Tổng quan luận án

Cùng với sự gia tăng các nguy cơ bệnh tật trong đời sống xã hội, xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên chiết xuất từ thực vật, ngày càng nhận được sự quan tâm của giới khoa học. Cây đu đủ (Carica papaya L.) thuộc họ Đu đủ (Caricaceae), là loại cây ăn quả nhiệt đới được trồng phổ biến tại các vùng đồng bằng và đất phù sa ở Việt Nam. Y văn và y học dân gian ghi nhận nhiều bộ phận của cây đu đủ có giá trị dược dụng: quả chứa các enzyme tiêu hóa như papain, pepsin, lipase; hạt có hoạt tính kháng khuẩn, trị ký sinh trùng đường ruột; rễ được dùng hỗ trợ điều trị sỏi thận, khó tiêu; lá được dùng sát khuẩn, kháng viêm, giảm đau và chống oxy hóa.

Tại Việt Nam, đặc biệt là khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng, hoa của cây đu đủ đực được người dân sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị ho, viêm họng, mất tiếng, khàn tiếng, sỏi thận, hỗ trợ kích thích tiêu hóa và hỗ trợ điều trị một số bệnh ung thư (ung thư phổi, ung thư vú, ung thư gan). Mặc dù các bộ phận của cây đu đủ cái (lá, quả, hạt) đã có nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước, các bộ phận của cây đu đủ đực – đặc biệt là hoa đu đủ đực – vẫn còn rất ít tài liệu khoa học khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý. Việc sử dụng hoa đu đủ đực trong cộng đồng chủ yếu mang tính kinh nghiệm truyền miệng, thiếu các dẫn chứng thực nghiệm về cấu trúc hoạt chất cụ thể. Song song đó, tình trạng rối loạn sắc tố da như nám da, tàn nhang do tác động của bức xạ cực tím thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có khả năng ức chế enzyme tyrosinase (enzyme then chốt tổng hợp sắc tố melanin) an toàn, thay thế cho các hóa chất có độc tính hoặc kém bền vững. Từ những khoảng trống nghiên cứu và nhu cầu thực tiễn đó, đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực (Carica papaya L.)" được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm hai nội dung chính:

  1. Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học của hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.);
  2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hoạt chất làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo, tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm:

  1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của các cao chiết từ hoa và lá cây đu đủ đực;
  2. Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ hoa và lá cây đu đủ đực;
  3. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư in vitro của các hợp chất phân lập được;
  4. Đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao methanol và các hợp chất phân lập được.

Đối tượng nghiên cứu của luận án:

  • Mẫu hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.);
  • Các cao chiết phân đoạn: n-hexane, chloroform, dichloromethane và ethyl acetate;
  • Các hợp chất hóa học phân lập được từ hoa và lá cây đu đủ đực.

Phạm vi nghiên cứu:

  • Phạm vi không gian và thời gian thu mẫu: Hoa và lá cây đu đủ đực được thu hái tại khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng vào tháng 12 năm 2016. Tên khoa học của mẫu thực vật được giám định bởi TS. Ngô Văn Trại, Viện Dược liệu; mẫu tiêu bản thực vật mang ký hiệu DD001 được lưu giữ tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;
  • Phạm vi thực nghiệm: Quá trình chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm;
  • Phạm vi hoạt tính sinh học: Khảo sát in vitro hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư người (ung thư phổi A549, ung thư vú MCF-7, ung thư gan Hep3B) và khảo sát in vitro hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan toàn diện các công trình nghiên cứu về thực vật học, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ (Carica papaya L.) ở cả phạm vi trong nước và quốc tế.

Về thành phần hóa học tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây đã phân lập và xác định một số chất:

  • Nguyễn Tường Vân và cộng sự (1983) chiết xuất alkaloid carpaine từ lá đu đủ;
  • Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự (2007) dùng HPLC phân tích các carotenoid trong lá đu đủ, xác định β-carotene chiếm 57,050% và luteine chiếm 11,864%;
  • Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp (2012) phân lập 4 hợp chất từ phân đoạn n-hexane lá đu đủ: β-sitosterol, daucosterol, cycloart-23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24(R/S)-diol;
  • Nguyễn Văn Rư và Vũ Quang Thái (2012) tách chiết enzyme chymopapain từ mủ quả đu đủ xanh;
  • Hồ Thị Hà (2014) khảo sát dịch chiết methanol lá đu đủ, thu nhận danielone, carpainone, acid pluchoic, apocynol A, carpaine và pseudocarpaine từ phân đoạn CH2Cl2;
  • Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên (2015) khảo sát định tính sơ bộ hoa đu đủ đực tại Đà Nẵng, ghi nhận sự hiện diện của alkaloid, ester, acid béo và sterol;
  • Trần Thanh Hải (2016) phân lập kaempferol và kaempferol-3-O-β-glucopyranosid từ phân đoạn ethyl acetate của hoa cây đu đủ đực tại Quảng Nam;
  • Lê Thị Thanh Phương (2017) phân lập kaempferol và β-sitosterol glucoside từ phân đoạn chloroform hoa đu đủ đực;
  • Đỗ Thị Hoa Viên và Trần Văn Lộc (2017) định lượng carpaine chiếm 63% tổng hàm lượng alkaloid lá đu đủ;
  • Võ Thị Ngà và cộng sự (2020) phân lập 6 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetate hoa và cuống lá đu đủ đực tại Bình Định: stigmast-4-ene-3-one, β-sitosterol 3-O-β-glucopyranosid, 3-O-(6-O-tetradecanoyl-β-D-glucopyranosyl)-β-sitosterol, benzyl-β-D-glucoside, uracil và acid palmitic.

Trên thế giới, các tác giả đã công bố cấu trúc của nhiều hợp chất thuộc các nhóm glucosinolate, alkaloid, flavonoid, acid hữu cơ và sterol từ cây đu đủ:

  • Govindachari T. (1965) xác định cấu trúc carpaine và pseudocarpaine;
  • Chung-Shih Tang (1979) phân lập hai alkaloid piperideine là dehydrocarpaine I và dehydrocarpaine II từ lá;
  • Antonella Canini và cộng sự (2007) phân lập các hợp chất phenolic từ lá đu đủ gồm acid caffeic, acid p-coumaric, acid protocatechuic, kaempferol, quercetin và 5,7-dimethoxycoumarin;
  • Adlin Afzan và cộng sự (2012) xác định 12 hợp chất trong lá gồm carpaine, acid malic, acid quinic, caffeoyl malate, các đồng phân p-coumaroyl malate, feruloyl malate cùng các flavonol glycoside như manghaslin, clitorin, rutin, nicotiflorin;
  • Sunday Ahamefula Ezekwe và cộng sự (2017) dùng GC-MS xác định acid octadecanoic, hexadecenoic và hexadecanoic trong quả xanh;
  • Agung Nugroho và cộng sự (2017) phân lập, định lượng 7 flavonoid trong lá đu đủ, chỉ ra kaempferol-3-(2G-rhamnosylrutinoside) chiếm hàm lượng cao nhất.
Nhóm hợp chất Bộ phận cây Các chất tiêu biểu đã được công bố trong y văn
Glucosinolate Quả, hạt Benzyl isothiocyanate, benzyl glucosinolate, glucotropacolin
Phenolic & Flavonoid Quả, lá, hoa Quercetin, rutin, kaempferol, kaempferol-3-O-β-glucopyranosid, acid caffeic, acid ferulic, acid gallic, manghaslin, clitorin
Carotenoid Quả, lá β-Carotene, luteine, α-carotene, 9-cis β-carotene, lycopene, α-cryptoxanthin, β-cryptoxanthin
Alkaloid Lá, quả, hạt Carpaine, pseudocarpaine, carpainone, dehydrocarpaine I và II, choline
Sterol & Triterpene Quả, lá, hạt, hoa β-Sitosterol, daucosterol, stigmasterol, sterculin A, stigmast-4-ene-3-one
Glycoside Quả, thân, lá, hoa Prunasin, sambunigrin, benzyl-β-D-glucoside, 2-phenylethyl-β-D-glucoside
Acid hữu cơ Quả, lá, hoa Acid malic, acid citric, acid quinic, acid palmitic, acid stearic, acid oleic

Về hoạt tính sinh học, y văn ghi nhận:

  • Tác dụng trị giun sán: Satrija và cộng sự (1994) chứng minh nhựa đu đủ diệt 80-100% sán lợn Ascaris suum ở liều 4-8 g/kg; Kermanshai và cộng sự (2001) chỉ ra benzyl isothiocyanate trong hạt đu đủ là hoạt chất chính diệt giun sán;
  • Tác dụng hạ huyết áp: Eno và cộng sự (2000) chứng minh dịch chiết ethanol quả xanh (20 mg/kg, IV) làm hạ huyết áp trên chuột cống trắng;
  • Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm: Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình (1999) thử nghiệm flavonoid lá đu đủ kháng 5 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm; Đỗ Huy Bích và Đặng Quang Chung (2006) ghi nhận cao lá kháng S. aureus, T. mentagrophytes; Moses Alo và cộng sự (2012) chứng minh dịch chiết lá ức chế Salmonella typhi; Hồ Thị Hà (2014) xác định pseudocarpaine kháng S. aureus với IC50 = 80 µg/mL;
  • Tác dụng gây độc tế bào ung thư: Phạm Kim Mãn và cộng sự (2001) chứng minh cao cồn lá đu đủ ức chế u báng Sarcoma TG-180 trên chuột nhắt; Đỗ Thị Thảo (2006) ghi nhận cắn chiết methanol lá đu đủ ức chế dòng LU-1 với IC50 = 19,2 µg/mL; Rumiyati và cộng sự (2006) phân lập protein bất hoạt ribosome (RIPs) từ lá gây độc tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 µg/mL (làm tăng biểu hiện p53 lên 59,4% và giảm Bcl-2 xuống 63%); Otsuki và cộng sự (2010) ghi nhận dịch chiết nước lá đu đủ làm tăng các cytokine Th1 (IL-12p40, IL-12p70, INF-γ, TNF-α); Hồ Thị Hà (2014) xác định carpaine và pseudocarpaine từ lá có IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/mL trên các dòng KB, HL-60, LU-1, MCF-7; Marline Nainggolan và Kasmirul (2015) ghi nhận dịch chiết ethanol hoa đu đủ đực gây độc tế bào MCF-7;
  • Tác dụng chống oxy hóa: Ayoola và cộng sự (2008) xác định dịch chiết ethanol lá có IC50 bắt gốc tự do DPPH là 0,58 mg/mL; Maisarah và cộng sự (2013) ghi nhận hoạt tính giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt; Yunahara Fariada và Iswahyuni (2018) ghi nhận IC50 DPPH của dịch chiết lá là 100,0±0,07 ppm;
  • Tác dụng khác: Kháng viêm (Bamidele và cộng sự, 2008), hỗ trợ điều trị sốt xuất huyết (Nisar và cộng sự, 2011), rút ngắn thời gian đông máu và tăng tiểu cầu (Swati Patil và cộng sự, 2013).

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Mặc dù dữ liệu về cây đu đủ cái (lá, quả, hạt) rất phong phú, các nghiên cứu về bộ phận hoa và lá cây đu đủ đực còn rất hạn chế, đặc biệt mới dừng lại ở khảo sát dịch chiết thô hoặc phân lập vài hợp chất đơn lẻ. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất hóa học tinh khiết phân lập từ hoa và lá đu đủ đực trên các dòng tế bào người chưa được nghiên cứu hệ thống. Đặc biệt, chưa từng có công bố nào về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của hoa đu đủ đực cũng như các hợp chất phân lập từ bộ phận này. Do đó, luận án tập trung giải quyết việc phân lập có hệ thống các hợp chất từ hoa và lá đu đủ đực, xác định cấu trúc hóa học, đồng thời thử nghiệm sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư và ức chế enzyme tyrosinase in vitro.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên và hóa sinh học:

  • Khung phân tích hóa học: Các nguyên lý tách chiết hợp chất tự nhiên dựa vào độ phân cực dung môi, phân tách sắc ký (pha thường, pha đảo, rây phân tử) và biện giải cấu trúc hóa học bằng các thông số vật lý (điểm nóng chảy), phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS) cùng hệ phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY);
  • Lý thuyết về enzyme tyrosinase: Tyrosinase (EC 1.14.18.1) là enzyme chứa đồng, đóng vai trò xúc tác quá trình oxy hóa L-tyrosine thành 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) và từ DOPA thành DOPA quinone – hai phản ứng khởi đầu then chốt trong chuỗi sinh tổng hợp melanin. Bên cạnh tyrosinase, quá trình này còn có sự tham gia của TRP-1 và TRP-2. Sự tích lũy quá mức melanin dẫn đến các biểu hiện bệnh lý về da như nám da, tàn nhang, tăng sắc tố sau viêm. Ức chế enzyme tyrosinase là cơ chế định hướng nhằm ngăn ngừa và kiểm soát quá trình tạo sắc tố;
  • Lý thuyết về thử nghiệm độc tính tế bào ung thư: Sử dụng các mô hình sàng lọc in vitro dựa trên phản ứng chuyển hóa enzym ty thể (phép thử MTT) hoặc đo hàm lượng protein tổng số của tế bào sống (phép thử Sulforhodamine B - SRB) để đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư.

Phương pháp thực nghiệm chiết xuất và phân lập:

  • Kỹ thuật chiết rắn - lỏng: Áp dụng phương pháp ngâm dầm kết hợp năng lượng sóng siêu âm tại nhiệt độ 50°C trong 30 phút với dung môi methanol, lặp lại nhiều lần để chiết kiệt hoạt chất từ bột hoa và bột lá khô;
  • Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng: Hòa tan cao methanol tổng trong nước cất, sau đó chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, chloroform, dichloromethane và ethyl acetate;
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60 F254 và RP-18 F254s (Merck). Phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc phun thuốc thử dung dịch H2SO4 10% rồi hơ nóng;
  • Sắc ký lớp mỏng điều chế: Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck), cạo vùng hấp phụ chứa chất, giải hấp và kết tinh lại;
  • Sắc ký cột (CC): Sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường (kích thước hạt 40-63 µm, Merck), silica gel pha đảo YMC RP-18 (kích thước hạt 30-50 µm) và gel Sephadex LH-20.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:

  • Đo điểm nóng chảy (mp) trên thiết bị Kofler micro-hotstage;
  • Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) ghi trên máy Agilent 6120 mass spectrometer và máy Agilent 1100 LC-MSD;
  • Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) ghi trên máy FT-ICR-Mass spectrometer;
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D (TMS làm chất chuẩn nội) đo trên thiết bị Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (tần số 500 MHz cho 1H và 125 MHz cho 13C).

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:

  1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cao chiết bằng phương pháp MTT (theo Tim Mosmann, 1983):
    • Mẫu thử: Các cao chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate từ hoa và lá cây đu đủ đực;
    • Dòng tế bào thử nghiệm: A549 (ung thư phổi người), MCF-7 (ung thư vú người), Hep3B (ung thư gan người) do GS. Jeong-Hyung Lee (Đại học Quốc gia Kangwon, Hàn Quốc) cung cấp;
    • Điều kiện nuôi cấy: Môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, ủ ở 37°C trong tủ ấm 5% CO2;
    • Tế bào được cấy vào phiến 96 giếng (1×10^5 tế bào/giếng), xử lý với mẫu thử 48 giờ, bổ sung dung dịch MTT (5 mg/mL), ủ 4 giờ, hòa tan tinh thể formazan bằng isopropanol và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 570 nm trên máy Elisa (Mark Pro, Bio-Rad). Chất đối chứng dương là Camptothecin.
  2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập bằng phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) (theo Monks, 1991):
    • Dòng tế bào ung thư A549, MCF-7, Hep3B do GS. Pezzuto (Đại học Hawaii, Mỹ) và GS. Jeanette Maier (Đại học Milan, Italia) cung cấp;
    • Môi trường DMEM bổ sung 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate và 10% FBS;
    • Nồng độ sàng lọc 100 µg/mL; các chất có hoạt tính được xác định IC50 ở dải nồng độ 100; 20; 4; 0,8 µg/mL. Tế bào được cố định bằng trichloroacetic acid (TCA), nhuộm bằng SRB trong 1 giờ, rửa bằng acid acetic 5%, hòa tan protein gắn màu bằng Tris base 10 mM và đo OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad). Chất đối chứng dương là Ellipticine, đối chứng âm là DMSO 10%. Giá trị IC50 được tính toán thông qua phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
  3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro (theo phương pháp của Masuda và cộng sự có điều chỉnh):
    • Mẫu thử: Cao methanol và các hợp chất phân lập từ hoa đu đủ đực ở nồng độ 0-100 µM hòa tan trong DMSO và đệm kali phosphat 50 mM (pH 6,5);
    • Phản ứng ủ ở 37°C trên máy ELISA 200 Pro (TECAN), đo mật độ quang OD ở bước sóng 475 nm mỗi phút một lần trong 20 phút. Chất đối chứng dương là acid kojic;
    • Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Số liệu biểu diễn dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (Xtb ± SD). So sánh giá trị trung bình giữa các mẫu bằng phân tích phương sai một chiều (one-way ANOVA) với kiểm định hậu kiểm trên phần mềm GraphPad Prism 6 (ý nghĩa thống kê xác định khi P < 0,05). Giá trị IC50 được tính từ phương trình đường chuẩn y = ax + b.

Nội dung chính theo từng chương

Luận án có tổng độ dài 130 trang, gồm 41 Bảng và 58 Hình. Cấu trúc văn bản gồm: Phần mở đầu (04 trang), Kết luận và kiến nghị (03 trang), Danh mục các công trình khoa học đã công bố (01 trang), Tài liệu tham khảo (14 trang) và 04 chương nội dung chính.

Chương 1. Tổng quan tài liệu (25 trang)

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về đặc điểm thực vật, phân bố, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ (Carica papaya L.), cùng cơ chế tác động của enzyme tyrosinase:

  • Đặc điểm thực vật và sinh thái: Cây đu đủ thuộc chi Carica, họ Caricaceae. Cây có thể phân loại theo giới tính thành cây đực, cây cái và cây lưỡng tính; giới tính có thể biến đổi do các yếu tố môi trường như khô hạn hay nhiệt độ. Tại Việt Nam, 6 giống đu đủ chính đang được gieo trồng gồm: giống Đu đủ ta, giống Mehico, giống So Lo (đu đủ Mỹ), giống Trung Quốc, giống Thái Lan và giống Đài Loan (giống lai F1 năng suất 60-70 kg quả/cây, chiếm diện tích canh tác lớn nhất). Diện tích trồng đu đủ cả nước ước đạt 10.000 - 17.000 ha với sản lượng 200.000 - 350.000 tấn quả/năm;
  • Tri thức bản địa và công dụng: Tổng kết các ứng dụng dân gian của quả, lá, rễ, hạt và kinh nghiệm dùng hoa đu đủ đực hấp đường phèn chữa ho, mất tiếng ở trẻ em và người lớn hoặc dùng trị sỏi thận;
  • Tổng quan hóa học và hoạt tính sinh học: Điểm luận chi tiết các nhóm chất (glucosinolate, phenolic, flavonoid, carotenoid, alkaloid, sterol, triterpene, acid béo) và các công trình nghiên cứu dược lý thực nghiệm (diệt giun sán, hạ huyết áp, kháng khuẩn, kháng nấm, gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống viêm, kháng virus);
  • Cơ sở lý thuyết về enzyme tyrosinase: Phân tích cơ chế chuyển hóa L-tyrosine thành L-DOPA và DOPA quinone; tổng hợp các nhóm chất ức chế tyrosinase tự nhiên (flavonoid như kaempferol, quercetin; acid kojic; aldehyde thơm), các chất tổng hợp (resorcinol gắn thế C-4, tropolone) và các thuốc ức chế enzyme (captopril, methimazole, penicillamine).

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (6 trang)

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu thực vật, hóa chất, trang thiết bị và các phương pháp nghiên cứu:

  • Xử lý mẫu thực vật: Hoa và lá cây đu đủ đực thu hái tại Quảng Nam - Đà Nẵng (12/2016), rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi trong bóng râm, sấy ở 50-60°C đến khô kiệt, xay thành bột mịn và bảo quản lạnh;
  • Hóa chất và dung môi: n-Hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, methanol loại tinh khiết được tinh chế bằng cách cất lại qua cột Vigreux trước khi sử dụng;
  • Thiết bị phân tích: Máy siêu âm, máy cất quay chân không, máy đo điểm nóng chảy Kofler, máy khối phổ Agilent ESI-MS, máy phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS, máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM500 FT-NMR, máy đọc Elisa Bio-Rad Mark Pro và TECAN ELISA 200 Pro;
  • Quy chuẩn phương pháp sinh học: Thiết lập quy trình chiết ngấm dầm siêu âm, chiết phân bố lỏng-lỏng; chi tiết hóa các bước thực hiện phép thử MTT sàng lọc cao chiết, phép thử SRB định lượng IC50 trên ba dòng tế bào A549, MCF-7, Hep3B và phép thử đo động học ức chế tyrosinase ở 475 nm, kèm theo công thức tính toán và phần mềm xử lý dữ liệu (TableCurve 2Dv4, GraphPad Prism 6).

Chương 3. Thực nghiệm (18 trang)

Chương 3 trình bày các bước thực nghiệm chiết xuất, phân lập và thông số phổ của các hợp chất:

  • Thực nghiệm sàng lọc ban đầu từ 100 g nguyên liệu:
    • Từ 100 g bột hoa: Chiết siêu âm với MeOH (150 mL x 3 lần, 50°C, 30 phút), thu 6 g cao methanol tổng. Phân bố lỏng-lỏng thu được cao n-hexane (1,0 g), cao chloroform (0,2 g) và cao ethyl acetate (0,4 g);
    • Từ 100 g bột lá: Chiết siêu âm với MeOH (100 mL x 3 lần, 50°C, 30 phút), thu 10 g cao methanol tổng. Phân bố lỏng-lỏng thu được cao n-hexane (3,5 g), cao chloroform (1,5 g) và cao ethyl acetate (0,3 g);
    • Thử nghiệm sơ bộ độc tính tế bào in vitro của các cao chiết này trên 3 dòng tế bào A549, MCF-7, Hep3B làm cơ sở định hướng phân lập quy mô lớn.
  • Thực nghiệm chiết xuất quy mô lớn từ 5,0 kg nguyên liệu:
    • Từ 5,0 kg bột hoa đu đủ đực: Chiết siêu âm với MeOH (8 lít x 3 lần, 50°C, 30 phút), thu 300 g cao methanol. Chiết phân bố lỏng-lỏng thu được 4 cao phân đoạn: cao n-hexane (CPH, 54 g), cao chloroform (CPC, 12 g), cao dichloromethane (CPD, 52 g) và cao ethyl acetate (CPET, 20 g);
    • Từ 5,0 kg bột lá đu đủ đực: Chiết siêu âm với MeOH (5 lít x 3 lần, 50°C, 30 phút), thu 500 g cao methanol. Chiết phân bố lỏng-lỏng thu được cao n-hexane (CPLH, 185 g) và cao chloroform (CPLC, 74 g).
Mẫu nguyên liệu Lượng bột ban đầu Cao methanol tổng Phân đoạn n-hexane Phân đoạn Chloroform Phân đoạn Dichloromethane Phân đoạn Ethyl acetate
Hoa đu đủ đực (thử nghiệm nhỏ) 100 g 6 g 1,0 g 0,2 g — 0,4 g
Lá đu đủ đực (thử nghiệm nhỏ) 100 g 10 g 3,5 g 1,5 g — 0,3 g
Hoa đu đủ đực (phân lập lớn) 5,0 kg 300 g 54 g (CPH) 12 g (CPC) 52 g (CPD) 20 g (CPET)
Lá đu đủ đực (phân lập lớn) 5,0 kg 500 g 185 g (CPLH) 74 g (CPLC) — —
  • Quy trình phân lập chi tiết:
    • Từ cao CPC (12 g): Dùng sắc ký cột silica gel pha thường (CH2Cl2/MeOH 99:1 → 10:1) thu 5 phân đoạn (CPC1 - CPC5). Sắc ký pha đảo YMC RP-18 và pha thường phân lập được hợp chất C1 (Rutin, 10 mg), C2 (Acid gallic, 3 mg) và C3 (Daucosterol, 27 mg);
    • Từ cao CPD (52 g): Dùng sắc ký cột silica gel (CH2Cl2/MeOH 100:0 → 0:100) thu 5 phân đoạn (CPD1 - CPD5). Tiếp tục phân tách bằng cột pha thường và pha đảo RP-18 thu nhận CP11 (6 mg), CP12A (Caricapapayol, 9 mg), CP6 (3 mg), CP17A (Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat, 8 mg), CP19 (Indole-3-aldehyde, 9 mg), CP20 (5 mg), CP21 (7 mg), CP9 (10 mg), CP10 (8 mg), CP14 (7 mg), CP22 (Saringosterol, 6 mg);
    • Từ cao CPET (20 g): Dùng sắc ký cột silica gel (CH2Cl2/MeOH 50:1 → 1:1) thu 5 phân đoạn (CPET1 - CPET5). Kết hợp cột Sephadex LH-20 (MeOH/H2O 1:1) và RP-18 tinh chế được CPE1 (Kaempferol, 40 mg), CPE2 (18 mg), CPE3 (11 mg), CPE4 (Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside, 9,2 mg), CPE5 (Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside, 9 mg), CPE6 (8,1 mg), CPE7 (9,6 mg), CPE8 (8,7 mg);
    • Từ cao CPLC (74 g) của lá: Sắc ký cột silica gel (n-hexane/acetone 50:1 → 1:1) thu 12 phân đoạn (CPLC1 - CPLC12). Tinh chế bằng acetone và sắc ký cột thu được CPL-C1 (12 mg), CPL-C2 (17 mg), CPL-C3 (4 mg) và CPL-C4 (20 mg).
  • Ghi nhận đầy đủ thông số hóa lý và dữ kiện phổ thực nghiệm:
    • C1 (Rutin): Tinh thể hình kim màu vàng, mp 190-193°C, C27H30O16, M = 610, ESI-MS: m/z 633,1 [M+Na]+;
    • C2 (Acid gallic): Tinh thể hình kim màu trắng, mp 236-238°C, C7H6O5, M = 170;
    • C3 (Daucosterol): Bột màu trắng, mp 283-286°C, C35H60O6, M = 576, ESI-MS: m/z 397,3 [M-C6H12O6+H]+;
    • CP1: Chất dầu không màu, C13H13NO2, M = 215, HR-ESI-MS: m/z 238,0842 [M+Na]+ (lý thuyết: 238,0844);
    • CP3 (Vitexoid): Chất dầu không màu, C10H16O3, M = 184;
    • CP4 (Lariciresinol): Bột màu trắng, mp 165-168°C, C20H24O6, M = 360;
    • CP5 (Dehydrodiconiferyl alcohol): Bột màu trắng, mp 141-142°C, C20H22O6, M = 358;
    • CP6 (Benzyl-O-β-D-glucopyranoside): Bột màu trắng, mp 121-122°C, C13H18O6, M = 270;
    • CP9 (6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid): Dầu không màu, C10H16O3, M = 184;
    • CP10 (6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid): Dầu không màu, C10H18O3, M = 186;
    • CP14 (2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol): Dầu không màu, C10H18O2, M = 170;
    • CP11: Hỗn hợp 3-hydroxy-3-methyl-5-hexanolide (C6H10O3, M = 130, HR-ESI-MS: m/z 131,0709 [M+H]+) và leucine (C6H13NO2, M = 131, HR-ESI-MS: m/z 130,1649 [M-H]-);
    • CP12A (Caricapapayol): Chất bột màu vàng, C29H34O4, M = 446, HR-ESI-MS: m/z 447,2526 [M+H]+ (lý thuyết: 447,2535);
    • CP17A (Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat): Chất bột màu trắng, C20H38O5, M = 358, HR-ESI-MS: m/z 357,8369 [M-H]- (lý thuyết: 357,2641);
    • CP19 (Indole-3-aldehyde): Tinh thể hình kim màu vàng, C9H7NO, M = 145, HR-ESI-MS: m/z 146,1657 [M]+;
    • CP20 (3β,7α-dihydroxycholest-5-ene): Bột màu trắng, mp 188-189°C, C27H46O2, M = 402, ESI-MS: m/z 367,3 [M+H-2H2O]+;
    • CP21 (Cholest-5-ene-3β,7β-diol): Bột màu trắng, mp 178-179°C, C27H46O2, M = 402, ESI-MS: m/z 367,3 [M+H-2H2O]+;
    • CP22 (Saringosterol): Tinh thể hình kim màu trắng, mp 160-161°C, C29H48O2, M = 428, HR-ESI-MS: m/z 439,3651 [M+Na]+;
    • CPE1 (Kaempferol): Bột màu vàng sẫm, mp 275-277°C, C15H10O6, M = 286, ESI-MS: m/z 287,14 [M+H]+;
    • CPE5 (Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside): Bột màu vàng nhạt, mp 172-175°C, C21H20O10, M = 432, ESI-MS: m/z 433,46 [M+H]+;
    • CPE4 (Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside): Bột màu vàng sẫm, mp 223-229°C, C21H20O11, M = 448, ESI-MS: m/z 447,42 [M-H]-.

Chương 4. Kết quả và thảo luận (59 trang)

Chương 4 là chương trọng tâm của luận án, tập trung biện giải cấu trúc hóa học và phân tích các số liệu sinh học:

  • Biện luận cấu trúc hóa học: Dựa trên phân tích tương quan phổ NMR (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) và khối phổ phân giải cao HR-MS, luận án chứng minh cấu trúc của hai chất mới:
    • Caricapapayol (CP12A): Hợp chất mới phân lập từ phân đoạn CPD của hoa;
    • Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (CP17A): Dẫn xuất ester béo đa chức mới phân lập từ phân đoạn CPD của hoa;
    • Hợp chất 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (CP1): Lần đầu tiên được phân lập từ nguồn tự nhiên;
    • Xác định 18 hợp chất lần đầu tiên được ghi nhận sự hiện diện trong cây đu đủ đực;
  • Kết quả hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro:
    • Đối với cao chiết: Các cao chiết n-hexane, chloroform và ethyl acetate từ hoa và lá thể hiện mức độ kìm hãm tế bào ung thư khác nhau, định hướng việc lựa chọn các phân đoạn có hoạt tính để chiết tách hợp chất;
    • Đối với các hợp chất tinh khiết: Công bố kết quả thử nghiệm độc tính tế bào in vitro trên 3 dòng A549, MCF-7 và Hep3B của 24/30 hợp chất phân lập được. Hầu hết các hợp chất khảo sát đều thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng các dòng tế bào ung thư ở các mức độ khác nhau khi so sánh với đối chứng dương Ellipticine;
  • Kết quả hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro:
    • Cao methanol từ hoa đu đủ đực thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase;
    • Đánh giá thử nghiệm 9/26 hợp chất phân lập từ hoa;
    • Hợp chất mới caricapapayol (CP12A) thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh, đạt mức độ gần tương đương với chất đối chứng dương acid kojic.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả mới về mặt lý luận hóa học và thực tiễn sinh học:

  1. Đóng góp về hóa học các hợp chất thiên nhiên:

    • Phân lập và xác định cấu trúc của hai hợp chất mới hoàn toàn từ hoa cây đu đủ đực (Carica papaya L.), đặt tên là:
      • Caricapapayol (ký hiệu CP12A, công thức phân tử C29H34O4);
      • Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (ký hiệu CP17A, công thức phân tử C20H38O5);
    • Phân lập được một hợp chất lần đầu tiên ghi nhận từ nguồn gốc tự nhiên: 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (ký hiệu CP1, công thức phân tử C13H13NO2);
    • Phân lập và xác định được 18 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong cây đu đủ đực (Carica papaya L.).

  2. Đóng góp về hoạt tính sinh học:

    • Lần đầu tiên công bố kết quả nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên ba dòng tế bào ung thư người (ung thư phổi A549, ung thư vú MCF-7, ung thư gan Hep3B) của 24/30 hợp chất phân lập từ hoa và lá cây đu đủ đực. Phần lớn các hợp chất thử nghiệm đều thể hiện khả năng ức chế sự sinh trưởng của các dòng tế bào khảo sát ở các mức độ khác nhau;
    • Lần đầu tiên công bố dữ liệu thực nghiệm về khả năng ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao chiết methanol và 9/26 hợp chất phân lập từ hoa cây đu đủ đực;
    • Phát hiện hợp chất mới caricapapayol (CP12A) có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh gần tương đương với chất đối chứng dương acid kojic.

  3. Ý nghĩa thực tiễn và giải pháp đề xuất:

    • Cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm giải thích kinh nghiệm sử dụng hoa đu đủ đực trong y học dân gian tại địa phương, đặc biệt là tiềm năng hỗ trợ kìm hãm tế bào ung thư;
    • Đề xuất định hướng khai thác hoa và lá cây đu đủ đực làm nguồn dược liệu sẵn có để phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, các chế phẩm hỗ trợ điều trị ung thư và các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh nám da dựa trên tác dụng ức chế tổng hợp melanin qua enzyme tyrosinase;
    • Góp phần định hướng bảo tồn và khai thác hợp lý nguồn dược liệu bản địa tại các địa phương trồng đu đủ ở Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

  • Phạm vi thu mẫu: Mẫu hoa và lá cây đu đủ đực chỉ mới được thu thập tại một địa bàn (Quảng Nam - Đà Nẵng) vào một thời điểm nhất định (tháng 12 năm 2016), chưa khảo sát biến động hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ, thổ nhưỡng hoặc các vùng sinh thái khác nhau;
  • Giới hạn thử nghiệm sinh học: Các đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và ức chế enzyme tyrosinase hoàn toàn dừng lại ở quy mô in vitro trong phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo);
  • Độ bao phủ hoạt tính của các hợp chất: Luận án mới thử nghiệm độc tính tế bào trên 24/30 hợp chất và thử nghiệm ức chế tyrosinase trên 9/26 hợp chất phân lập được, chưa tiến hành đánh giá toàn bộ các chất thu nhận được;
  • Cơ chế tác động: Chưa đi sâu vào các cơ chế phân tử chi tiết (như sự phân cắt DNA, con đường truyền tín hiệu tế bào hoặc động học enzyme chi tiết) của các hợp chất mới đối với tế bào ung thư và phân tử tyrosinase.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng khảo sát thu mẫu tại nhiều vùng địa lý khác nhau để đánh giá hàm lượng và tính ổn định của các hoạt chất chính, đặc biệt là các hợp chất mới;
  • Tiếp tục thử nghiệm sàng lọc độc tính tế bào và ức chế tyrosinase đối với các hợp chất còn lại chưa khảo sát;
  • Triển khai các nghiên cứu sâu về cơ chế phân tử tác động tế bào và thử nghiệm hoạt tính in vivo trên động vật đối với hợp chất mới caricapapayol (CP12A) cùng các dẫn xuất tiềm năng;
  • Nghiên cứu quy trình chiết xuất tối ưu ở quy mô lớn hơn nhằm phục vụ mục tiêu bào chế sản phẩm chăm sóc sức khỏe và mỹ phẩm hỗ trợ điều trị nám da.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị học thuật và ứng dụng đối với nhiều đối tượng:

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Dược học: Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết từ kỹ thuật chiết ngấm dầm siêu âm, chiết lỏng - lỏng phân bố, sắc ký cột pha thường/pha đảo/rây phân tử đến phương pháp giải mã cấu trúc bằng hệ phổ NMR hiện đại (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS;
  • Đối với các nhà nghiên cứu Y - Dược học và Sinh học phân tử: Các quy trình thử nghiệm in vitro chuẩn hóa (MTT, SRB, đo động học tyrosinase) và số liệu thực nghiệm trên các dòng tế bào ung thư người (A549, MCF-7, Hep3B) là nguồn dữ liệu tham chiếu tin cậy cho các nghiên cứu sàng lọc hoạt chất tự nhiên;
  • Đối với ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm: Phát hiện về hợp chất mới caricapapayol (CP12A) có tác dụng ức chế tyrosinase tương đương acid kojic mở ra hướng nghiên cứu phát triển các công thức làm sáng da, chống tăng sắc tố an toàn từ nguồn nguyên liệu thực vật bản địa;
  • Đối với các nhà quản lý nông nghiệp và dược liệu tại các địa phương: Tài liệu cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá lại giá trị kinh tế của cây đu đủ đực, vốn trước đây thường bị chặt bỏ hoặc khai thác manh mún, từ đó xây dựng kế hoạch bảo tồn và quy hoạch vùng trồng thu hái dược liệu có giá trị kinh tế cao.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập và phát hiện được những hợp chất hóa học mới nào?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 02 hợp chất mới hoàn toàn từ hoa cây đu đủ đực gồm caricapapayol (CP12A, C29H34O4) và ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (CP17A, C20H38O5); 01 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ nguồn tự nhiên là 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (CP1, C13H13NO2); cùng với 18 hợp chất khác lần đầu tiên được ghi nhận phân lập từ cây đu đủ đực (Carica papaya L.).

2. Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của hoa cây đu đủ đực có kết quả thực nghiệm ra sao?

Thực nghiệm cho thấy cao methanol từ hoa đu đủ đực có khả năng ức chế enzyme tyrosinase in vitro. Khi thử nghiệm trên 9 hợp chất phân lập từ hoa, hợp chất mới caricapapayol (CP12A) thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh, đạt mức độ gần tương đương với chất đối chứng dương acid kojic.

3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được thực hiện bằng những phương pháp nào và trên các dòng tế bào nào?

Hoạt tính gây độc tế bào ung thư được đánh giá in vitro trên ba dòng tế bào ung thư người: ung thư phổi (A549), ung thư vú (MCF-7) và ung thư gan (Hep3B). Luận án sử dụng phương pháp MTT đối với các mẫu cao chiết (đối chứng dương là Camptothecin) và phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB) đối với các hợp chất tinh khiết (đối chứng dương là Ellipticine, tính toán IC50 bằng phần mềm TableCurve 2Dv4).

4. Quy mô nguyên liệu và quy trình chiết tách trong luận án được triển khai như thế nào?

Thực nghiệm được triển khai qua hai giai đoạn: Giai đoạn thăm dò sử dụng 100 g bột hoa và 100 g bột lá để chiết siêu âm với methanol và phân bố lỏng - lỏng thu các cao phân đoạn sàng lọc độc tính tế bào; giai đoạn phân lập quy mô lớn sử dụng 5,0 kg bột hoa (thu được 300 g cao MeOH, từ đó chiết phân bố thành cao n-hexane 54 g, chloroform 12 g, dichloromethane 52 g, ethyl acetate 20 g) và 5,0 kg bột lá (thu được 500 g cao MeOH, phân bố thành cao n-hexane 185 g và chloroform 74 g).

5. Nguồn gốc mẫu thực vật nghiên cứu được thu thập và giám định ở đâu?

Mẫu hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.) được thu hái tại khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng vào tháng 12 năm 2016. Mẫu được giám định định danh khoa học bởi TS. Ngô Văn Trại thuộc Viện Dược liệu, và mẫu tiêu bản thực vật mang mã số DD001 được lưu trữ tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết luận

Luận án "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây đu đủ đực (Carica papaya L.)" là công trình thực nghiệm hóa học các hợp chất thiên nhiên được tiến hành hệ thống trên mẫu hoa và lá đu đủ đực thu hái tại Quảng Nam - Đà Nẵng. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 2 hợp chất mới (caricapapayol và ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat), 1 hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên cùng 18 hợp chất lần đầu tiên ghi nhận từ cây đu đủ đực. Đồng thời, luận án lần đầu tiên cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro trên ba dòng tế bào người (A549, MCF-7, Hep3B) của 24 hợp chất và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của hoa đu đủ đực, khẳng định caricapapayol có hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh gần tương đương acid kojic. Các kết quả này xác lập cơ sở khoa học tin cậy cho tri thức dân gian và mở ra tiềm năng ứng dụng nguồn nguyên liệu cây đu đủ đực trong lĩnh vực y dược và chăm sóc sức khỏe.