Luận văn: Nghiên cứu đột biến gen FLT3 ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy

Nghiên cứu chi tiết đột biến gen FLT3 ở bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy (AML). Phân tích đặc điểm lâm sàng, ý nghĩa tiên lượng trong điều trị.

• Tác giả: Hoàng Nhật Lệ
• Người hướng dẫn: GS. Phan Tuấn Nghĩa
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Gen FLT3 và vai trò trong bệnh lơ xê mi cấp dòng tủy

Gen FLT3 (FMS related tyrosin kinase) là một gen quan trọng trong bệnh sinh của AML (lơ xê mi cấp dòng tủy). Gen này mã hóa một protein tyrosin kinase có vai trò điều chỉnh sự phát triển và sự phân biệt của các tế bào máu. Khi gen FLT3 bị đột biến, nó dẫn đến sự tích tụ của các tế bào bất thường và gây ra bệnh lơ xê mi cấp. Đột biến gen FLT3 được xem là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng nhất trong AML, ảnh hưởng trực tiếp đến chiến lược điều trị và tiên lượng bệnh. Sự hiểu biết về cấu trúc và chức năng của gen FLT3 là nền tảng cho việc phát hiện và quản lý bệnh nhân AML hiệu quả.

1.1. Cấu trúc và chức năng của gen FLT3

Gen FLT3 nằm trên nhiễm sắc thể 13 và mã hóa một receptor tyrosin kinase (RTK) có vai trò trong sự tăng trưởng và sự phân biệt của các tế bào tiền thân tủy. Protein FLT3 bao gồm một miền ngoài tế bào, một miền xuyên màng và một tyrosin kinase domain (TKD) ở phía trong tế bào. Chức năng chính của FLT3 là nhận tín hiệu từ FLT3 ligand, kích hoạt các con đường tín hiệu trong tế bào để điều chỉnh sự tăng trưởng và phân biệt bình thường của các tế bào máu.

1.2. Ý nghĩa của đột biến gen FLT3 trong tiên lượng AML

Đột biến FLT3-ITD (Internal tandem duplication) là loại đột biến phổ biến nhất, chiếm khoảng 20-25% bệnh nhân AML người lớn. Các bệnh nhân mang đột biến FLT3 thường có tiên lượng xấu hơn, tỷ lệ tái phát cao và thời gian sống không bệnh ngắn hơn. Theo tiêu chí của NCCN, sự có mặt của đột biến FLT3-ITD được phân loại là yếu tố nguy cơ cao, yêu cầu các chiến lược điều trị tích cực hơn và theo dõi chặt chẽ.

II. Các loại đột biến trên gen FLT3

Trên gen FLT3 có nhiều loại đột biến khác nhau, trong đó hai loại chính là FLT3-ITD và FLT3-TKD. Đột biến FLT3-ITD xảy ra khi có sự lặp lại các đoạn DNA nội bộ trên gen FLT3, dẫn đến tăng số bản sao của các exon. Loại đột biến này làm cho protein FLT3 bị kích hoạt liên tục, gây ra sự tăng trưởng không kiểm soát của các tế bào bạch cầu. Đột biến FLT3-TKD xảy ra ở miền tyrosin kinase và cũng gây ra kích hoạt liên tục của protein. Mỗi loại đột biến có những đặc điểm lâm sàng và tiên lượng khác nhau, đòi hỏi cách tiếp cận điều trị khác biệt.

2.1. Đột biến FLT3 ITD và đặc điểm lâm sàng

FLT3-ITD (Internal tandem duplication) là loại đột biến làm tăng độ dài của gen FLT3. Bệnh nhân có đột biến FLT3-ITD thường biểu hiện với số lượng bạch cầu cao, tình trạng thiếu máu nặng và số lượng tiểu cầu thấp. Các nghiên cứu cho thấy bệnh nhân AML có FLT3-ITD có tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn (LBHT) thấp hơn và thời gian sống toàn bộ ngắn hơn so với nhóm không có đột biến.

2.2. Đột biến FLT3 TKD và ý nghĩa lâm sàng

Đột biến FLT3-TKD xảy ra ở miền TKD và chiếm khoảng 7% bệnh nhân AML. Loại đột biến này cũng gây ra kích hoạt liên tục nhưng mức độ thường ít nghiêm trọng hơn so với FLT3-ITD. Tuy nhiên, bệnh nhân có FLT3-TKD vẫn có tiên lượng xấu hơn nhóm không có đột biến. Phát hiện sớm các loại đột biến FLT3 là cần thiết để điều chỉnh phác đồ điều trị và theo dõi bệnh hiệu quả.

III. Phương pháp phát hiện đột biến gen FLT3

Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện đột biến gen FLT3 được áp dụng trong chẩn đoán AML. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật cơ bản, dùng để nhân bản đoạn DNA mã hóa gen FLT3. Sau đó, sản phẩm PCR được phân tách bằng điện di gel agarose hoặc điện di mo毛细管 để phát hiện sự thay đổi kích thước do đột biến ITD. Xác định trình tự gen theo nguyên lý Sanger cho phép phát hiện chi tiết các loại đột biến, đặc biệt là đột biến FLT3-TKD. Các phương pháp hiện đại như real-time PCR và sequencing thế hệ mới (NGS) cung cấp độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn.

3.1. Phương pháp PCR và điện di phát hiện FLT3 ITD

Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân bản vùng gen FLT3 chứa vị trí đột biến ITD. Sản phẩm PCR FLT3-ITD thường tạo ra hai dải: một dải từ allele bình thường (khoảng 330 bp) và một dải dài hơn từ allele mang đột biến ITD. Điện di gel agarose cho phép quan sát trực quan sự chênh lệch kích thước. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và có chi phí thấp, do đó được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán lâm sàng.

3.2. Xác định trình tự gen và phương pháp sequencing hiện đại

Xác định trình tự gen FLT3 bằng phương pháp Sanger cho phép phát hiện chính xác các loại đột biến, bao gồm cả FLT3-TKD và các đột biến điểm khác. Phương pháp sequencing thế hệ mới (NGS) có độ nhạy cao, có thể phát hiện những đột biến hiếm và cung cấp thông tin chi tiết về gánh nặng của khối u. Các phương pháp này đặc biệt hữu ích trong các trường hợp phức tạp và untuk theo dõi sự phát triển của bệnh trong quá trình điều trị.

IV. Ứng dụng lâm sàng và tiên lượng của đột biến FLT3 trong AML

Phát hiện đột biến gen FLT3 có ý nghĩa quan trọng trong quản lý và điều trị bệnh nhân AML. Sự có mặt của đột biến FLT3-ITD là một chỉ số tiên lượng xấu độc lập, liên quan đến tỷ lệ sống toàn bộ ngắn hơn và tỷ lệ tái phát cao. Theo hướng dẫn của NCCN, bệnh nhân AML có FLT3-ITD được phân loại vào nhóm nguy cơ cao, yêu cầu các phác đồ điều trị tích cực hơn, bao gồm liệu pháp nhắm mục tiêu FLT3 như inhibitor FLT3. Thông tin về đột biến FLT3 cũng giúp các bác sĩ lựa chọn liệu pháp phù hợp nhất, từ hóa trị liệu truyền thống đến liệu pháp nhắm mục tiêu và ghép tủy xương.

4.1. Phân tầng nguy cơ và chiến lược điều trị theo FLT3

Bệnh nhân AML có FLT3-ITD được phân loại vào nhóm nguy cơ cao theo tiêu chí NCCN, yêu cầu chiến lược điều trị tích cực. Các inhibitor FLT3 như sorafenib, midostaurin và quizartinib đã được phát triển để ức chế hoạt động của protein FLT3 đột biến. Ghép tủy xương từ tế bào gốc là lựa chọn điều trị ưu tiên cho bệnh nhân AML có FLT3-ITD ở tuổi thích hợp. Theo dõi định kỳ sự có mặt của đột biến FLT3 trong quá trình điều trị giúp đánh giá đáp ứng điều trị.

4.2. Theo dõi bệnh và dự báo kết quả điều trị

Phát hiện lại đột biến FLT3 sau điều trị có thể báo hiệu sự tái phát bệnh. Các nghiên cứu cho thấy bệnh nhân AML mà đột biến FLT3 vẫn tồn tại sau khi điều trị có tiên lượng xấu hơn. Theo dõi mức độ của đột biến FLT3 (burden of FLT3-ITD) bằng các phương pháp định lượng giúp dự báo đáp ứng điều trị. Liên kết kết quả đột biến FLT3 với các yếu tố tiên lượng khác như bất thường về nhiễm sắc thể cho phép dự báo kết quả điều trị chính xác hơn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Lơ xê mi cấp dòng tủy (AML-Acute Myelogenic Leukemia) là một bệnh lý đơn dòng ác tính của tổ chức sinh máu, bệnh được đặc trưng bởi sự tăng sinh của các tế bào non (blast) bất thường, chủ yếu ở trong tủy xương và ở máu ngoại vi có các tế bào non ác tính. Những tế bào này lấn át tế bào bình thường và ức chế quá trình trưởng thành và phát triển của các dòng tế bào bình thường trong tủy xương [2,14,21]. Theo các nghiên cứu trên thế giới, hơn 80% các đột biến gen được tìm thấy ở bệnh nhân mắc AML xảy ra ở 3 gen nucleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) và CCAAT- enhancer binding protein alpha (CEBPA) [29,30,32,40]. Khoảng 30% tổng số bệnh nhân mắc AML với kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường bị đột biến gen FLT3, hậu quả là enzyme tyrosine kinase này luôn luôn ở trạng thái hoạt động mà không cần dimer hóa, dẫn đến rối loạn quá trình phát triển và biệt hóa tế bào máu.

Nhiều nhóm nghiên cứu FLT3 đã phát hiện ra hai kiểu đột biến thường gặp nhất trên gen này là lặp đoạn nội phân tử (ITD - internal tandem duplication) và đột biến điểm gây thay thế acid amin aspartic ở vị trí 835 thuộc vùng tyrosine kinase [38,42,49,55]. Tỷ lệ mắc bệnh LXM cấp ở Mỹ năm 2012 khoảng 3-5 trường hợp trong 100.0 dân, chiếm khoảng 3% tổng số các bệnh ung thư. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Bạch Quốc Khánh và cộng sự năm 2012 lơ xê mi cấp chiếm tỷ lệ 41,5% trong các bệnh máu. Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi, ở cả hai giới.

Tuy nhiên bệnh có xu hướng gặp nhiều hơn ở trẻ em và người già [7]. Nhóm AML thường gặp ở người lớn trong khi đó, nhóm LXM cấp dòng lympho chiếm 75-80% LXM cấp ở trẻ em Trước đây việc chẩn đoán AML chủ yếu dựa vào hình thái học tế bào, hóa học tế bào kết hợp với triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân do đó việc phân loại AML còn gặp nhiều khó khăn đối với bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể bình thường thì không phát hiện được những tổn thương trên gen để có định hướng điều trị. Tuy vậy, hầu như chưa có các nghiên cứu đi sâu phân tích các dạng đột biến cụ thể gây nên bệnh AML. Chính vì vậy việc áp dụng các phương pháp phân tích 1 DNA để xác định và phát hiện các loại đột biến ở bệnh nhân AML là rất cần thiết và có ý nghĩa giá trị thực tiễn thiết thực trong chẩn đoán bệnh.

Đề tài: ˝Nghiên cứu đột biến trên gen FLT3 ở một số bệnh nhân lơ xê mi cấp dòng tủy” của chúng tôi được đặt ra nhằm mục tiêu: 1. Xác định tỷ lệ đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân bị bệnh lơ xê mi cấp dòng tủy. Bƣớc đầu xác định các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các bệnh nhân có đột biến này. 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Giới thiệu chung về AML Lơ xê mi cấp dòng tủy (AML) là một trong các loại ung thư máu ác tính nhất và tiến triển rất nhanh. Nguyên nhân phát sinh bệnh là do các thay đổi bất thường (đột biến) dẫn đến làm rối loạn quá trình sản sinh bạch cầu, loại tế bào chịu trách nhiệm bảo vệ cơ thể thông qua các cơ chế miễn dịch, tạo ra những bạch cầu bất thường với tốc độ nhanh chóng. Bệnh nhân AML, nếu không được chẩn đoán, điều trị kịp thời và phát hiện sớm sẽ tử vong [14,19]. Lịch sử phát hiện AML Năm 1827, bác sỹ Velpeau người Pháp đã mô tả một người bán hoa 63 tuổi mang một căn bệnh đặc trưng tiến triển bởi sốt, suy nhược, sỏi thận, gan to, lách to.

Velpeau ghi nhận máu của bệnh nhân này giống “như cháo”, ông tiên đoán hiện tượng này là do số lượng bạch cầu rất nhiều ở trong máu bệnh nhân. Năm 1845, Bennett mô tả một loạt bệnh nhân tử vong có triệu chứng lách to, máu thay đổi về màu sắc và tăng độ quánh. Ông cũng sử dụng thuật ngữ „leucocythemia‟ chỉ đặc điểm ở những bệnh nhân này có dày đặc bạch cầu trong máu ngoại vi. Năm 1856, thuật ngữ "bệnh bạch cầu" được đặt ra bởi Rudolf Virchow, nhà bệnh lý học nổi tiếng người Đức, ông cũng là người tiên phong trong việc sử dụng kính hiển vi quang học để đọc công thức máu của bệnh nhân, Virchow là người đầu tiên mô tả các bất thường của các tế bào máu trắng ở bệnh nhân có hội chứng lâm sàng đã được mô tả bởi Velpeau và Bennett.

Virchow đã không tìm ra được nguyên nhân của việc sản sinh quá nhiều tế bào bạch cầu, ông đã sử dụng thuật ngữ mô tả "bệnh bạch cầu" (tiếng Hy Lạp: "máu trắng") để chỉ tình trạng này. Năm 1877, Paul Ehricl đã tìm ra phương pháp nhuộm tiêu bản và đưa phương pháp này vào việc mô tả sự khác thường giữa bạch cầu bình thường và bất thường ở bệnh nhân. 3 Năm 1879, Mosler là người đầu tiên đã đưa kỹ thuật xét nghiệm tủy xương vào chẩn đoán đối với những bệnh nhân có triệu chứng xuất huyết và thiếu máu ở trên. Năm 1889, Wilhelm Ebstein đã dùng thuật ngữ (leukemia-lơ xê mi cấp) với triệu chứng bệnh tiến triển nhanh, tiên lượng xấu để chẩn đoán phân biệt với lơ xê mi mạn.

Năm 1900, Naegeli gọi myeloblast là tế bào ác tính trong bệnh lơ xê mi cấp và chia lơ xê mi cấp thành dòng tủy (AML) và dòng lympho (ALL). Năm 1976, FAB đã đưa ra phân loại AML dựa vào hình thái học và hóa học tế bào [31]. Năm 2001, WHO đã đưa ra phân loại lơ xê mi cấp để chẩn đoán xác định về tế bào blast đã giảm xuống còn ≥ 20% tổng số tế bào có nhân trong tủy được chẩn đoán xác định so với tiểu chuẩn của FAB (1986) tế bào blast ≥ 30%. Năm 2008, WHO đã đưa ra phân loại mới dựa trên tổn thương gen để chẩn đoán và đánh giá tiện lượng của bệnh đề ra phương pháp điều trị thích hợp.

Phân loại bệnh AML AML có nhiều thể loại khác nhau, phân loại dựa vào các đặc điểm hình thái học, hóa học tế bào, các dấu ấn miễn dịch trên bề mặt tế bào, các đột biến về mặt di truyền và gen. Trong bảng phân loại của WHO năm 2001 có nhiều thể bệnh AML với các rối loạn về di truyền, bất thường trên gen từ đó giúp cho việc chẩn đoán được tiên lượng về bệnh rõ ràng hơn [31]. Năm 2008 WHO đã đưa ra phân loại mới về AML mở rộng hơn so với phân loại của WHO năm 2001 với một số bệnh đáng chú ý, trong đó đặc biệt một số gen được đưa vào để xác định AML (bảng 1.1), gen FLT3 mặc dù chưa được đưa vào chính thức để áp dụng trong chẩn đoán, nhưng cũng được khuyến cáo nên tiến hành xét nghiệm trong điều kiện cho phép [56]. Phân loại AML 2001 và 2008 của WHO Phân loại WHO 2008 – AML Phân loại WHO 2001 – AML 1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay gặp 1.Lơ xê mi cấp bất thường gen hay gặp AML có t(8;21)(q22;q21); RUNX1- AML với t(8;21) (q22;q21); RUNX1T1 (AML/ETO) AML inv(16)(p13.1q22) hoặc AML inv(16)(p13.2); RPN1- EV11 AML t(1;22)(p13;q13); RBM15- MKL1 AML có đột biến gen NPM1 AML có đột biến gen CEBPA 2.

AML liên quan đến thay đổi rối loạn sinh 2.AML liên quan đến thay đổi rối loạn tủy sinh tủy có đột biến đa dòng 3. AML thứ phát sau điều trị các bệnh ác tính 3. AML liên quan đến điều trị 4. AML không phân loại 4.

AML không phân loại AML với sự khác biệt tối thiểu M0 AML với sự khác biệt tối thiểu M0 AML không có sự trưởng thành M1 AML không có sự trưởng thành M1 AML dòng tủy mono M4 AML dòng tủy mono M4 AML dòng mono M5 AML dòng mono M5 AML dòng hồng cầu M6 AML dòng hồng cầu M6 5 Phân loại WHO 2008 – AML Phân loại WHO 2001 – AML AML dòng mẫu tiểu cầu M7 AML dòng mẫu tiểu cầu M7 AML dòng bạch cầu ưa baso AML dòng bạch cầu ưa baso AML tăng sinh toàn bộ xơ AML tăng sinh toàn bộ xơ Myeloid sarcoma (mô liên kết) Myeloid sarcoma (mô liên kết) 5. Tăng sinh tủy liên quan đến hội chứng Down 6. Blastics plasmacytoid dendrictic cell neoplasm 1. Phân loại bệnh theo FAB Phân loại AML đã được sử dụng rộng rãi từ năm 1976 cho đến nay và dựa trên chủ yếu là phân loại bằng hình thái học tế bào và hóa học tế bào.

Người ta phân loại thành 8 thể sau: * Thể M0: AML thể không biệt hóa trong đó có tế bào non bất thường ≥ 90%, - Tế bào tiền tủy bào < 3%. * Thể M1: AML thể chưa trưởng thành (AML without maturation): - ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen. - ≥ 90% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast. - ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.

- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào. * Thể M2: AML thể trưởng thành (AML with maturation, hình 1.1): - ≥ 5% blast dương tính với MPO và/hoặc Sudan đen. - ≤ 89% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu tủy xương là blast. - ≤ 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu.

- ≤ 10% tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào. Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M2 * Thể M3: AML thể tiền tuỷ bào (acute promyelocytic leukemia, hình 1.2): - ≥ 5% blast dương tính với MPO và hoặc Sudan đen. - < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu. Đại đa số tế bào có nhân tủy xương là tiền tuỷ bào, có nhiều hạt đặc hiệu trong bào tương.

Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M3 * Thể M4: Lơ xê mi cấp tuỷ - mono (acute myelomonocytic leukemia, hình 1.3): 7 - Các phương pháp nhuộm MPO, Sudan đen, Esterase không đặc hiệu dương tính với hai quần thể tế bào. - < 50% tế bào có nhân tủy xương thuộc dòng hồng cầu. - ≥ 30% là blast, tế bào dòng tuỷ (kể cả blast) chiếm 30 - 80%. - 5% tế bào có nhân không thuộc dòng hồng cầu/lympho là bạch cầu ưa acid thì xếp vào thể M4eo.

Hình ảnh Lơ xê mi cấp thể M4 * Thể M5: Lơ xê mi cấp dòng mono (acute monoblastic leukemia, hình 1.4): - MPO và Sudan đen âm tính hoặc dương tính yếu. Esterase MPO và Sudan đen âm tính hoặc dương tính yếu, esterase đặc hiệu dương tính mạnh và không bị ức chế bởi NaF. - Trong thể M5 người ta chia thành 2 loại M5a và M5b. - Trong đó M5a: tế bào blast biệt hóa, trở thành monocyte non, nguyên sinh chất chiếm tỷ lệ cao.