Luận văn: Nghiên cứu hạt nano đa chức năng đánh dấu tế bào bằng SERS

Luận văn trình bày nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào bằng phương pháp SERS, mở ra tiềm năng mới trong chẩn đoán y sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hà
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoàng Nam
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Vật lý chất rắn
• Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào bằng phương pháp SERS
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Hạt Nano Đa Chức Năng Fe3O4 Ag

Hạt nano đa chức năng đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y sinh học hiện đại. Hạt nano composite Fe3O4/Ag kết hợp những ưu điểm của vật liệu sắt từ và kim loại quý, tạo nên một công cụ mạnh mẽ cho các ứng dụng y tế tiên tiến. Sự kết hợp này cho phép các nhà khoa học phát triển các giải pháp mới để đánh dấu tế bào một cách chính xác và hiệu quả. Nghiên cứu từ Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội đã chứng minh rằng hạt nano đa chức năng có khả năng gắn kết với các kháng thể sinh học, mở ra những cơ hội mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh.

1.1. Cấu Trúc và Tính Chất của Hạt Nano Fe3O4

Hạt nano Fe3O4 là vật liệu sắt từ với các tính chất siêu thuận từ ưu việt. Cấu trúc tinh thể của Fe3O4 cho phép nó hấp thụ từ trường mạnh mẽ, làm cho hạt nano này trở thành ứng cử viên lý tưởng cho các ứng dụng từ y sinh. Tính chất này giúp kiểm soát vị trí của hạt trong cơ thể sống, nâng cao độ chính xác của đánh dấu tế bào và chẩn đoán bệnh.

1.2. Vai Trò của Kim Loại Bạc trong Cộng Hưởng Plasmon

Kim loại Ag được gắn kết lên bề mặt hạt nano Fe3O4 để tạo thành composite Fe3O4/Ag. Bạc có khả năng tạo ra cộng hưởng plasmon bề mặt (SERS), cho phép phát hiện cường độ ánh sáng raman tăng mạnh. Đây chính là cơ sở cho công nghệ SERS (Surface Enhanced Raman Scattering), cho phép đánh dấu tế bào với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

II. Phương Pháp SERS trong Đánh Dấu Tế Bào

Phương pháp SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) là kỹ thuật quang phổ tiên tiến cho phép đánh dấu tế bào với độ nhạy cực cao. Khi hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag được gắn với các chất chỉ thị raman, tín hiệu phát xạ từ hạt nano sẽ được khuếch đại lên hàng triệu lần. Công nghệ này cho phép các nhà nghiên cứu phát hiện các tế bào bệnh thậm chí ở nồng độ rất thấp, cải thiện đáng kể hiệu quả chẩn đoán sớm bệnh ung thư và các bệnh nguy hiểm khác.

2.1. Nguyên Lý Hoạt Động của Kỹ Thuật SERS

SERS dựa trên hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt của kim loại Ag trong hạt nano composite. Khi ánh sáng tương tác với bề mặt kim loại, các electron tự do dao động mạnh mẽ, tạo ra trường điện tăng cường hàng triệu lần. Điều này làm cho tín hiệu raman từ các phân tử gắn kết trên bề mặt hạt nano tăng lên đáng kể, cho phép phát hiện các tế bào ở những nồng độ rất thấp.

2.2. Ứng Dụng trong Phát Hiện Các Bệnh Ung Thư

Hạt nano đa chức năng được sử dụng để đánh dấu tế bào ung thư thông qua kháng thể anti-EGFR. EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) là thụ thể tế bào được biểu hiện cao trên bề mặt các tế bào ung thư. Bằng cách gắn kháng thể này lên hạt nano Fe3O4/Ag, các nhà khoa học có thể phát hiện và đánh dấu các tế bào bệnh với độ chính xác cao, hỗ trợ chẩn đoán sớm.

III. Quy Trình Chế Tạo và Chức Năng Hóa Hạt Nano Đa Chức Năng

Quy trình chế tạo hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag bao gồm nhiều bước phức tạp được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên biệt. Đầu tiên, hạt nano Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp co-precipitation, sau đó được chức năng hóa với APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) để tạo các nhóm amine NH2 tự do. Tiếp theo, kim loại Ag được沉 tích lên bề mặt tạo thành hạt nano composite Fe3O4/Ag. Bước cuối cùng là chức năng hóa bề mặt bằng 4-aminothiophenol (4-ATP) để tạo ra hạt nano đa chức năng có khả năng gắn kết kháng thể.

3.1. Chức Năng Hóa Bề Mặt với APTES

Hạt nano Fe3O4 được xử lý với APTES để gắn các nhóm amine trên bề mặt, tạo hạt nano Fe3O4-NH2. Các nhóm amine này hoạt động như những điểm neo, cho phép các phân tử khác gắn kết dễ dàng. Quá trình này tăng cường khả năng đánh dấu tế bào bằng cách cung cấp các tâm hoạt động cho việc gắn kết các chất sinh học.

3.2. Tạo Composite Fe3O4 Ag và Chức Năng Hóa Cuối Cùng

Kim loại Ag được沉 tích lên bề mặt hạt nano Fe3O4-NH2 bằng phương pháp khử hóa học, tạo thành hạt nano composite Fe3O4/Ag. Sau đó, bề mặt được chức năng hóa với 4-ATP để tạo hạt nano Fe3O4/Ag-NH2 cuối cùng. Sản phẩm này có khả năng gắn kết với kháng thể anti-EGFR và các phân tử sinh học khác, sẵn sàng cho đánh dấu tế bào.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn trong Đánh Dấu Tế Bào Ung Thư

Hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag được ứng dụng để đánh dấu tế bào ung thư thông qua việc gắn kết kháng thể anti-EGFR. Các nhà nghiên cứu từ Đại học Khoa học Tự nhiên đã tiến hành thử nghiệm trên hai dòng tế bào: HaCaT (tế bào da bình thường) và SK-Mel 28 (tế bào ung thư da). Kết quả cho thấy hạt nano gắn kháng thể có thể chọn lọc đánh dấu các tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường. Công nghệ này mở ra triển vọng mới cho chẩn đoán sớm và theo dõi bệnh ung thư.

4.1. Gắn Kết Kháng Thể anti EGFR lên Hạt Nano

Kháng thể anti-EGFR được gắn kết lên bề mặp hạt nano Fe3O4/Ag-NH2 thông qua các liên kết hóa học mạnh mẽ. EGFR là thụ thể được biểu hiện cao trên tế bào ung thư, do đó kháng thể này giúp hạt nano đa chức năng nhận diện và đánh dấu chính xác các tế bào bệnh. Quá trình này đảm bảo tính đặc hiệu cao của phương pháp SERS trong chẩn đoán bệnh.

4.2. Thử Nghiệm trên Hai Dòng Tế Bào HaCaT và SK Mel 28

Thử nghiệm được thực hiện trên tế bào HaCaT (da bình thường) và SK-Mel 28 (ung thư da) để đánh giá khả năng chọn lọc của hạt nano đa chức năng. Kết quả cho thấy hạt nano gắn kháng thể có khả năng gắn kết mạnh mẽ với tế bào SK-Mel 28 nhưng tương tác yếu với tế bào HaCaT. Điều này chứng minh rằng SERS có khả năng đánh dấu tế bào bệnh một cách chính xác, mở ra hy vọng mới cho việc chẩn đoán sớm các bệnh ung thư.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở đầu Mục lục Chƣơng 1 - Tổng quan: Trình bày sơ lược về hạt nano composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2, hạt nano có cấu trúc lõi vỏ và ứng dụng của hạt nano trong y sinh học. Chƣơng 2 - Thực nghiệm: Trình bày phương pháp chế tạo mẫu, các thiết bị 3 Luận văn thạc Nguyễn Thị thực nghiệm được sử dụng để nghiên cứu các tính chất và ứng dụng của vật liệu nano 4 Luận văn thạc Nguyễn Thị composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 trong đánh dấu tế bào HaCaT và SK-Mel 28. Chƣơng 3 - Kết quả và thảo luận: Những kết quả đạt được trong quá trình chế tạo và ứng dụng hạt nano composite đa chức năng Fe 3O4 /Ag-NH2 trong đánh dấu tế bào. Các kỹ thuật khảo sát tính chất và những biện luận kết quả.

Kết luận Tài liệu tham khảo 5 Luận văn thạc Nguyễn Thị CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Tổng quan về hạt nano Fe3O4 và hạt nano Ag 1. Vật liệu sắt từ Vật liệu sắt từ là các vật liệu trong đó có các mô men từ sắp xếp song song với nhau. Vì vậy trạng thái sắt từ cũng là trạng thái từ hoá tự phát.

Theo lý thuyết Weiss thì ngay cả khi không có từ trường ngoài trong vật liệu sắt từ đã có sự từ hoá tự phát đến bão hoà. Nguyên nhân của sự từ hoá tự phát đó là do các mô men từ tương tác với nhau rất mạnh mẽ. Tương tác này tương đương với tác dụng của từ trường ngoài lớn cỡ 104 - 105 Oe làm cho các mô men từ có xu hướng sắp xếp song song với nhau [5]. Nhiệt độ Curie trong các chất sắt từ là nhiệt độ chuyển pha sắt từ - thuận từ.

Dưới nhiệt độ Tc tương tác giữa các mô men từ thắng được kích thích nhiệt do đó vật liệu thể hiện tính sắt từ. Trên nhiệt độ Tc năng lượng kích thích nhiệt đủ lớn để phá vỡ trạng thái liên kết sắt từ giữa các mô men từ làm cho phân bố các mô men từ trở lên hỗn loạn và vật liệu thể hiện tính chất thuận từ [9]. Tính chất siêu thuận từ Đối với một vật liệu sắt từ khi ở kích thước lớn, các hạt có xu hướng phân chia thành các domain từ để giảm năng lượng dị hướng và ta có các hạt đa domain. Khi kích thước hạt giảm xuống dưới một giá trị nào đó và hạt chuyển thành đơn domain sẽ xảy ra tình huống trong đó năng lượng kích thích nhiệt (có xu hướng phá vỡ sự định hướng mô men từ của các hạt) trở nên trội hơn năng lượng dị hướng từ (có tác dụng định hướng mô men từ của các hạt).

Khi đó mô men từ của các hạt sẽ định hướng một cách hỗn độn do đó mô men từ tổng cộng bằng không. Chỉ khi có từ trường ngoài tác dụng thì mới có sự định hướng của mô men từ của các hạt và tạo ra mô men từ tổng cộng khác không. Tính chất này là đặc trưng cho các vật liệu thuận từ nhưng ở đây mỗi hạt nanô có chứa nhiều nguyên tử nên có mô men từ lớn hơn mô men từ nguyên tử nhiều lần, vì vậy tính chất này được gọi là tính chất siêu thuận từ. 6 Luận văn thạc Nguyễn Thị Đường cong từ trễ của vật liệu siêu thuận từ cũng tuân theo hàm Langevin như trường hợp thuận từ.

Đường cong này có hai đặc điểm đó là: lực kháng từ Hc = 0, từ độ dư Mr = 0 nghĩa là không có hiệu ứng trễ.1 diễn tả sự thay đổi đường cong từ hoá của vật liệu sắt từ khi kích thước hạt giảm. Trong giới hạn đơn domain khi kích thước hạt giảm thì Hc giảm cho đến khi Hc = 0, kích thước tại đó Hc = 0 chính là giới hạn siêu thuận từ.2 biểu diễn sự thay đổi của Hc khi đường kính hạt giảm. Đường cong từ trễ sắt từ (- --) và siêu thuận từ (---) Hình 1. Hc phụ thuộc vào đường kính hạt Do sự cạnh tranh giữa năng lượng dị hướng và năng lượng kích thích nhiệt mà các hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ khi kích thước thoả mãn điều kiện (1.1) với Vp là thể tích hạt, kB là hằng số Boltzmann (kB = 1,38.K), T là nhiệt độ của mẫu, K là hằng số dị hướng từ.

Dựa vào điều kiện (1.1) ta có thể đánh giá giới hạn kích thước để hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ ở nhiệt độ phòng khi biết giá trị của K. Ngược lại với các hạt có kích thước xác định (có V p xác định) tồn tại nhiệt độ chuyển pha sắt từ - siêu thuận từ còn gọi là nhiệt độ Blocking (TB): TB  KVp (1.2) 25kB 7 Luận văn thạc Nguyễn Thị Trên nhiệt độ TB điều kiện (1.1) được thoả mãn hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ, dưới nhiệt độ này điều kiện đó không được thoả mãn và hạt thể hiện tính chất sắt từ [31]. Vật liệu oxit sắt từ Fe3O4 Vật liệu Fe3O4 kích thước < 20 nm là vật liệu siêu thuận từ. Khi ở kích thước hạt lớn, hệ ở trạng thái đa đômen (tức là mỗi hạt sẽ cấu tạo bởi nhiều đômen từ).

Khi kích thước hạt giảm dần, Fe3O4 sẽ chuyển sang trạng thái đơn đômen (mỗi hạt sẽ là một đômen). Hiện tượng siêu thuận từ xảy ra khi kích thước hạt giảm quá nhỏ, năng lượng định hướng nhỏ hơn nhiều năng lượng nhiệt, vì vậy năng lượng nhiệt phá vỡ sự định hướng song song của các mômen từ, và các mômen từ của hệ hạt sẽ định hướng hỗn loạn như trong chất thuận từ. Ứng dụng của hạt nano từ Fe3O4 Ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại: ứng dụng trong cơ thể và ngoài cơ thể. Các ứng dụng trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, nung nóng cục bộ và tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ.

Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng ngoài cơ thể nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác [3]. Đây cũng chính là ứng dụng được chúng tôi nghiên cứu sử dụng trong luận văn này. Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hoóc-môn, a-xít folic tìm thấy. Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên.

Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào. Các hạt nano từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi [4]. Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài. Từ trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào được đánh dấu.

Các tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và thoát ra ngoài. 8 Luận văn thạc Nguyễn Thị 1. Hạt nano Bạc và tính chất Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm. Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể hiện tính độc với con người.

Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag + hơn. Tương tự các hạt nano kim loại quý khác, các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Cộng hƣởng Plasmon bề mặt [16] Một trong những tính chất quan trọng của các hạt nano kim loại, đó là hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt.

Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt là hiệu ứng đặc trưng của các hạt nano kim loại. Vì trong kim loại có nhiều điện tử tự do nên khi hấp thụ ánh sáng chiếu vào các điện tử tự do này sẽ dao động tập thể cùng pha với điện trường ánh sáng. Dao động đó gọi là dao động Plasma điện tử. Khi quãng đường tự do trung bình của các điện tử nhỏ hơn kích thước của chúng, các dao động này thông thường bị dập tắt bởi các sai hỏng mạng hay chính các nút mạng trong tinh thể nguyên tử kim loại.

Nhưng khi kim loại ở kích thước nano thì kích thước của chúng lại nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình do đó hiện tượng dập tắt không còn nữa mà các điện tử sẽ dao động cộng hưởng vói ánh sáng kích thích. Do vậy tính chất quang của hạt nano kim loại có được do sự dao động tập thể của các điện tử dẫn đến quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ. Khi dao động như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho hạt nano bị phân cực điện tạo thành một lưỡng cực điện. Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng hình dáng, kích thước, độ lớn của hạt nano và môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất.

Ngoài ra mật độ hạt nano cũng ảnh hưởng đến tính chất quang. Nếu mật độ loãng có thể coi như gần đúng các hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải kể đến tương tác giữa các hạt (Hình 1. 9 Luận văn thạc Nguyễn Thị Hình 1. Mô tả hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt của hạt nano kim loại.

Tán xạ Raman [12] Tán xạ Raman là một quá trình tán xạ không đàn hồi giữa photon (lượng tử ánh sáng) và một lượng tử dao động của vật chất hay mạng tinh thể. Sau quá trình va chạm, năng lượng của photon giảm đi (hoặc tăng lên) một lượng bằng năng lượng giữa hai mức dao động của nguyên tử (hoặc mạng tinh thể) cùng với sự tạo thành (hoặc hủy) một hạt lượng tử dao động. Dựa vào phổ năng lượng thu được, ta có thể có những thông tin về mức năng lượng dao động của nguyên tử, phân tử hay mạng tinh thể. Cơ sở lý thuyết tán xạ Raman Trong quang phổ Raman, mẫu được chiếu xạ bởi chùm laser cường độ mạnh trong vùng tử ngoại-khả kiến ( v0 ) và chùm ánh sáng tán xạ thường được quan sát theo phương vuông góc với chùm tia tới.

Ánh sáng tán xạ bao gồm hai loại : một được gọi là tán xạ Rayleigh, rất mạnh và có tần số giống với tần số chùm tia tới ( v0 ); loại còn lại được gọi là tán xạ Raman, rất yếu (10 -5 chùm tia tới) có tần số là v0  vm , trong đó vm là tần số dao động phân tử. Vạch v0 vm được gọi là vạch Stockes và vạch v0  vm gọi là vạch phản Stockes.