Đặc Điểm Đột Biến Gen Globin của Bệnh Nhân Thalassemia tại BV Trung Ương Thái Nguyên

Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin ở bệnh nhân thalassemia tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Phân tích di truyền bệnh tan máu bẩm sinh.

• Tác giả: Nguyễn Thu Phương
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Thị Thu Hương
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh
• Đề tài: Đặc điểm đột biến gen globin của các bệnh nhân Thalassemia tại bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
• 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 3. NỘI DUNG THỰC HIỆN
• 3.1. Sàng lọc, phát hiện, phân loại bệnh nhân, thu thập mẫu máu tách chiết DNA
• 3.2. Ứng dụng quy trình phát hiện đột biến gen globin
• 3.3. Phân tích đặc điểm đột biến gen gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sơ lược về hemoglobin
• 1.2. Chuỗi globin thường
• 1.3. Các loại hemoglobin sinh lý
• 1.4. Khái niệm, phân loại bệnh thalassemia
• 1.5. Sinh lý bệnh thalassemia
• 1.6. Cơ chế di truyền
• 1.7. Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia
• 1.8. Gen globin và các đột biến
• 1.9. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen
• 1.9.1. Phương pháp PCR cách đoạn (Gap-PCR)
• 1.9.2. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification – MLPA)
• 1.9.3. Kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease - RE)
• 1.10. Kỹ thuật khuếch đại alen đặc hiệu ARMS-PCR
• 1.11. Phương pháp lai ngược (Reverse Dot Blot)
• 1.12. Kỹ thuật lai phân tử (Reversehybridization - kit Strip Assay)
• 1.13. Kỹ thuật phân tích giải trình tự gen theo nguyên lý Sanger
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và bệnh phẩm nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu
• 2.4. Quy trình kỹ thuật nghiên cứu
• 2.4.1. Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu và điện di huyết sắc tố
• 2.4.2. Tách chiết DNA
• 2.4.3. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của sản phẩm DNA
• 2.4.4. Thiết kế mồi
• 2.4.5. Quy trình multiplex PCR xác định đột biến gen thalassemia
• 2.5. Phân tích số liệu
• 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách chiết DNA
• 3.2. Kết quả quy trình multiplex-PCR
• 3.3. Đặc điểm đột biến gây bệnh Thalassemia tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên
• KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Tóm tắt

I. Tổng Quan Đột Biến Gen Globin Thalassemia Là Gì 55 ký tự

Thalassemia là một nhóm bệnh thiếu máu di truyền, gây ra bởi các đột biến gen globin. Các đột biến này ảnh hưởng đến quá trình sản xuất các chuỗi globin, thành phần quan trọng của hemoglobin. Hemoglobin có vai trò vận chuyển oxy trong máu. Sự thiếu hụt hoặc bất thường trong các chuỗi globin dẫn đến giảm sản xuất hemoglobin chức năng, gây ra thiếu máu và các biến chứng khác. Tùy thuộc vào loại chuỗi globin bị ảnh hưởng, bệnh thalassemia được chia thành hai loại chính: alpha thalassemia và beta thalassemia. Trên toàn thế giới, đã có hơn 500 đột biến được báo cáo liên quan đến thalassemia. Tại Việt Nam, các nghiên cứu cho thấy một số đột biến phổ biến hơn so với những đột biến khác. Việc chẩn đoán thalassemia trước đây chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm sinh hóa huyết học. Tuy nhiên, các phương pháp này chỉ có thể xác định một số thể thalassemia nhất định. Đối với người lành mang gen hoặc thai nhi (trong chẩn đoán trước sinh), các phương pháp này không thể xác định được thể bệnh. Ngày nay, khoa học ứng dụng trong y học đã giúp các nhà nghiên cứu chẩn đoán được bệnh thalassemia ở cấp độ phân tử, phát hiện chính xác sự có mặt của các loại đột biến gây bệnh, mở ra sự hỗ trợ rất lớn cho công tác chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền phòng bệnh thalassemia.

1.1. Hemoglobin Cấu trúc và Chức năng Vận Chuyển Oxy

Hemoglobin là một protein phức tạp nằm trong hồng cầu, đóng vai trò trung tâm trong việc vận chuyển oxy từ phổi đến các mô và cơ quan trong cơ thể. Cấu trúc của hemoglobin bao gồm bốn chuỗi polypeptide, được gọi là các chuỗi globin, và bốn nhóm heme chứa sắt. Mỗi chuỗi globin liên kết với một nhóm heme, và mỗi nhóm heme có khả năng liên kết với một phân tử oxy. Điều này cho phép mỗi phân tử hemoglobin vận chuyển bốn phân tử oxy. Ngoài chức năng vận chuyển oxy, hemoglobin còn tham gia vào vận chuyển carbon dioxide từ các mô trở lại phổi để thải ra. Nó cũng đóng vai trò là một bộ đệm pH trong máu, giúp duy trì sự ổn định của môi trường bên trong cơ thể. Do đó, bất kỳ sự bất thường nào trong cấu trúc hoặc chức năng của hemoglobin, chẳng hạn như do đột biến gen globin, có thể dẫn đến các rối loạn nghiêm trọng như bệnh thalassemia.

1.2. Alpha và Beta Thalassemia Hai Dạng Bệnh Phổ Biến

Thalassemia được phân loại chủ yếu dựa trên chuỗi globin bị ảnh hưởng. Alpha thalassemia xảy ra khi có đột biến hoặc thiếu hụt trong các gen kiểm soát sản xuất chuỗi alpha globin. Tương tự, beta thalassemia phát sinh từ các đột biến ảnh hưởng đến sản xuất chuỗi beta globin. Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào số lượng gen bị ảnh hưởng và loại đột biến. Các dạng alpha thalassemia có thể bao gồm từ thể ẩn (không triệu chứng) đến thể nặng (gây tử vong trong giai đoạn bào thai). Beta thalassemia cũng có các mức độ nghiêm trọng khác nhau, từ thể nhẹ (ít hoặc không có triệu chứng) đến thể nặng (bệnh Cooley), đòi hỏi truyền máu suốt đời. Hiểu rõ sự khác biệt giữa alpha và beta thalassemia là rất quan trọng trong việc chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ.

II. Thách Thức Chẩn Đoán Thalassemia ở Cấp Độ Phân Tử 58 ký tự

Việc chẩn đoán thalassemia ở cấp độ phân tử gặp nhiều thách thức, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Một trong những thách thức lớn nhất là sự đa dạng của các đột biến gen globin. Với hơn 500 đột biến đã được xác định, việc sàng lọc và xác định tất cả các đột biến có thể tốn kém và mất thời gian. Hơn nữa, một số đột biến phổ biến hơn ở một số khu vực địa lý hoặc dân tộc so với những khu vực khác. Điều này đòi hỏi các phòng thí nghiệm phải điều chỉnh các xét nghiệm sàng lọc của mình để phù hợp với các đột biến phổ biến nhất trong khu vực của họ. Một thách thức khác là chi phí của các xét nghiệm chẩn đoán phân tử. Các xét nghiệm như giải trình tự gen và PCR có thể đắt tiền, khiến chúng không thể tiếp cận được với nhiều bệnh nhân, đặc biệt ở các nước có nguồn lực hạn chế. Cuối cùng, cần có các chuyên gia được đào tạo để thực hiện và diễn giải các xét nghiệm chẩn đoán phân tử. Sự thiếu hụt các chuyên gia có trình độ có thể là một rào cản lớn đối với việc chẩn đoán thalassemia ở cấp độ phân tử.

2.1. Đa Dạng Đột Biến Gen Globin Khó Khăn trong Sàng Lọc

Sự đa dạng của các đột biến gen globin gây ra những khó khăn đáng kể trong quá trình sàng lọc. Với hàng trăm đột biến khác nhau có thể gây ra bệnh thalassemia, việc phát triển các xét nghiệm sàng lọc hiệu quả và toàn diện là một thách thức lớn. Các xét nghiệm sàng lọc lý tưởng nên có khả năng phát hiện tất cả các đột biến phổ biến trong một quần thể cụ thể, đồng thời giảm thiểu số lượng kết quả dương tính giả. Tuy nhiên, việc đạt được sự cân bằng này có thể khó khăn, đặc biệt là ở các khu vực có nhiều đột biến hiếm hoặc chưa được biết đến. Các kỹ thuật sàng lọc hiện đại như Multiplex PCR và Reverse Dot Blot đang được sử dụng rộng rãi để phát hiện đồng thời nhiều đột biến phổ biến. Tuy nhiên, các đột biến hiếm có thể không được phát hiện bằng các xét nghiệm sàng lọc này, đòi hỏi các phương pháp chẩn đoán chuyên sâu hơn như giải trình tự gen.

2.2. Chi Phí Xét Nghiệm Rào Cản Tiếp Cận Chẩn Đoán Phân Tử

Chi phí của các xét nghiệm chẩn đoán phân tử là một rào cản lớn đối với việc tiếp cận chẩn đoán thalassemia ở nhiều quốc gia, đặc biệt là ở các khu vực có nguồn lực hạn chế. Các kỹ thuật như giải trình tự gen và Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) có thể tốn kém, khiến chúng không khả thi cho nhiều bệnh nhân. Điều này đặc biệt đúng đối với các xét nghiệm chẩn đoán trước sinh, thường đòi hỏi chi phí cao hơn và cần được thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn. Để giải quyết vấn đề này, cần có các nỗ lực để giảm chi phí của các xét nghiệm chẩn đoán phân tử và làm cho chúng dễ tiếp cận hơn với bệnh nhân và các nhà cung cấp dịch vụ chăm sóc sức khỏe. Điều này có thể đạt được thông qua các sáng kiến như phát triển các xét nghiệm chẩn đoán giá cả phải chăng hơn, tăng cường tài trợ cho các chương trình sàng lọc thalassemia và cải thiện cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển.

III. Giải Pháp Ứng Dụng Multiplex PCR Chẩn Đoán Đột Biến 57 ký tự

Kỹ thuật Multiplex PCR nổi lên như một giải pháp hiệu quả để chẩn đoán đột biến gen globin. Multiplex PCR cho phép khuếch đại đồng thời nhiều đoạn DNA trong một phản ứng duy nhất. Điều này làm giảm đáng kể thời gian và chi phí liên quan đến việc sàng lọc các đột biến khác nhau. Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong chẩn đoán thalassemia, nơi một số đột biến có thể gây ra bệnh. Bằng cách thiết kế các mồi (primer) đặc hiệu cho các đột biến khác nhau, Multiplex PCR có thể xác định sự hiện diện của nhiều đột biến trong một mẫu duy nhất. Điều này cho phép các nhà lâm sàng chẩn đoán nhanh chóng và chính xác thalassemia và xác định loại đột biến cụ thể gây ra bệnh. Thông tin này là rất quan trọng cho tư vấn di truyền và lập kế hoạch điều trị.

3.1. Thiết Kế Mồi Primer Đặc Hiệu Yếu Tố Thành Công

Thiết kế mồi (primer) đóng vai trò then chốt trong sự thành công của kỹ thuật Multiplex PCR. Mồi phải đặc hiệu cho các đột biến gen globin khác nhau để đảm bảo khuếch đại chính xác và tránh các kết quả dương tính giả. Việc thiết kế mồi cần xem xét trình tự DNA của các đột biến mục tiêu và thiết kế các mồi bổ sung và có khả năng liên kết với các vùng này. Ngoài ra, mồi phải được thiết kế để tránh hình thành các dimer mồi hoặc các cấu trúc thứ cấp, có thể cản trở phản ứng PCR. Các thuật toán và phần mềm thiết kế mồi chuyên dụng có thể giúp thiết kế mồi tối ưu cho Multiplex PCR. Một khi mồi đã được thiết kế, chúng cần được kiểm tra tính đặc hiệu và hiệu quả bằng các thí nghiệm PCR tiêu chuẩn trước khi sử dụng trong Multiplex PCR.

3.2. Tối Ưu Hóa Phản Ứng PCR Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu

Tối ưu hóa phản ứng PCR là rất quan trọng để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong Multiplex PCR. Các yếu tố như nồng độ mồi, nhiệt độ ủ, thời gian kéo dài và nồng độ MgCl2 cần được tối ưu hóa để đảm bảo khuếch đại hiệu quả các đoạn DNA mục tiêu. Điều quan trọng là sử dụng một polymerase DNA chất lượng cao có độ chính xác cao để giảm thiểu nguy cơ khuếch đại sai. Ngoài ra, cần thiết lập các biện pháp kiểm soát dương tính và âm tính để theo dõi hiệu suất của phản ứng PCR và xác định bất kỳ sự nhiễm bẩn hoặc sai sót tiềm ẩn nào. Các kỹ thuật PCR thời gian thực có thể được sử dụng để định lượng các đoạn DNA khuếch đại và cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của Multiplex PCR.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Điểm Đột Biến tại Thái Nguyên 57 ký tự

Nghiên cứu này được tiến hành tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên với mục tiêu xác định đặc điểm đột biến gen globin ở bệnh nhân thalassemia. Kết quả cho thấy đã xác định được các đột biến phổ biến gây bệnh α và βthalassemia trong nhóm bệnh nhân tới khám và điều trị tại Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên, Alen CD41/42 chiếm tần số cao nhất trong các đột biến trên gen HBB trong khi alen --SEA chiếm tỷ lệ cao nhất trên gen HBA1 và HBA2. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc sử dụng Multiplex PCR để sàng lọc đột biến gen globin trong khu vực.

4.1. Tần Suất Đột Biến Beta Thalassemia CD41 42 Phổ Biến

Nghiên cứu đã xác định rằng alen CD41/42 là đột biến phổ biến nhất trong gen HBB (beta globin) ở bệnh nhân thalassemia tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng CD41/42 là một trong những đột biến phổ biến nhất gây bệnh beta thalassemia ở Việt Nam. Đột biến này dẫn đến sự thay đổi khung đọc, làm cho protein beta globin bị cắt ngắn và không hoạt động. Hậu quả là, bệnh nhân bị giảm hoặc không có sản xuất chuỗi beta globin, dẫn đến thiếu máu và các biến chứng khác.

4.2. Đột Biến Alpha Thalassemia SEA Chiếm Ưu Thế

Nghiên cứu cũng cho thấy rằng alen --SEA là đột biến phổ biến nhất trong gen HBA1 và HBA2 (alpha globin) ở bệnh nhân thalassemia tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. --SEA là một đột biến xóa đoạn lớn, xóa bỏ cả hai gen alpha globin trên một nhiễm sắc thể. Đột biến này thường gặp ở Đông Nam Á và là nguyên nhân chính gây ra bệnh alpha thalassemia nặng. Bệnh nhân mang đột biến --SEA có thể bị thiếu máu nặng và các biến chứng khác, chẳng hạn như phù thai (hydrops fetalis) nếu cả hai cha mẹ đều mang đột biến này.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Chẩn Đoán Trước Sinh và Tư Vấn 59 ký tự

Thông tin về đặc điểm đột biến gen globin là rất quan trọng cho việc chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền. Bằng cách xác định các đột biến cụ thể mà một cá nhân mang, các nhà lâm sàng có thể đánh giá nguy cơ truyền bệnh cho con cái của họ. Thông tin này có thể được sử dụng để đưa ra các quyết định sáng suốt về việc mang thai và để cung cấp tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng có nguy cơ cao sinh con bị thalassemia. Ngoài ra, chẩn đoán trước sinh có thể được thực hiện để xác định xem thai nhi có bị ảnh hưởng bởi thalassemia hay không, cho phép các cặp vợ chồng lựa chọn chấm dứt thai kỳ hoặc chuẩn bị cho việc điều trị bệnh sau khi sinh.

5.1. Tư Vấn Di Truyền Giúp Các Cặp Vợ Chồng Hiểu Rõ Nguy Cơ

Tư vấn di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc giúp các cặp vợ chồng hiểu rõ nguy cơ sinh con bị thalassemia. Các nhà tư vấn di truyền có thể cung cấp thông tin về các loại thalassemia khác nhau, cách bệnh được di truyền và các lựa chọn chẩn đoán và điều trị. Họ cũng có thể giúp các cặp vợ chồng đánh giá nguy cơ sinh con bị thalassemia và đưa ra các quyết định sáng suốt về việc mang thai. Tư vấn di truyền đặc biệt quan trọng đối với các cặp vợ chồng có tiền sử gia đình mắc thalassemia hoặc những người có nguồn gốc từ các khu vực nơi bệnh phổ biến.

5.2. Chẩn Đoán Trước Sinh Lựa Chọn Sớm cho Gia Đình

Chẩn đoán trước sinh có thể được thực hiện để xác định xem thai nhi có bị ảnh hưởng bởi thalassemia hay không. Có một số phương pháp chẩn đoán trước sinh khác nhau, chẳng hạn như chọc dò ối (amniocentesis) và sinh thiết gai nhau (chorionic villus sampling). Các xét nghiệm này liên quan đến việc lấy một mẫu tế bào từ thai nhi và phân tích DNA để tìm các đột biến gen globin. Nếu thai nhi được xác định là bị ảnh hưởng bởi thalassemia, các cặp vợ chồng có thể lựa chọn chấm dứt thai kỳ hoặc chuẩn bị cho việc điều trị bệnh sau khi sinh. Quyết định thực hiện chẩn đoán trước sinh là một quyết định cá nhân và nên được đưa ra sau khi thảo luận kỹ lưỡng với các nhà cung cấp dịch vụ chăm sóc sức khỏe và các nhà tư vấn di truyền.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tương Lai về Thalassemia 57 ký tự

Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng về đặc điểm đột biến gen globin ở bệnh nhân thalassemia tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. Kết quả nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng Multiplex PCR để sàng lọc và xác định các đột biến phổ biến. Ngoài ra, nghiên cứu làm nổi bật nhu cầu tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của thalassemia và để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Các hướng nghiên cứu trong tương lai có thể bao gồm việc khám phá các liệu pháp gen để điều trị thalassemia và phát triển các phương pháp mới để chẩn đoán và quản lý bệnh. cần tiếp tục nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn để có đủ số liệu quần thể. Các số liệu sẽ gợi ý thiết lập panel sàng lọc phù hợp.

6.1. Tầm Quan Trọng của Nghiên Cứu Quần Thể Lớn hơn

Để hiểu rõ hơn về đặc điểm đột biến gen globin ở các quần thể khác nhau, cần thực hiện các nghiên cứu trên quy mô lớn hơn. Các nghiên cứu này có thể cung cấp thông tin về tần suất của các đột biến khác nhau, mối quan hệ giữa kiểu gen và kiểu hình, và hiệu quả của các phương pháp điều trị khác nhau. Các nghiên cứu quần thể lớn hơn có thể giúp cải thiện việc sàng lọc và chẩn đoán thalassemia và phát triển các phương pháp điều trị cá nhân hóa hơn.

6.2. Liệu Pháp Gen Hy Vọng Điều Trị Dứt Điểm Thalassemia

Liệu pháp gen nổi lên như một phương pháp điều trị đầy hứa hẹn cho thalassemia. Liệu pháp gen nhằm mục đích sửa chữa các đột biến gen globin gây ra bệnh hoặc đưa một bản sao chức năng của gen vào tế bào của bệnh nhân. Một số liệu pháp gen khác nhau đang được phát triển để điều trị thalassemia, và một số trong số chúng đã cho thấy kết quả đầy hứa hẹn trong các thử nghiệm lâm sàng. Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm để đánh giá sự an toàn và hiệu quả lâu dài của các liệu pháp gen này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu để bắt đầu phiên mã mARN (Messenger Acid Ribonuleic); bộ ba xen giữa làm gián đoạn quá trình phiên mã; tín hiệu bổ sung đuôi poly (A) vào mARN. Tầm quan trọng của trật tự các nucleotit là yếu tố quyết định loại Hb, bất kỳ sự thay đổi nào như mất, thêm, thay đổi nucleotit trên gen globin đều tạo ra bất thường mARN từ đó gây nên các dạng bất thường của thalassemia ở mức độ sinh học phân tử [29], [30], [31], [32]. Gen β-globin và đột biến gen β-globin Hình 1. Cấu trúc gen β-globin Họ gen β-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5) có độ dài 60 kilobases (kb) gồm có 5 gen chức năng, sắp xếp theo trật tự từ trái sang phải là ε / γG / γA / δ / β (hình 1.

Gen β-globin có 626 base pair (bp) tham gia mã hóa nằm trên 3 exon là exon 1 (142 bp), exon 2 (223 bp) và exon 3 (261 bp). Độ dài intron 1 là 130 bp và intron 2 là 850 bp. Gen β-globin có cơ chế điều hòa rất phức tạp, hoạt động ở mức độ đơn gen cũng như toàn bộ cụm gen [30]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 9 Đột biến gen β-globin bao gồm: β0 -thalassemia là các đột biến làm mất chức năng gen β-globin nên không tổng hợp được chuỗi β-globin, ví dụ như: đột biến làm tạo thành bộ ba kết thúc sớm như Cd17, Cd35,.

β+ -thalassemia là các đột biến làm giảm chức năng gen β-globin nên giảm tổng hợp chuỗi β-globin ở nhiều mức độ khác nhau, ví dụ như đột biến ở vùng khởi động: -28, -88,. Các biến thể Hb là đột biến điểm làm thay đổi một acid amin, dẫn đến tổng hợp nên các biến thể chuỗi β globin khác tạo Hb bất thường như HbE, HbCs, HbS,. Hiện nay đã phát hiện trên 200 đột biến gen β-globin, chủ yếu là đột biến không mất đoạn. Đột biến tại gen β-globin chiếm trên 75% các đột biến trong cụm gen không α-globin.

Các đột biến mang tính đặc trưng và phân bố khác nhau ở các vùng miền, dân tộc [30], [31] Cơ chế một số dạng đột biến thường gặp của gen β-globin: - Đột biến điểm tại vùng khởi động (promoter): đột biến thay thế nucle- otit tại vị trí TATA hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp chuỗi β-globin so với bình thường, gây β+ -thalassemia, như đột biến: -90 (C > T), -88 (C > T), -28 (A > G) [30], [33]. - Những đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): sự thay thế một nucle- otit trong exon có thể dẫn đến sự tạo thành một trong ba mã kết thúc (UAA, UAG hoặc UGA) làm cho việc dịch mã kết thúc sớm hơn so với bình thường và tạo sản phẩm β-globin không vững bền bị phá hủy ngay trong tế bào, gây bệnh β0-thalassemia như Cd17 (AAG > TAG), Cd35 (TAC > TAA)[31], [33]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 10 - Đột biến tại những trình tự tín hiệu nối (splicing signals): Những đột biến ở vị trí cho nối GT hoặc vị trí nhận nối AG của intron gây cản trở việc nối exon, do đó không tạo được mARN β-globin nên gây β0 -thalassemia như IVS1- 1 (G > T) [30], [31], [33]. - Những đột biến tại vị trí 5, 6 của intron dẫn tới giảm khả năng nối ARN chính xác nhưng còn tổng hợp được chuỗi β-globin gây bệnh β+ -thalassemia như IVS1-5 (G > T), IVS1-6 ( T > C) [30], [31], [33].

- Đột biến ở trong các exon: các đột biến ở exon luôn tạo ra các bất thường bản sao mARN nên gây ra β+-thalassemia như Cd26 (GAG >AAG) tạo HbE [30], [31], [33]. - Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: vị trí AATAAA tại vùng không dịch mã là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di chuyển từ nhân ra tế bào chất để tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein. Các đột biến điểm xảy ra tại vị trí (box) AATAAA sẽ gây β+-thalassemia, như: AATAAA → AATGAA, AATAAA → CATAAA [30], [31], [33]. - Những đột biến khung đọc xảy ra ở các exon: đột biến thêm vào hoặc mất đi một hoặc vài nucleotit, hoặc một đoạn có dẫn đến thay đổi khung đọc mã di truyền làm thay đổi sản phẩm β-globin, như đột biến: Cd8/9 (+G), Cd41/42 (–TTCT), Cd71/72 (+A) gây β0 -thalassemia [30], [31], [33].

Gen α-globin và đột biến gen α-globin Hình 1. Cấu trúc gen α-globin Họ gen α-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) gồm 3 gen chức năng là δ, α1, α2 và 4 gen giả là Ψδ1, Ψα1, Ψα2, θ (hình 1. Gen α1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 11 có chiều dài 840 bp và gen α2 có chiều dài 830 bp. Số lượng chuỗi α- globin được tổng hợp phụ thuộc vào số gen α-globin hoạt động [29].

Mức độ phiên mã của gen α2 gấp 2 đến 3 lần so với gen α1 [31], [34], [35]. Khoảng 40 kb phía trước của cụm gen α globin là một khu vực được gọi là HS-40. Khu vực này có nhiều vị trí nhạy cảm với ADNase và liên quan đến các yếu tố phiên mã. Tính toàn vẹn của HS-40 là rất cần thiết cho sự hoạt động của gen α-globin, nếu bị mất một đoạn trong phần đó có thể làm cả đoạn gen α-globin sau đó không hoạt động được.

Ngoài cấu trúc gen và trình tự của gen α-globin, còn có một số yếu tố phiên mã gen cũng rất quan trọng. Các yếu tố điều hòa hoạt động gen α-globin bằng cách gắn vào promoter gen α-globin và/hoặc với vị trí tương tác protein gắn ADN tại vùng HS-40 hoặc cấu trúc nhiễm sắc thể (ví dụ như gen ATRX trên nhiễm sắc thể 13) [29]. Vì thế, những trường hợp mất đoạn vùng HS-40 cũng gây ra α-thalassemia, trong khi cả 2 gen α-globin đều còn nguyên vẹn [29], [31]. Cơ chế một số dạng đột biến thường gặp của gen α-globin: Đột biến gây bệnh α-thalassemia bao gồm đột biến mất đoạn và đột biến điểm.

Đột biến mất đoạn có 2 dạng là đột biến đoạn lớn làm mất cả 2 gen α và đột biến đoạn nhỏ làm mất 1 gen α. Hiện nay đã phát hiện được trên 300 đột biến, trong đó đột biến mất đoạn là chủ yếu (khoảng 90%) [29], [36]. Đột biến α+ -thalassemia: là đột biến làm mất 1 gen α-globin trên 1 nhiễm sắc thể (kiểu gen: -α). Có một số kiểu đột biến α+ -thalassemia, trong đó phổ biến nhất là đột biến mất đoạn 3.

Đột biến α0 -thalassemia: là đột biến mất cả 2 gen α trên 1 nhiễm sắc thể (kiểu gen: --). Hiện nay đã xác định được khoảng 50 loại đột biến mất đoạn 2 gen globin gồm mất 1 phần gen trên cả 2 gen α, mất hoàn toàn cả 2 gen α hoặc mất cả 2 gen α và gen δ làm mất hoàn toàn quá trình tổng hợp chuỗi α-globin [29].Các đột biến α0 -thalassemia phổ biến ở khu vực Đông Nam Á bao gồm: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 12 --SEA, --THAI, --FIL ởkhuvực Địa Trung Hải là -- MED. Đồng hợp tử các đột biến α0-thalassemia gây Hb Bart’s, dị hợp tử α0 -thalassemia với α+thalassemia gây ra HbH [29], [31]. Đột biến không mất đoạn: là các đột biến tại 1 hoặc vài nucleotit làm tổng hợp ra các biến thể chuỗi α-globin (kiểu gen: αTα hoặc ααT).

Các đột biến điểm chủ yếu ở trong vùng HS-40 và trong gen α1, α2. Hiện nay người ta đã xác định được 69 đột biến điểm liên quan đến biểu hiện của gen α globin [29]. Điển hình trong nhóm đột biến điểm là đột biến thay thế T thành C ở bộ 3 kết thúc làm bộ 3 kết thúc dịch mã từ TAA chuyển thành CAA (mã hóa cho acid amin glutamin) vì vậy ribosom tiếp tục dịch mã đến khi nó chạm vào mã kết thúc tiếp theo trong khung đọc. Kết quả 1 chuỗi α-globin bị kéo dài thêm 31 acid amin so với phân tử 141 acid amin của chuỗi α-globin ban đầu tạo nên Hb Constant Spring (HbCs), đây là đột biến điểm phổ biến nhất ở Đông Nam Á (chiếm khoảng 4% các đột biến α-globin) [29], [31].

Ngoài ra, còn có các đột biến khác làm tổng hợp các protein bất thường như đột biến α2 codon 125 (T > C) tạo Hb Quong Sze (Qs), đột biến α2 codon 142 (A > T) tạo Hb Pakse cũng gặp ở người Đông Nam Á [29], [31]. Một số kỹ thuật ứng dụng trong sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen Hiện nay có nhiều phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện đột biến gen globin. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau trong phát hiện các loại đột biến, việc lựa chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào các phòng xét nghiệm [25]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.

Phương pháp PCR cách đoạn (Gap-PCR) Nguyên lý kỹ thuật: Kỹ thuật Gap-PCR sử dụng 1 mồi xuôi và 1 mồi ngược gắn ở hai bên ranh giới của vùng ADN đứt gãy. Với alen bình thường, khoảng cách giữa 2 mồi quá lớn nên không hình thành được sản phẩm ADN.Với alen có đột biến, khoảng cách này đủ ngắn để 2 mồi tạo nên đoạn ADN sản phẩm. Các sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với thang chuẩn ADN và các băng của chứng dương để xác định đột biến của mẫu. Ưu điểm: Kỹ thuật đơn giản, nhanh, chi phí thấp.

Có thể sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi (Multiplex gap – PCR) để chẩn đoán đồng thời nhiều đột biến. Nhược điểm: Chỉ phát hiện được những đột biến mất đoạn đã biết trước trình tự vùng ADN đứt gãy. Ứng dụng: để chẩn đoán các đột biến mất đoạn α-thalassemia như đột -- SEA, -- THAI, --MED, -- FIL, -α3.2 và một vài mất đoạn β thalassemia nhưδβ-thalassemia, HPFH,. Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification – MLPA) Nguyên lý: Kỹ thuật này sử dụng các đoạn dò (probe) có khả năng lai với phân tử ADN đích đặc hiệu.

Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotide có kích thước khác nhau (đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược). Các probe sẽ gắn đặc hiệu vào phân tử ADN đích, sau đó enzyme ligase được thêm vào để nối hai đoạn dò này lại với nhau tạo thành đoạn dò hoàn chỉnh và được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang. Đoạn đệm được thiết kế dài ngắn khác nhau nên khi phản ứng PCR khuếch đại sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN có chiều dài khác nhau và được phân tách bằng điện di mao quản. Nếu gen có đột biến mất đoạn thì không có hiện tượng lai probe và probe đó sẽ không được khuếch đại.