. flexibilis; flexibilide (55) từ S. flexibilis (Dan Gao 2016); 5-episinuleptolide acetate (89) từ Sinularia sp.; gyrosanol A–C (99–101) từ S. gyrosa; capilloquinol (102) từ S. capillosa; sinutriangulin A (103) từ S. triangula; sinulodurin A–B (104–105) từ S. dura.
• Hợp chất steroid: Dẫn xuất secocholestane (128, 129) từ S. granosa; gibberoepoxysterol (140) và gibberoketosterol (141) từ S. gibberosa; numersterol-A (126) từ S. numerosa; crassarosterol A và crassarosteroside A–C (150–153) từ S. crassa.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước tập trung trên hai loài Sarcophyton pauciplicatum và Menella woodin, mới dừng lại ở mức thử nghiệm bán trường diễn trên chuột/thỏ (liều 100–200 mg/kg) hoặc thử nghiệm sàng lọc in vitro. Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: ứng dụng công cụ sinh học phân tử để định loại chính xác 3 loài san hô mềm S. nanolobata, S. leptoclados và S. conferta thu thập tại vùng biển Trung Bộ, phân lập các thành phần hóa học tinh khiết (đặc biệt là các chất có cấu trúc mới), và đi sâu đánh giá cơ chế gây độc tế bào ung thư ở mức độ phân tử.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên hai nền tảng chính:

1. Lý thuyết phân loại học phân tử: Sử dụng các đoạn trình tự gen chỉ thị gồm gen nhân 28S rARN và gen ty thể msh1 (mismatch repair protein 1) có tính đa hình cao trong phân loại bộ Alcyonacea, kết hợp đối chiếu ngân hàng gen NCBI và phân tích quan hệ phát sinh loài.
2. Lý thuyết về quá trình tự chết theo chương trình (apoptosis) và chu kỳ tế bào: Apoptosis qua hai con đường nội bào (ty thể, giải phóng Cytochrome C, hoạt hóa caspase 9 và caspase 3) và ngoại bào (thụ thể chết, caspase 8 và caspase 3), kèm theo hiện tượng lật màng phosphatidylserine; lý thuyết kiểm soát sự phân chia tế bào qua các pha G0/G1, S, G2/M và tích lũy tế bào ở pha sub-G1.

Hệ thống phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

[Mẫu san hô mềm (Lăng Cô, Cồn Cỏ)]

1. Phương pháp sinh học phân tử:

• Tách chiết ADN tổng số từ mô san hô.
• Nhân bản đoạn gen chỉ thị bằng phản ứng PCR: Đoạn gen 28S rARN sử dụng cặp mồi 28SF và 28SR; đoạn gen ty thể msh1 sử dụng cặp mồi MSHF và MSHR.
• Dòng hóa sản phẩm PCR vào vector pTZ57R/T, biến nạp vào tế bào khả biến, kiểm tra khuẩn lạc bằng PCR-colony.
• Giải trình tự gen, so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên NCBI, dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-Joining (NJ) sử dụng phần mềm MEGA6.

2. Phương pháp hóa học và xác định cấu trúc:

• Chiết tách mẫu san hô bằng dung môi hữu cơ (ethanol/methanol), phân đoạn chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần.
• Phân lập hợp chất bằng sắc ký cột pha thường (Silica gel), sắc ký cột pha đảo (C18), sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ hiện đại: Phổ khối lượng phân giải cao (HR-TOF-MS, LC-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, $^1\text{H-}^1\text{H}\ \text{COSY}$, HSQC, HMBC, NOESY), phổ hồng ngoại (IR) và phổ lưỡng sắc tròn (CD).

3. Phương pháp đánh giá hoạt tính và cơ chế sinh học:

• Nuôi cấy các dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư phổi (A549, LU-1), ung thư vú (MCF-7, MDAMB-435), ung thư gan (Hep-G2), ung thư máu (HL-60), ung thư ruột kết (DLD-1), ung thư da (SK-Mel-2), và đại thực bào chuột (RAW264.7) được cung cấp bởi ATCC.
• Đánh giá độc tính tế bào in vitro bằng phép thử MTT hoặc Sulforhodamine B (SRB) để xác định giá trị nồng độ ức chế 50% ($IC_{50}$).
• Đánh giá sự thay đổi hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi huỳnh quang.
• Đánh giá tỷ lệ tế bào apoptosis bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang kép Annexin V/PI.
• Đánh giá khả năng kích thích hoạt hóa enzyme caspase 3.
• Phân tích chu kỳ tế bào (phân bố các pha sub-G1, G0/G1, S, G2/M) bằng hệ thống Flow cytometer Novocyte (ACEA Biosciences Inc.) và phần mềm NovoExpress.

Nguồn tư liệu và dữ liệu: Các mẫu san hô mềm tươi thu thập tại vùng biển Lăng Cô (S. nanolobata) và Cồn Cỏ (S. leptoclados, S. conferta); các bộ dữ liệu phổ thực nghiệm NMR, MS; dữ liệu trình tự gen từ NCBI; dữ liệu đo mật độ quang học và dữ liệu dòng tế bào phân tích tế bào theo dòng chảy.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Chương 1 cung cấp tổng quan cơ sở lý luận về ung thư, các mô hình thử nghiệm sinh học và các nghiên cứu về chi Sinularia. Tác giả trình bày cấu trúc giải phẫu học của san hô mềm thuộc bộ Alcyonacea (cấu trúc tập đoàn, hình thái monomorphic và dimorphic của polyp, các dạng khuẩn lạc như dạng phiến bám, dạng phễu, dạng cây, dạng cây bụi). Chương này làm rõ tính bảo thủ của hệ gen ty thể san hô mềm và vai trò của gen msh1 như một chỉ thị phân loại loài tin cậy kết hợp cùng đoạn gen nhân 28S rARN. Đồng thời, chương 1 tổng hợp chi tiết 160 hợp chất đại diện từ các loài san hô mềm chi Sinularia trên thế giới (bảng 1.2), phân tích mối liên quan giữa cấu trúc hóa học (vòng $\gamma$-lactone, $\varepsilon$-lactone, nhóm chức hydroxyl, epoxy, peroxy) với hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc mẫu sinh học: Mẫu san hô mềm ký hiệu SN (S. nanolobata) thu tại Lăng Cô; các mẫu ký hiệu SLE (S. leptoclados) và SCO (S. conferta) thu tại đảo Cồn Cỏ. Tác giả thiết lập quy trình thực nghiệm chi tiết gồm:

• Thông số kỹ thuật phản ứng PCR: Thành phần phản ứng, chu kỳ nhiệt cho các cặp mồi 28SF/28SR và MSHF/MSHR.
• Quy trình dòng hóa đoạn gen vào vector tách dòng pTZ57R/T.
• Sơ đồ chiết tách và quy trình sắc ký phân lập các phân đoạn của ba mẫu san hô.
• Phương pháp luận giải phổ 1D và 2D NMR để giải cấu trúc hóa học.
• Điều kiện nuôi cấy tế bào, hóa chất thử nghiệm (FBS, DMEM, MTT, TCA, SRB, DMSO, Camptothecin đối chứng dương), quy trình nhuộm Annexin V/PI và đo chu kỳ tế bào trên máy Novocyte.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

• Giám định loài bằng sinh học phân tử: Giải thành công trình tự các đoạn gen 28S rARN và msh1 từ 3 mẫu san hô mềm; kết quả so sánh BLAST với dữ liệu chuẩn trên NCBI khẳng định tên khoa học của 3 loài là Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados và Sinularia conferta.
• Phân lập hóa học:
  • Từ loài S. nanolobata: Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ký hiệu SN, bao gồm các hợp chất mới SN 8, SN 6, SN 20 (Nanolobatol B), SN 30 (Nanolobatol A) và các hợp chất đã biết.
  • Từ loài S. leptoclados: Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ký hiệu SLE, gồm các hợp chất mới SLE 10 (Leptosteroid), SLE 21 (5,6$\beta$-epoxygorgosterol) và hợp chất SLE 27.
  • Từ loài S. conferta: Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ký hiệu SCO, gồm các hợp chất mới SCO 29 (7-methoxygorgosterol), SCO 30 (7$\alpha$-Methoxy-ergosta-5-ene-3$\beta$-ol), SCO 44 (3-hydroxyergosta-4-en-6-one), SCO 42 (ergost-24(28)-ene-3$\beta$,5$\alpha$,6$\beta$-triol-3-acetate), SCO 32 (3-hydroxyergosta-4,24(28)-dien-6-one) và hợp chất SCO 27.
• Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào: Thử nghiệm độc tính trên các dòng tế bào ung thư A549, MCF-7, Hep-G2, HL-60, DLD-1, SK-Mel-2...
• Kết quả nghiên cứu cơ chế:
  • Hợp chất SCO 27 gây thay đổi hình thái co cụm tế bào, kích thích sản sinh caspase 3 và làm tăng tỷ lệ tế bào apoptosis dòng A549 (nhuộm Annexin V/PI ở các nồng độ 5 $\mu\text{M}$ và 10 $\mu\text{M}$ sau 24 giờ so với đối chứng dương camptothecin 5 $\mu\text{M}$).
  • Hợp chất SLE 27 gây teo nhân, co màng tế bào ung thư vú MCF-7, kích nổ quá trình apoptosis (nhuộm Annexin V/PI ở 10, 30, 100 $\mu\text{M}$ sau 24 giờ) và làm biến đổi tỷ lệ phân bố chu kỳ tế bào MCF-7 (gia tăng quần thể tế bào ở pha sub-G1/apoptosis sau 48 giờ xử lý).

Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu

Chương 4 tập trung biện giải các dữ liệu thực nghiệm:

• Bàn luận dữ liệu phát sinh chủng loại: Cây quan hệ di truyền Neighbor-Joining trên phần mềm MEGA6 xây dựng từ trình tự msh1 và 28S rARN chứng minh các mẫu san hô nghiên cứu nằm cùng nhánh với các mẫu chuẩn tương ứng trên ngân hàng gen thế giới.
• Bàn luận xác định cấu trúc hóa học các hợp chất mới:
  • Loài S. nanolobata: Biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, tương tác HMBC, NOESY) và phổ khối HR-TOF-MS của hợp chất mới SN 8 ($3\beta,4\alpha\text{-dihydroxyergosta-}5,24(28)\text{-diene}$), SN 6 ($24(S),28\text{-epoxyergost-}5\text{-ene-}3\beta,4\alpha\text{-diol}$), SN 20 (Nanolobatol B) và SN 30 (Nanolobatol A).
  • Loài S. leptoclados: Phân tích cấu trúc của hợp chất mới SLE 10 (Leptosteroid), SLE 21 ($5,6\beta\text{-epoxygorgosterol}$) và hợp chất SLE 27 ($\text{Ergosta-}5,24(28)\text{-dien-}3\beta,7\beta\text{-diol}$).
  • Loài S. conferta: Phân tích cấu trúc các hợp chất mới SCO 29 ($7\text{-methoxygorgosterol}$), SCO 30 ($7\alpha\text{-Methoxy-ergosta-}5\text{-ene-}3\beta\text{-ol}$), SCO 44 ($3\text{-hydroxyergosta-}4\text{-en-}6\text{-one}$), SCO 42 ($\text{ergost-}24(28)\text{-ene-}3\beta,5\alpha,6\beta\text{-triol-}3\text{-acetate}$), SCO 32 ($3\text{-hydroxyergosta-}4,24(28)\text{-dien-}6\text{-one}$) và SCO 27 ($24\text{-methylenecholestane-}3\beta,5\alpha,6\beta\text{-triol-}6\text{-monoacetate}$).
• Bàn luận về hoạt tính gây độc tế bào và mối liên quan giữa cấu trúc - hoạt tính: Phân tích sự ảnh hưởng của khung steroid ergostane, gorgostane và vị trí nhóm thế hydroxy, methoxy, acetoxy đối với hiệu lực ức chế tế bào khối u.
• Biện luận cơ chế phân tử của SLE 27 và SCO 27: Làm rõ con đường gây chết tế bào thông qua hoạt hóa caspase 3 và bắt giữ chu kỳ tế bào ở pha sub-G1.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự nêu các đóng góp mới về mặt lý luận khoa học và thực tiễn:

1. Đóng góp về phân loại học phân tử: Định danh chính xác 3 loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados và Sinularia conferta thu thập tại vùng biển Trung Bộ Việt Nam bằng việc kết hợp trình tự gen nhân 28S rARN và gen ty thể msh1.
2. Đóng góp về hóa sinh học các hợp chất thiên nhiên: Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của nhiều hợp chất mới:
   • Từ S. nanolobata: 4 hợp chất mới gồm SN 8 ($3\beta,4\alpha\text{-dihydroxyergosta-}5,24(28)\text{-diene}$), SN 6 ($24(S),28\text{-epoxyergost-}5\text{-ene-}3\beta,4\alpha\text{-diol}$), SN 20 (Nanolobatol B) và SN 30 (Nanolobatol A).
   • Từ S. leptoclados: 2 hợp chất mới gồm SLE 10 (Leptosteroid) và SLE 21 ($5,6\beta\text{-epoxygorgosterol}$).
   • Từ S. conferta: 5 hợp chất mới gồm SCO 29 ($7\text{-methoxygorgosterol}$), SCO 30 ($7\alpha\text{-Methoxy-ergosta-}5\text{-ene-}3\beta\text{-ol}$), SCO 44 ($3\text{-hydroxyergosta-}4\text{-en-}6\text{-one}$), SCO 42 ($\text{ergost-}24(28)\text{-ene-}3\beta,5\alpha,6\beta\text{-triol-}3\text{-acetate}$) và SCO 32 ($3\text{-hydroxyergosta-}4,24(28)\text{-dien-}6\text{-one}$).
3. Đóng góp về hoạt tính sinh học và cơ chế tác động: Cung cấp dữ liệu sàng lọc độc tính tế bào in vitro của các dãy hợp chất trên nhiều dòng tế bào ung thư người; chứng minh hợp chất SCO 27 gây độc tế bào ung thư phổi A549 thông qua cảm ứng apoptosis phụ thuộc enzyme caspase 3; chứng minh hợp chất SLE 27 gây apoptosis và biến đổi chu kỳ tế bào trên dòng ung thư vú MCF-7.

Kiến nghị của luận án:

• Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động ở mức độ biểu hiện gen và protein (con đường ty thể, thụ thể màng, các protein họ Bcl-2, MAPK) đối với các hợp chất có hoạt tính cao.
• Tiến hành thử nghiệm hoạt tính trên mô hình động vật (in vivo) và đánh giá độc tính tiền lâm sàng nhằm định hướng ứng dụng làm chất dẫn đường phát triển dược phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế:

• Các thử nghiệm đánh giá hoạt tính và cơ chế gây độc tế bào mới chỉ được thực hiện trên mô hình nuôi cấy tế bào in vitro, chưa tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật sống (in vivo).
• Nghiên cứu cơ chế tác động chuyên sâu mới chỉ tập trung vào hai hợp chất đại diện là SLE 27 và SCO 27 trên hai dòng tế bào ung thư (MCF-7 và A549).
• Hàm lượng của một số hợp chất mới phân lập được còn rất nhỏ, hạn chế khả năng mở rộng thử nghiệm sinh học đa mục tiêu.

Về hướng nghiên cứu tiếp:

• Mở rộng nghiên cứu cơ chế phân tử chi tiết của các hợp chất mới phân lập khác đối với các dòng tế bào ung thư nhạy cảm.
• Nghiên cứu bán tổng hợp hoặc tổng hợp toàn phần các hợp chất tiềm năng nhằm cung cấp đủ khối lượng cho các thử nghiệm dược lý tiền lâm sàng.
• Khảo sát biến động thành phần hóa học theo mùa và vùng sinh thái biển đối với các loài san hô mềm chi Sinularia.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Hóa sinh học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học, Công nghệ sinh học và Sinh học biển.
• Các nhà nghiên cứu và giảng viên tại các trường đại học, viện nghiên cứu chuyên ngành: Cung cấp quy trình chiết tách, hệ thống số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR và phổ khối HR-TOF-MS của các khung cấu trúc steroid biển và terpenoid; tài liệu tham khảo về phương pháp kết hợp chỉ thị 28S rARN và msh1 trong phân loại học phân tử san hô mềm.
• Các chuyên gia nghiên cứu phát triển thuốc: Cung cấp dữ liệu về cấu trúc hóa học và cơ chế gây độc tế bào của các hợp chất dẫn đường có nguồn gốc từ tài nguyên biển Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Ba loài san hô mềm nghiên cứu trong luận án được thu thập tại những vùng biển nào của Việt Nam? Mẫu san hô mềm Sinularia nanolobata được thu thập tại vùng biển Lăng Cô (tỉnh Thừa Thiên Huế); hai loài Sinularia leptoclados và Sinularia conferta được thu thập tại vùng biển đảo Cồn Cỏ (tỉnh Quảng Trị).

2. Luận án đã sử dụng những đoạn gen chỉ thị nào để giám định tên khoa học của các mẫu san hô mềm? Luận án sử dụng đoạn gen nhân 28S rARN (khuếch đại bằng cặp mồi 28SF/28SR) và đoạn gen ty thể msh1 (khuếch đại bằng cặp mồi MSHF/MSHR), sau đó dòng hóa vào vector pTZ57R/T, giải trình tự và phân tích tương đồng qua công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI cùng cây phát sinh loài Neighbor-Joining trên phần mềm MEGA6.

3. Những hợp chất mới nào đã được phân lập và xác định cấu trúc từ ba loài san hô mềm trong công trình này? Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất mới:

• Từ S. nanolobata: SN 8 ($3\beta,4\alpha\text{-dihydroxyergosta-}5,24(28)\text{-diene}$), SN 6 ($24(S),28\text{-epoxyergost-}5\text{-ene-}3\beta,4\alpha\text{-diol}$), SN 20 (Nanolobatol B), SN 30 (Nanolobatol A).
• Từ S. leptoclados: SLE 10 (Leptosteroid), SLE 21 ($5,6\beta\text{-epoxygorgosterol}$).
• Từ S. conferta: SCO 29 ($7\text{-methoxygorgosterol}$), SCO 30 ($7\alpha\text{-Methoxy-ergosta-}5\text{-ene-}3\beta\text{-ol}$), SCO 44 ($3\text{-hydroxyergosta-}4\text{-en-}6\text{-one}$), SCO 42 ($\text{ergost-}24(28)\text{-ene-}3\beta,5\alpha,6\beta\text{-triol-}3\text{-acetate}$), SCO 32 ($3\text{-hydroxyergosta-}4,24(28)\text{-dien-}6\text{-one}$).

4. Cơ chế gây độc tế bào ung thư của hai hợp chất SCO 27 và SLE 27 được chứng minh như thế nào? Hợp chất SCO 27 làm biến đổi hình thái tế bào, kích thích sản sinh enzyme caspase 3 và kích hoạt quá trình tự chết theo chương trình (apoptosis) trên dòng tế bào ung thư phổi A549 qua phương pháp nhuộm Annexin V/PI ở nồng độ 5 $\mu\text{M}$ và 10 $\mu\text{M}$. Hợp chất SLE 27 gây apoptosis trên dòng ung thư vú MCF-7 (nhuộm Annexin V/PI ở 10, 30, 100 $\mu\text{M}$ sau 24 giờ) và làm gia tăng tỷ lệ tế bào ở pha sub-G1 trong phân tích chu kỳ tế bào sau 48 giờ xử lý trên hệ thống Flow cytometer Novocyte.

5. Phương pháp quang phổ nào đã được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trong luận án? Luận án sử dụng kết hợp phổ khối lượng phân giải cao HR-TOF-MS, phổ khối LC-MS, phổ hồng ngoại IR, phổ lưỡng sắc tròn CD, và hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, $^1\text{H-}^1\text{H}\ \text{COSY}$, HSQC, HMBC, NOESY).

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Ninh Thị Ngọc là công trình nghiên cứu thực nghiệm toàn diện về hóa sinh học trên ba loài san hô mềm Sinularia nanolobata, Sinularia leptoclados và Sinularia conferta tại vùng biển Trung Bộ Việt Nam. Tác giả đã kết hợp thành công phương pháp sinh học phân tử (chỉ thị gen 28S rARN và msh1) để định danh mẫu sinh học, phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất mới cùng nhiều hợp chất tự nhiên khác. Công trình đã làm sáng tỏ hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro và cơ chế gây apoptosis qua enzyme caspase 3 và chu kỳ tế bào của các hợp chất tiêu biểu SCO 27 và SLE 27. Kết quả này đóng góp dữ liệu khoa học quan trọng cho việc nghiên cứu thành phần hóa học và tiềm năng dược liệu sinh vật biển tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 1. Các dòng tế bào ung thư Lịch sử nghiên cứu ung thư và việc thành lập các dòng tế bào ung thưcó liên quan chặt chẽ với nhau [1]. Nhiều nhà nghiên cứu đã tìm hiểu các cơ chế phức tạp biến đổi từ một tế bào bình thường thành tế bào ung thư.

Năm 1951, những cải tiến trong việc xác định các yêu cầu sinh hóa đối với sự phát triển của các tế bào sinh lý và biến đổi đã cho phép Tiến sĩ George Otto Gey tại Bệnh viện Johns Hopkins thành lập dòng tế bào ung thư đầu tiên và nổi tiếng từ người, được đặt tên là HeLa [2]. Tên “HeLa” là từ viết tắt của Henrietta Lacks, một phụ nữ trẻ da đen bị ảnh hưởng bởi ung thư biểu mô cổ tử cung, từ đó tế bào HeLa được tạo ra. Sự ra đời của dòng tế bào HeLa có thể coi là một cột mốc quan trọng khác trong lịch sử sinh học tế bào, đồng thời nó đã mở ra những hướng mới trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư. Bắt đầu từ sự ổn định của chúng, các tế bào HeLa đã tạo thành ví dụ đầu tiên về “bệnh ung thư ở người trong ống nghiệm”.

Dòng tế bào HeLa rất ổn định và tăng sinh mạnh – điều này dẫn đến việc chúng dễ nhiễm chéo vào nhiều dòng tế bào khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu. Sự tăng sinh ổn định của dòng tế bào HeLa và đặc tính dễ bị nhiễm virus bại liệt nên đến năm 1954, Jonas Salk đã phát triển một loại vacxin phòng bệnh bại liệt bằng việc sử dụng các tế bào HeLa. Ngày nay, các dòng tế bào ung thư đã được sử dụng rộng rãi cho các mục đích nghiên cứu và được chứng minh là một công cụ hữu ích để tìm hiểu về mặt di truyền của các bệnh ung thư, thực tế cho thấy chúng là một mô hình tuyệt vời cho việc nghiên cứu các cơ chế sinh học gây ra căn bệnh này [3]. Nghiên cứu ứng dụng các dòng tế bào ung thư đã cho phép tìm hiểu thông tin về sự tăng hoặc giảm sự biểu hiện của các gen liên quan và các con đường truyền tín hiệu trong tế bào ung thư [4].

Hơn nữa, việc sử dụng mô hình tế bào là cơ sở cho sự phát triển và thử nghiệm các loại thuốc chống ung thư hiện đang được sử dụng [5, 6] và cũng là một phương pháp thay thế cho cấy ghép khối u động vật trong thử nghiệm hóa trị liệu [7]. Trên thực tế, việc sử dụng mô hình tế bào in vitro trong nghiên cứu ung thư là rất quan trọng để điều tra các con đường di truyền, di truyền ngoài gen (epigenetics), sự tăng sinh, quá trình tự chết (apoptosis) và sự tiến triển của ung thư, luan an 4 từ đó giúp xác định được các chỉ thị phân tử tiềm năng [4, 8] và sàng lọc, tối ưu hóa các phương pháp điều trị ung thư [6, 9]. Các kết quả nghiên cứu trong các dòng tế bào ung thư thường được ngoại suy cho các khối u in vivo [8] và tầm quan trọng của nó như là các mô hình thử nghiệm thuốc và nghiên cứu dịch mã đã được nhiều công ty y sinh và dược phẩm công nhận [5]. Các dòng tế bào ung thư khác nhau thể hiện các phản ứng đa dạng với các loại thuốc chống ung thư gây độc tế bào, ví dụ như các dòng tế bào ung thư ruột kết có khả năng kháng lại các loại thuốc liên kết với ADN trong khi các dòng tế bào ung thư vú hoặc bệnh bạch cầu thì lại nhạy hơn [10].

Việc sử dụng bảng dòng tế bào (cell line panel) là một công cụ hữu ích để thử nghiệm thuốc chống ung thư. Sự phát triển các bảng dòng tế bào ung thư này được khởi xướng cho nhóm NCI60 (Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ với 60 dòng tế bào ung thư) nhằm khắc phục việc sử dụng các mô hình động vật để thử nghiệm thuốc chống ung thư [7]. Sau đó, Nakatsu và cộng sự (2005) đã thành lập một nhóm nghiên cứu gồm 45 dòng tế bào ung thư (JFCR-45) từ các bộ phận khác nhau (vú, gan và dạ dày) để xác định các gen liên quan. Họ cũng cố gắng tìm hiểu cơ chế hoạt động của các loại thuốc này để phân loại.

Nghiên cứu này liên quan đến phương pháp tiếp cận thông tin sinh học tích hợp sử dụng các mảng cADN, đã tiết lộ nhiều gen ứng cử viên liên quan đến độ nhạy đối với các loại thuốc hóa trị liệu [6]. Gần đây, Garnett và các đồng nghiệp (2012) đã sàng lọc một bảng gồm hàng trăm dòng tế bào ung thư (đại diện cho phần lớn sự đa dạng về loại mô và di truyền của bệnh ung thư ở người) với 130 loại thuốc đang được nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng và xác minh rằng các gen ung thư bị đột biến có liên quan đến phản ứng của tế bào với các loại thuốc được sử dụng phổ biến nhất. Kết quả này như một hồ sơ sinh dược học về các dòng tế bào ung thư giúp định hướng các chiến lược điều trị ung thư hợp lý hơn [11]. Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống ung thư Thử nghiệm sinh học (bioassay) là những thử nghiệm được thiết kế để phân tích tác động sinh học của một hợp chất bằng cách sử dụng các hệ thống sinh học phù hợp như tế bào, mô, vi khuẩn, động vật, thực vật.

Thử nghiệm sinh học được định nghĩa là một sự tính toán để xác định nồng độ hay đánh giá hiệu lực của một luan an 5 tác nhân vật lý, hóa học hay sinh học bằng việc đo lường, kiểm chứng mức độ phản ứng của thí nghiệm trên hệ sinh học phù hợp dưới điều kiện tiêu chuẩn khi so sánh với một chất chuẩn. Thử nghiệm sinh học theo nghĩa rộng là quy trình để xác định mối quan hệ giữa một tác nhân với ảnh hưởng mà tác nhân này tạo ra trên cơ thể sống Thử nghiệm sinh học có vai trò quan trọng trong những chương trình kiểm soát việc phát triển và sản xuất các dược phẩm sinh học chất lượng một cách hiệu quả. Thử nghiệm sinh học có thể chia thành nhiều loại và các mức độ khác nhau dựa trên đối tượng sinh học được sử dụng như các chủng vi sinh vật, tế bào nuôi cấy, các loại mô có nguồn gốc từ con người và động vật, thậm chí trên toàn bộ cơ thể động vật [12]. Tuy nhiên, dựa vào đặc điểm kỹ thuật sử dụng có thể chia thành 4 nhóm lớn như sau: Các phép thử in vitro, các phép thử in vivo, các phép thử ex vivo và các phép thử xenograph Các phép thử sinh học in vitro có vai trò quan trọng trong việc định hướng phân tách các thành phần có hoạt tính từ nhiều nguồn tự nhiên khác nhau.

Vì vậy, phát triển hệ thống sàng lọc in vitro các dịch chiết hay hợp chất sạch nhằm phát hiện ra các loại thuốc mới hoặc các chất dẫn đường là một chiến lược quan trọng trong tiến trình tìm kiếm nguồn dược phẩm mới. Các phép thử sinh học được lựa chọn dựa vào bản chất và hoạt tính sinh học cần đánh giá của hợp chất thử. Các phép thử sinh học in vitro được chia thành 2 loại: phép thử dựa trên mô hình nuôi cấy tế bào (cell-based assays) và phép thử dựa vào cơ chế (mechanism-based assays) [13]. Phép thử dựa trên mô hình nuôi cấy tế bào (cell-based assays) Mô hình nuôi cấy tế bào là thuật ngữ được dùng để nói đến những thử nghiệm dựa trên việc sử dụng tế bào sống, bao gồm những phép thử đánh giá ảnh hưởng của chất hay nhóm chất nghiên cứu đến sinh lý của tế bào bao gồm những thay đổi về hình thái và sự phát triển của chúng.

Thử nghiệm dựa trên tế bào miêu tả khá chính xác mô hình của sự sống bởi tế bào được xem là đơn vị sống nhỏ nhất nhưng hoàn chỉnh nhất của thế giới sinh vật. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro, thuật ngữ “gây độc tế bào” (cytotoxicity) dùng để chỉ khả năng làm thay đổi hình thái, tốc độ sinh trưởng hoặc làm chết tế bào của hợp chất thử hoặc tác nhân thử [14]. Các phép thử gây độc tế bào là phương pháp hữu hiệu nhất trong việc sàng luan an 6 lọc phát hiện những phân tử thuốc mới phân lập từ nguồn tự nhiên cũng như thuốc tổng hợp. Với sự thành công vượt bậc trong việc phân lập và nuôi cấy in vitro thường qui các dòng tế bào khác nhau, hàng loạt các thử nghiệm sinh học dựa trên mô hình tế bào đã được thiết lập.

Những phép thử này thường liên quan đến tương tác giữa tế bào và thuốc, dùng để đo độ độc tế bào, đánh giá khả năng giết chết hay kìm hãm sự phát triển của tế bào nuôi cấy. Với hướng nghiên cứu này, mỗi phân đoạn tách chiết chứa các hợp chất hóa học đều được thử nghiệm sơ bộ về hoạt tính và chỉ những phân đoạn nào thể hiện hoạt tính sinh học mới được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn. Chu trình phân tách và thử nghiệm được lặp lại cho đến khi chất sạch có hoạt tính mong muốn được phân lập. Hạn chế của loại thử nghiệm này là sự tương quan giữa hoạt tính gây độc tế bào trong mô hình thử nghiệm in vitro với in vivo.

Phép thử dựa vào cơ chế tác động (mechanism-based assays) Phép thử dựa vào cơ chế liên quan đến việc đánh giá những hoạt tính cụ thể của thuốc theo hướng tác động cụ thể của một enzym, ADN hay thụ thể (receptor) đặc trưng. Đây là phương pháp hữu hiệu cho nghiên cứu phát hiện thuốc, dùng để tìm kiếm các tác nhân chống u tiềm năng với cơ chế đặc trưng theo cách thức chọn lọc. Ưu điểm chính của phép thử này khi một hợp chất có hoạt tính được thử nghiệm thì cơ chế hoạt động của nó sẽ được giải thích rõ ràng. Enzym đóng vai trò quan trọng trong chu kì tế bào và được coi là đích tương tác hấp dẫn của các phân tử thuốc.

Rất nhiều các công trình nghiên cứu cho thấy họ enzym caspase đóng vai trò trung tâm trong việc truyền tín hiệu apoptosis xảy ra trong các sinh vật đa bào. Các caspase thuộc nhóm enzym protease. Trong tế bào sống, các enzym caspase được giữ ở dạng không hoạt động bởi các protein trên bề mặt tế bào. Khi một tế bào tiếp xúc với các tác nhân như hóa trị liệu, bức xạ hoặc các tín hiệu gây chết thì chức năng của các protein này bị khóa và kích hoạt caspase khởi phát quá trình tự chết.