CHƯƠNG 1. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 1. Các dòng tế bào ung thư Lịch sử nghiên cứu ung thư và việc thành lập các dòng tế bào ung thưcó liên quan chặt chẽ với nhau [1]. Nhiều nhà nghiên cứu đã tìm hiểu các cơ chế phức tạp biến đổi từ một tế bào bình thường thành tế bào ung thư.
Năm 1951, những cải tiến trong việc xác định các yêu cầu sinh hóa đối với sự phát triển của các tế bào sinh lý và biến đổi đã cho phép Tiến sĩ George Otto Gey tại Bệnh viện Johns Hopkins thành lập dòng tế bào ung thư đầu tiên và nổi tiếng từ người, được đặt tên là HeLa [2]. Tên “HeLa” là từ viết tắt của Henrietta Lacks, một phụ nữ trẻ da đen bị ảnh hưởng bởi ung thư biểu mô cổ tử cung, từ đó tế bào HeLa được tạo ra. Sự ra đời của dòng tế bào HeLa có thể coi là một cột mốc quan trọng khác trong lịch sử sinh học tế bào, đồng thời nó đã mở ra những hướng mới trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư. Bắt đầu từ sự ổn định của chúng, các tế bào HeLa đã tạo thành ví dụ đầu tiên về “bệnh ung thư ở người trong ống nghiệm”.
Dòng tế bào HeLa rất ổn định và tăng sinh mạnh – điều này dẫn đến việc chúng dễ nhiễm chéo vào nhiều dòng tế bào khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu. Sự tăng sinh ổn định của dòng tế bào HeLa và đặc tính dễ bị nhiễm virus bại liệt nên đến năm 1954, Jonas Salk đã phát triển một loại vacxin phòng bệnh bại liệt bằng việc sử dụng các tế bào HeLa. Ngày nay, các dòng tế bào ung thư đã được sử dụng rộng rãi cho các mục đích nghiên cứu và được chứng minh là một công cụ hữu ích để tìm hiểu về mặt di truyền của các bệnh ung thư, thực tế cho thấy chúng là một mô hình tuyệt vời cho việc nghiên cứu các cơ chế sinh học gây ra căn bệnh này [3]. Nghiên cứu ứng dụng các dòng tế bào ung thư đã cho phép tìm hiểu thông tin về sự tăng hoặc giảm sự biểu hiện của các gen liên quan và các con đường truyền tín hiệu trong tế bào ung thư [4].
Hơn nữa, việc sử dụng mô hình tế bào là cơ sở cho sự phát triển và thử nghiệm các loại thuốc chống ung thư hiện đang được sử dụng [5, 6] và cũng là một phương pháp thay thế cho cấy ghép khối u động vật trong thử nghiệm hóa trị liệu [7]. Trên thực tế, việc sử dụng mô hình tế bào in vitro trong nghiên cứu ung thư là rất quan trọng để điều tra các con đường di truyền, di truyền ngoài gen (epigenetics), sự tăng sinh, quá trình tự chết (apoptosis) và sự tiến triển của ung thư, luan an 4 từ đó giúp xác định được các chỉ thị phân tử tiềm năng [4, 8] và sàng lọc, tối ưu hóa các phương pháp điều trị ung thư [6, 9]. Các kết quả nghiên cứu trong các dòng tế bào ung thư thường được ngoại suy cho các khối u in vivo [8] và tầm quan trọng của nó như là các mô hình thử nghiệm thuốc và nghiên cứu dịch mã đã được nhiều công ty y sinh và dược phẩm công nhận [5]. Các dòng tế bào ung thư khác nhau thể hiện các phản ứng đa dạng với các loại thuốc chống ung thư gây độc tế bào, ví dụ như các dòng tế bào ung thư ruột kết có khả năng kháng lại các loại thuốc liên kết với ADN trong khi các dòng tế bào ung thư vú hoặc bệnh bạch cầu thì lại nhạy hơn [10].
Việc sử dụng bảng dòng tế bào (cell line panel) là một công cụ hữu ích để thử nghiệm thuốc chống ung thư. Sự phát triển các bảng dòng tế bào ung thư này được khởi xướng cho nhóm NCI60 (Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ với 60 dòng tế bào ung thư) nhằm khắc phục việc sử dụng các mô hình động vật để thử nghiệm thuốc chống ung thư [7]. Sau đó, Nakatsu và cộng sự (2005) đã thành lập một nhóm nghiên cứu gồm 45 dòng tế bào ung thư (JFCR-45) từ các bộ phận khác nhau (vú, gan và dạ dày) để xác định các gen liên quan. Họ cũng cố gắng tìm hiểu cơ chế hoạt động của các loại thuốc này để phân loại.
Nghiên cứu này liên quan đến phương pháp tiếp cận thông tin sinh học tích hợp sử dụng các mảng cADN, đã tiết lộ nhiều gen ứng cử viên liên quan đến độ nhạy đối với các loại thuốc hóa trị liệu [6]. Gần đây, Garnett và các đồng nghiệp (2012) đã sàng lọc một bảng gồm hàng trăm dòng tế bào ung thư (đại diện cho phần lớn sự đa dạng về loại mô và di truyền của bệnh ung thư ở người) với 130 loại thuốc đang được nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng và xác minh rằng các gen ung thư bị đột biến có liên quan đến phản ứng của tế bào với các loại thuốc được sử dụng phổ biến nhất. Kết quả này như một hồ sơ sinh dược học về các dòng tế bào ung thư giúp định hướng các chiến lược điều trị ung thư hợp lý hơn [11]. Vai trò của các thử nghiệm sinh học trong tìm kiếm các hoạt chất chống ung thư Thử nghiệm sinh học (bioassay) là những thử nghiệm được thiết kế để phân tích tác động sinh học của một hợp chất bằng cách sử dụng các hệ thống sinh học phù hợp như tế bào, mô, vi khuẩn, động vật, thực vật.
Thử nghiệm sinh học được định nghĩa là một sự tính toán để xác định nồng độ hay đánh giá hiệu lực của một luan an 5 tác nhân vật lý, hóa học hay sinh học bằng việc đo lường, kiểm chứng mức độ phản ứng của thí nghiệm trên hệ sinh học phù hợp dưới điều kiện tiêu chuẩn khi so sánh với một chất chuẩn. Thử nghiệm sinh học theo nghĩa rộng là quy trình để xác định mối quan hệ giữa một tác nhân với ảnh hưởng mà tác nhân này tạo ra trên cơ thể sống Thử nghiệm sinh học có vai trò quan trọng trong những chương trình kiểm soát việc phát triển và sản xuất các dược phẩm sinh học chất lượng một cách hiệu quả. Thử nghiệm sinh học có thể chia thành nhiều loại và các mức độ khác nhau dựa trên đối tượng sinh học được sử dụng như các chủng vi sinh vật, tế bào nuôi cấy, các loại mô có nguồn gốc từ con người và động vật, thậm chí trên toàn bộ cơ thể động vật [12]. Tuy nhiên, dựa vào đặc điểm kỹ thuật sử dụng có thể chia thành 4 nhóm lớn như sau: Các phép thử in vitro, các phép thử in vivo, các phép thử ex vivo và các phép thử xenograph Các phép thử sinh học in vitro có vai trò quan trọng trong việc định hướng phân tách các thành phần có hoạt tính từ nhiều nguồn tự nhiên khác nhau.
Vì vậy, phát triển hệ thống sàng lọc in vitro các dịch chiết hay hợp chất sạch nhằm phát hiện ra các loại thuốc mới hoặc các chất dẫn đường là một chiến lược quan trọng trong tiến trình tìm kiếm nguồn dược phẩm mới. Các phép thử sinh học được lựa chọn dựa vào bản chất và hoạt tính sinh học cần đánh giá của hợp chất thử. Các phép thử sinh học in vitro được chia thành 2 loại: phép thử dựa trên mô hình nuôi cấy tế bào (cell-based assays) và phép thử dựa vào cơ chế (mechanism-based assays) [13]. Phép thử dựa trên mô hình nuôi cấy tế bào (cell-based assays) Mô hình nuôi cấy tế bào là thuật ngữ được dùng để nói đến những thử nghiệm dựa trên việc sử dụng tế bào sống, bao gồm những phép thử đánh giá ảnh hưởng của chất hay nhóm chất nghiên cứu đến sinh lý của tế bào bao gồm những thay đổi về hình thái và sự phát triển của chúng.
Thử nghiệm dựa trên tế bào miêu tả khá chính xác mô hình của sự sống bởi tế bào được xem là đơn vị sống nhỏ nhất nhưng hoàn chỉnh nhất của thế giới sinh vật. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro, thuật ngữ “gây độc tế bào” (cytotoxicity) dùng để chỉ khả năng làm thay đổi hình thái, tốc độ sinh trưởng hoặc làm chết tế bào của hợp chất thử hoặc tác nhân thử [14]. Các phép thử gây độc tế bào là phương pháp hữu hiệu nhất trong việc sàng luan an 6 lọc phát hiện những phân tử thuốc mới phân lập từ nguồn tự nhiên cũng như thuốc tổng hợp. Với sự thành công vượt bậc trong việc phân lập và nuôi cấy in vitro thường qui các dòng tế bào khác nhau, hàng loạt các thử nghiệm sinh học dựa trên mô hình tế bào đã được thiết lập.
Những phép thử này thường liên quan đến tương tác giữa tế bào và thuốc, dùng để đo độ độc tế bào, đánh giá khả năng giết chết hay kìm hãm sự phát triển của tế bào nuôi cấy. Với hướng nghiên cứu này, mỗi phân đoạn tách chiết chứa các hợp chất hóa học đều được thử nghiệm sơ bộ về hoạt tính và chỉ những phân đoạn nào thể hiện hoạt tính sinh học mới được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn. Chu trình phân tách và thử nghiệm được lặp lại cho đến khi chất sạch có hoạt tính mong muốn được phân lập. Hạn chế của loại thử nghiệm này là sự tương quan giữa hoạt tính gây độc tế bào trong mô hình thử nghiệm in vitro với in vivo.
Phép thử dựa vào cơ chế tác động (mechanism-based assays) Phép thử dựa vào cơ chế liên quan đến việc đánh giá những hoạt tính cụ thể của thuốc theo hướng tác động cụ thể của một enzym, ADN hay thụ thể (receptor) đặc trưng. Đây là phương pháp hữu hiệu cho nghiên cứu phát hiện thuốc, dùng để tìm kiếm các tác nhân chống u tiềm năng với cơ chế đặc trưng theo cách thức chọn lọc. Ưu điểm chính của phép thử này khi một hợp chất có hoạt tính được thử nghiệm thì cơ chế hoạt động của nó sẽ được giải thích rõ ràng. Enzym đóng vai trò quan trọng trong chu kì tế bào và được coi là đích tương tác hấp dẫn của các phân tử thuốc.
Rất nhiều các công trình nghiên cứu cho thấy họ enzym caspase đóng vai trò trung tâm trong việc truyền tín hiệu apoptosis xảy ra trong các sinh vật đa bào. Các caspase thuộc nhóm enzym protease. Trong tế bào sống, các enzym caspase được giữ ở dạng không hoạt động bởi các protein trên bề mặt tế bào. Khi một tế bào tiếp xúc với các tác nhân như hóa trị liệu, bức xạ hoặc các tín hiệu gây chết thì chức năng của các protein này bị khóa và kích hoạt caspase khởi phát quá trình tự chết.