MỞ ĐẦU Việt Nam là một nước nông nghiệp với khối lượng phế phụ phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, bã mía ước tính mỗi năm lên đến 80 - 100 triệu tấn. Lignocellulose từ các phế phụ phẩm này là nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất năng lượng tái sinh. Tuy nhiên, hiện nay nguồn sinh khối rất lớn này đang được nông dân xử lý bằng cách đốt, gây lãng phí rất lớn nguồn sinh khối có sẵn và còn ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống [15]. Vì vậy, việc chuyển hóa chúng thành cồn hoặc các chất có giá trị khác không những có ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ môi trường sống mà còn góp phần giải quyết nhu cầu năng lượng quốc gia, tạo nguồn thu nhập tại chỗ cho nông dân.
Ưu điểm cồn sinh học thế hệ thứ hai hay thế hệ mới (được sản xuất từ nguồn lignocellulose phế phụ phẩm nông lâm nghiệp) là bền vững, không gây ảnh hưởng tới an ninh lương thực như cồn sinh học thế hệ thứ nhất (được sản xuất từ việc lên men dịch đường và tinh bột). Cellulase và hemicellulase là các nhóm enzym chính tham gia vào quá trình phân giải lignocellulose và thường được phân lập từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy được. Tuy nhiên, theo ước đoán có đến 99% vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên không thể nuôi cấy được [7] và chúng có thể là những nguồn tổng hợp các enzym phân hủy lignocellulose đầy tiềm năng. Do đó, các nhà khoa học hiện đang quan tâm vào việc phân lập các enzym tham gia vào quá trình thủy phân lignocellulose từ nhóm vi khuẩn không nuôi cấy được này nhằm tìm ra các enzym mới có thể ứng dụng vào trong quá trình sản xuất công nghiệp.
Việc khai thác gen có nguồn gốc từ vi sinh vật không nuôi cấy được phải cần đến công cụ nghiên cứu metagenomics. Metagenomics cho phép nghiên cứu về vi sinh vật không qua nuôi cấy trong phòng thí nghiệm cũng như nghiên cứu sự đa dạng và các đặc tính sinh lý và di truyền của các vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Ngày nay với sự ra đời và phát triển của các máy giải trình tự thế hệ mới, việc giải trình tự toàn bộ metagenome hệ vi sinh vật có trong mẫu thu thập đang dần trở nên chiếm ưu thế trong nghiên cứu phân tích metagenomics. Phươn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ ể phân tích quần xã vi sinh vậ.
Hiện nay, ở nước ta chưa có một nghiên cứu nào theo hướng sử dụng kỹ thuật metagenomics để nghiên cứu và sàng lọc các enzym tham gia thủy phân lignocellulose từ các mẫu môi trường tiềm năng (mẫu ủ rơm rạ, ruột mối hay dạ cỏ động vật nhai lại). Trong khi đó, ở Việt Nam mối phân bố khắp mọi nơi với hơn 140 loài [81]. Mối đóng vai trò sinh thái quan trọng trong quá trình phân giải lignocellulose từ thực vật nhờ sự hỗ trợ tích cực của nhóm vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối. Nhóm vi sinh vật này có khả năng tiết ra các enzym thủy phân lignocellulose hiệu quả.
Do đó, hệ vi sinh vật ruột mối được coi là nguồn dự trữ phong phú và đa dạng các enzym tham gia vào phân hủy lignocellulose. Ứng dụng phương pháp metagenomics theo hướng phân tích dữ liệu thu được từ việc giải toàn bộ trình tự metagenome hệ vi khuẩn ruột mối, chúng tôi hi vọng có thể khai thác được các enzym thủy phân lignocellulose của hệ vi khuẩn sống trong ruột mối. Việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn và khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối” tại phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học sẽ mở ra một hướng phân lập gen mới tại Việt Nam và có thể sẽ cho phép phân lập được các dòng enzym mới có khả năng thủy phân lignocellulose hiệu quả. Nghiên cứu được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Sàng lọc các enzym tham gia vào các quá trình phân giải cellulose, hemicellulose bằng kỹ thuật Metagenomics” và đề tài hợp tác quốc tế về Khoa học và Công nghệ theo Nghị định thư với Nhật Bản “Phân lập hệ gen mã hóa enzyme thủy phân lignocellulose từ khu hệ vi sinh vật ruột mối Việt Nam bằng kỹ thuật metagenomics”.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về mối – “cỗ máy” sản xuất enzym thủy phân lignocellulose hiệu quả 1. Nguồn gốc và phân loại mối Mối được phân loại là bộ Cánh đều (danh pháp khoa học: Isoptera), thuộc lớp Côn trùng (Insecta). Dựa trên chứng cứ DNA, một số nhà khoa học cho rằng mối có quan hệ họ hàng gần gũi nhất với các loài gián ăn gỗ (chi Cryptocercus) [87].
Đến nay, trên thế giới đã biết hơn 2700 loài mối và xếp vào 7 họ của bộ cánh đều [2], trong đó có một họ duy nhất Termitidae là mối bậc cao; còn lại là mối bậc thấp (Hình 1.1: Sơ đồ phân loại mối. Các con số chỉ số lượng giống/loài trong từng họ mối khác nhau [5]. Ở Việt Nam mối phân bố khắp mọi nơi. Trong các loài mối Việt Nam, Coptotermes là giống mối đáng chú ý nhất vì chúng là loài mối ăn gỗ rất phổ biến, thường phá hoại các công trình ở Việt Nam.
Do có tính phổ biến và phân bố trên diện rộng, nên việc thu mẫu loài mối này có nhiều thuận lợi hơn so với các loài mối khác. Mối thợ có kích thước nhỏ và chiếm số đông (70 – 80% trong đàn mối), gánh vác mọi công việc trong vương quốc mối như kiếm và chế biến thức ăn, xây tổ, làm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ đường, chuyển trứng, nuôi mối con và hút nước. Vì vậy, ruột mối thợ có khả năng chứa các enzym và các vi sinh vật sản xuất các enzym thủy phân lignocellulose. Cấu tạo ruột mối và hệ vi sinh vật trong ruột mối 1.
Cấu tạo ruột mối , gồm a (Hình 1.2 –l gh và tuyến nước bọt – là nơi tiết ra một số enzym endoglucanase của mối. hình ống với môi trường hiếu khí, là nơi sản xuất endoglucanase có nguồn gốc từ mối ở các loài mối bậc cao và diễn ra một vài sự thủy phân lignocellulose sau có dạ cỏ, thường là một bể lên men kỵ khí vật. Ở đây diễn ra phần lớn sự thủy phân cellulose và các quá trình lên men các sản phẩm từ sự thủy phân đó [71].2: Cấu tạo ruột mối, gồm có ruột trước (foregut), ruột giữa (midgut) và ruột sau (hindgut) [71]. Đa dạng hệ vi sinh vật ruột mối Năm 1856, Lespes là người đầu tiên miêu tả sự tồn tại của vi sinh vật trong ruột mối.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh giữa mối và vi sinh vật chỉ được bắt đầu từ đầu thế kỷ 20 [36]. Năm 1923, một thí nghiệm nổi tiếng của Cleveland đã chứng minh được mối không thể tồn tại trên gỗ nếu không có sự hỗ trợ của vi sinh vật [13]. Chất kháng sinh làm thay đổi khu hệ mini sinh thái của vi khuẩn trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ ruột mối, phá vỡ sự tương tác cộng sinh giữa vi khuẩn và vật chủ, qua đó dẫn tới chu kỳ sống và khả năng sinh sản của mối bị giảm [67]. Trong mỗi tổ mối, mối thợ chịu trách nhiệm tìm kiếm thức ăn, tiêu hóa và nuôi dưỡng cả đàn mối.
Mối thợ ăn tất cả các loại thức ăn là gỗ mà thành phần chủ yếu là lignocellulose. Trong đường tiêu hóa của mối thợ, cellulose được chuyển hóa thành các chất dinh dưỡng nhờ hệ enzym của ruột mối và hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối, động vật nguyên sinh, nấm, vi khuẩn và cổ khuẩn. Dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của động vật nguyên sinh trong ruột mối mà mối được chia làm hai nhóm mối bậc thấp và mối bậc cao [89]. Khoảng 106 đến 108 tế bào nhân sơ tồn tại trong mỗi ruột mối.
Vi khuẩn và cổ khuẩn được tìm thấy trong cả mối bậc thấp và mối bậc cao, trong đó phần lớn là vi khuẩn (trên 90%). Hầu hết vi khuẩn ruột mối đặc trưng cho từng loài mối. Thành phần quần xã vi khuẩn rất giống nhau giữa các loài mối trong cùng một chi, nhưng lại thay đổi mạnh giữa hai chi mối [42]. Động vật nguyên sinh chỉ có ở ruột mối bậc thấp, từ 103 đến 105 cá thể, 90% hoặc hơn trong số đó chủ yếu tập trung ở ruột sau của mối.
Đồng thời, động vật nguyên sinh còn là nơi sinh sống của rất nhiều loài vi sinh vật nhân sơ, bao gồm cả cộng sinh nội bào và cộng sinh ngoại bào [11]. loài vi khuẩn [42]. Khoảng 440 loài động vật nguyên sinh không có ty thể, thuộc các bộ Trichomonadida, Hypermastigida và Oxymonadida đã được tìm thấy trong ruột mối bậc thấp ăn gỗ [17].Có vẻ như hệ vi sinh ruột mối, bao gồm vi khuẩn và động vật nguyên sinh, là những loài cộng sinh đặc trưng cùng tiến hóa với loài mối chủ [42]. Quần xã vi sinh vật trong ruột mối có sự đa dạng rất cao.
Nhiều nghiên cứu về hệ vi khuẩn trong ruột mối được thực hiện thông qua các phương pháp truyền thống dựa trên việc nuôi cấy và phân lập vi sinh vật ở trong phòng thí nghiệm. Các vi khuẩn kỵ khí, đặc biệt là Staphylococcus và Bacillus, là những vi khuẩn có mặt nhiều nhất trong cả ruột mối bậc thấp và bậc cao [41]. Serratia marcescenes, Enterobacter Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ aerogenes, Enterobacter cloacae và Citrobacter farmeri đã được phân lập từ Coptotermes formosanus [6]; trong khi đó E. cloacae và Clavibacter agropyri đã được chứng minh là tồn tại trong ruột mối C.
Tương tự, Husseneder và cộng sự cũng đã phân lập từ C. formosanus 25 chủng vi khuẩn, thuộc các họ Enterobacteriaceae, bộ Bacteroidales và Lactobacillales [35]. Trùng roi là sinh vật đơn bào đặc trưng chỉ có ở ruột mối bậc thấp. Trong khi Hodotermopsis japonica có chứa tới 19 loài trùng roi khác nhau ở trong đường ruột thì chỉ có 3 loài động vật nguyên sinh tồn tại trong ruột mối C.
Tuy nhiên, hầu hết các vi sinh vật trong ruột mối là không nuôi cấy được, do đó số loài vi sinh vật trong ruột mối xác định được theo phương pháp truyền thống này là không nhiều, cho nên sự đa dạng về hệ vi sinh vật trong ruột mối chưa được đánh giá chính xác. Gần đây, các nghiên cứu không thông qua nuôi cấy đã tiết lộ nhiều hơn về sự đa dạng vi sinh vật ruột mối, đặc biệt là đa dạng vi khuẩn.