Đánh Giá Tính Chất Chống Oxy Hóa và Kháng Khuẩn của Chiết Xuất Từ Lá Breynia Vitis-Idaea

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu công nghệ sinh học evaluation of in vitro antioxidant and antibacterial properties of fractionated, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Nguyễn Thị Lan Hương
• Người hướng dẫn: Phó Giáo Sư Tiến Sĩ Nguyễn Thị Thu Hương
• Trường học: Ho Chi Minh City University of Technology
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh Giá Tính Chất Chống Oxy Hóa và Kháng Khuẩn của Chiết Xuất Từ Lá Breynia Vitis-Idaea
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Ho Chi Minh City

Mục lục chi tiết

• PREFACE
• 1. CHƯƠNG 1: GENERAL VIEW ABOUT BREYNIA VITIS-IDAEA
• 1.1. General introduction
• 1.2. Botanical description of B.
• 1.2.1. Feature of growth and development
• 1.2.2. Feature of distribution
• 1.3. Preliminary phytochemical components of B. vitis-idaea
• 1.4. Traditional ethno-medicinal use of B.
• 1.5. Overview of ØÏỢCOSI©
• 2. CHAPTER 2: MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Material, chemical and apparatus
• 2.2. Media and chemicals
• 2.3. Content Of €XD€TITTI€TIES
• 2.4. Analyze preliminary phytochemical COMPOSItON
• 2.5. Obtain fractionated extracts and evaluate antioxidant and antibacterial activity Of CACH €XÍTACẲ
• 2.6. Enzyme-assisted ©X{fACẨIOI
• 2.7. Isolation, refinement and structure determination of compound
• 2.8. Identification of herbal DÏATIE
• 2.8.1. Moisture content and total ash content of material
• 2.8.2. Experiments of preliminary phytochemical composIfIon
• 2.8.3. Bioactivities of fractionated €XÍTACẨS
• 2.8.4. Enzyme-assIsted €XITACẨIOIN
• 2.8.5. Effect of enzyme conC€rIfFAfIOTIS
• 2.8.6. Effect of treatment ẨIT ©
• 2.8.7. Results of purification and structure determination of compounds
• 2.8.8. Results of thin layer chromatography analysis
• 2.8.9. Results after running column chromatography. Purification of fraction [Ñ
• 2.9. Structure determination of the FI8C1 by spectrometry
• 2.10. Characteristic of object Of StUCY
• 2.11. Extraction mme€thOỞ
• 2.12. Antimicrobial aC[IVIẨY
• 3. CONCLUSION AND PETITION
• APPENDIX

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đánh Giá Tính Chất Chống Oxy Hóa

Đánh giá tính chất chống oxy hóa của chiết xuất từ lá Breynia vitis-idaea là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong ngành công nghệ sinh học. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về các hoạt chất sinh học có trong lá mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong y học và thực phẩm. Các chiết xuất từ lá Breynia đã cho thấy khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do.

1.1. Tính Chất Chống Oxy Hóa Của Chiết Xuất

Chiết xuất từ lá Breynia vitis-idaea đã được chứng minh có khả năng quét gốc tự do hiệu quả. Các phương pháp thử nghiệm như DPPH và ABTS cho thấy chiết xuất ethyl acetate có hoạt tính cao nhất với giá trị IC50 đạt 99.66 µg/ml.

1.2. Ý Nghĩa Của Tính Chất Chống Oxy Hóa

Tính chất chống oxy hóa không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe mà còn có thể ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm. Việc khai thác các chiết xuất tự nhiên từ Breynia có thể mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Tính Chất Kháng Khuẩn

Nghiên cứu về tính chất kháng khuẩn của chiết xuất từ lá Breynia vitis-idaea gặp nhiều thách thức. Các vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng, đòi hỏi các nghiên cứu phải tìm ra những giải pháp mới và hiệu quả hơn. Việc xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chiết xuất là cần thiết để phát triển các phương pháp điều trị mới.

2.1. Các Vi Khuẩn Thử Nghiệm

Các vi khuẩn như Staphylococcus aureus và MRSA được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất. Kết quả cho thấy chiết xuất ethyl acetate có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn này với giá trị MIC thấp.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Chiết Xuất

Quá trình chiết xuất và phân lập các hợp chất sinh học từ lá Breynia gặp khó khăn do sự đa dạng của các hợp chất có trong lá. Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất là cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tính Chất Chống Oxy Hóa

Phương pháp nghiên cứu tính chất chống oxy hóa của chiết xuất từ lá Breynia vitis-idaea bao gồm các bước chiết xuất, phân lập và thử nghiệm hoạt tính. Các phương pháp như chiết xuất bằng dung môi và enzyme được áp dụng để tối ưu hóa quy trình chiết xuất.

3.1. Quy Trình Chiết Xuất

Quy trình chiết xuất bao gồm việc sử dụng dung môi như ethyl acetate, n-butanol và ethanol. Mỗi loại dung môi cho ra các hoạt chất khác nhau, ảnh hưởng đến tính chất chống oxy hóa của chiết xuất.

3.2. Phân Tích Hoạt Tính Chống Oxy Hóa

Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua các phương pháp DPPH và ABTS. Kết quả cho thấy chiết xuất từ lá Breynia có khả năng quét gốc tự do mạnh mẽ, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực dược phẩm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tính Chất Kháng Khuẩn

Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ lá Breynia vitis-idaea có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể. Các thử nghiệm cho thấy chiết xuất ethyl acetate có hiệu quả cao nhất trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh.

4.1. Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Chiết Xuất

Chiết xuất ethyl acetate cho thấy giá trị MIC thấp nhất, cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ đối với Staphylococcus aureus và MRSA. Điều này chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của chiết xuất trong điều trị nhiễm khuẩn.

4.2. Ứng Dụng Thực Tiễn

Các chiết xuất từ lá Breynia có thể được phát triển thành các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên, góp phần vào việc giảm thiểu tình trạng kháng thuốc hiện nay.

V. Kết Luận Về Tính Chất Chống Oxy Hóa và Kháng Khuẩn

Nghiên cứu về tính chất chống oxy hóa và kháng khuẩn của chiết xuất từ lá Breynia vitis-idaea đã chỉ ra rằng đây là một nguồn tài nguyên quý giá cho y học. Các hoạt chất sinh học có trong lá có thể được khai thác để phát triển các sản phẩm mới.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất sinh học trong chiết xuất từ lá Breynia. Điều này sẽ giúp mở rộng hiểu biết về tiềm năng dược lý của loại cây này.

5.2. Khuyến Nghị Ứng Dụng

Khuyến nghị phát triển các sản phẩm từ chiết xuất lá Breynia trong lĩnh vực thực phẩm chức năng và dược phẩm, nhằm tận dụng tối đa các lợi ích sức khỏe mà nó mang lại.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh y học hiện đại đối mặt với tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ tự nhiên trở thành xu hướng tất yếu. Theo các báo cáo y tế, hơn 80% dân số tại các quốc gia đang phát triển vẫn dựa vào nguồn dược liệu cổ truyền để chăm sóc sức khỏe ban đầu, và Việt Nam hiện sở hữu hệ thực vật vô cùng phong phú với hơn 5.000 loài có tiềm năng làm thuốc. Cây Cù đè (tên khoa học: Breynia vitis-idaea (Burm. f.) C. Fischer, thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae) từ lâu đã được nhân dân sử dụng trong các bài thuốc dân gian để điều trị xuất huyết, đau dạ dày, viêm amidan, viêm phế quản mãn tính và làm lành vết thương.

Tuy nhiên, nguồn tài nguyên này phần lớn chỉ được ghi nhận theo kinh nghiệm dân gian mà thiếu các chứng minh khoa học thực nghiệm bài bản tại Việt Nam. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân tích thành phần hóa thực vật sơ bộ, đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua các mô hình in vitro, khảo sát khả năng kháng khuẩn trên 6 chủng vi sinh vật kiểm chuẩn, đồng thời đánh giá vai trò của enzyme Viscozyme L trong quá trình trích ly và phân lập hợp chất tinh khiết có hoạt tính sinh học.

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên mẫu lá thu hái tại xã Mỹ Thạnh Đông, huyện Đức Huệ, tỉnh Long An trong mốc thời gian từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015 tại Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM phối hợp cùng Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài thể hiện qua việc cung cấp các thông số định lượng chính xác về hoạt tính quét gốc tự do với chỉ số IC50 đạt dưới 100 µg/ml và nồng độ ức chế tối thiểu MIC từ 1,0 mg/ml đến 1,5 mg/ml, tạo tiền đề vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm dược - mỹ phẩm sinh học từ nguồn thảo dược bản địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng của 3 lý thuyết và mô hình cốt lõi:

Thứ nhất, lý thuyết cơ chế chống oxy hóa tự nhiên, tập trung vào hai cơ chế khử gốc tự do chính là chuyển đổi nguyên tử hydro (Hydrogen Atom Transfer - HAT) và chuyển điện tử đơn lẻ (Single Electron Transfer - SET). Mô hình này giải thích khả năng trung hòa các gốc tự do bền vững như DPPH và ABTS cation của các hợp chất phenolic và flavonoid.

Thứ hai, mô hình ức chế vi sinh vật theo nồng độ tối thiểu (MIC/MBC), dựa trên nguyên lý tương tác giữa các phân tử có hoạt tính kháng sinh tự nhiên với màng tế bào vi khuẩn Gram âm và Gram dương, dẫn đến ức chế tăng sinh hoặc phá hủy cấu trúc tế bào vi khuẩn.

Thứ ba, nguyên lý trích ly có sự hỗ trợ của enzyme (Enzyme-Assisted Extraction), dựa trên cơ chế phân giải các liên kết polysaccharide phức tạp trong thành tế bào thực vật bằng phức hợp carbohydrase nhằm giải phóng tối đa các hợp chất thứ cấp. Các khái niệm trung tâm bao gồm: hoạt chất glycoside, phân đoạn chiết phân cực, chỉ số nồng độ ức chế bán phần IC50 và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ 200 g bột lá khô Cù đè đạt độ ẩm tiêu chuẩn dưới 13% và hàm lượng tro toàn phần dưới 10%. Cỡ mẫu thực nghiệm được chuẩn hóa và thực hiện lặp lại 3 lần độc lập nhằm đảm bảo độ tin cậy và tính lặp lại thống kê.

Phương pháp chiết xuất phân đoạn áp dụng kỹ thuật ngâm chiết kiệt với ethanol 96%, sau đó chiết lỏng - lỏng phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane, ethyl acetate và n-butanol. Đối với thử nghiệm enzyme, chế phẩm Viscozyme L (hoạt tính 100 FBG/g) được khảo sát ở các dải nồng độ từ 1% đến 6% và thời gian ủ từ 1 đến 4 giờ ở nhiệt độ phòng khoảng 30 độ C.

Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá định tính qua phương pháp khuếch tán đĩa thạch và định lượng bằng phương pháp pha loãng trong thạch (Agar dilution) trên 6 chủng vi khuẩn chuẩn ATCC gồm: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus và Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Lý do lựa chọn phương pháp pha loãng trong thạch là vì tính chính xác cao trong xác định giá trị MIC, không bị ảnh hưởng bởi độ nhớt hay khả năng khuếch tán của các hợp chất cao phân tử.

Quy trình tinh sạch hợp chất sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột silica gel (kích thước cột 4 cm x 60 cm chứa 200 g pha tĩnh silica gel) với hệ dung môi giải ly gradient n-hexane : ethyl acetate : methanol. Cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được giải mã thông qua hệ thống phân tích phổ hiện đại gồm phổ khối lượng độ phân giải cao (HRMS), phổ 1D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phổ 2D-NMR (COSY, HSQC, HMBC) đo ở tần số 500 MHz tại Phòng Phân tích Trung tâm trong khoảng thời gian từ tháng 08 đến tháng 11/2015.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thành phần hóa thực vật sơ bộ cho thấy lá cây Cù đè chứa 8 nhóm hoạt chất tự nhiên quan trọng gồm: alkaloid, flavonoid, tannin, saponin, glycoside tim, triterpenoid tự do, acid hữu cơ và hợp chất khử. Từ 80 g cao chiết ethanol thô ban đầu, quá trình phân đoạn đã thu hồi được 14,2 g cắn ethyl acetate (tương đương hiệu suất trích ly phân đoạn đạt 17,75%) và 0,9 g cắn n-butanol.

Về hoạt tính chống oxy hóa in vitro, phân đoạn ethyl acetate thể hiện năng lực quét gốc tự do vượt trội nhất. Giá trị IC50 của phân đoạn ethyl acetate đối với thử nghiệm DPPH và ABTS lần lượt đạt khoảng 99,66 µg/ml, cao hơn từ 35% đến 50% so với cao chiết ethanol tổng và phân đoạn n-butanol.

Về hoạt tính kháng khuẩn, phân đoạn ethyl acetate thể hiện hoạt tính ức chế mạnh trên các chủng vi khuẩn Gram dương. Đáng chú ý, nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với chủng tụ cầu vàng kháng thuốc MRSA ATCC 43300 và Staphylococcus aureus ATCC 6538 đạt mức 1,0 mg/ml, và đối với Enterococcus faecalis là 1,5 mg/ml. Các phân đoạn hầu như không thể hiện hoạt tính ức chế rõ rệt đối với vi khuẩn Gram âm ở nồng độ khảo sát dưới 2,0 mg/ml.

Về khảo sát trích ly bằng enzyme, việc tiền xử lý mẫu lá bằng Viscozyme L ở nồng độ từ 1% đến 6% trong thời gian 1 đến 4 giờ không đem lại sự gia tăng có ý nghĩa đối với hiệu suất trích ly cắn ethyl acetate (dao động trong khoảng 7,0% đến 7,3%) và không làm tăng hoạt tính sinh học so với mẫu đối chứng không xử lý enzyme.

Từ phân đoạn ethyl acetate, quá trình sắc ký cột phân đoạn và kết tinh phân đoạn đã phân lập thành công một hợp chất tinh khiết có dạng bột vô định hình màu trắng, ký hiệu F18C1. Phân tích quang phổ xác nhận đây là hợp chất 6-O-benzoylarbutin (tên thương mại là eximine) với cấu trúc phân tử hoàn chỉnh gồm khung hydroquinone liên kết glycoside với phân tử glucose và nhóm acyl benzoyl gắn tại vị trí C-6'.

Thảo luận kết quả

Khả năng quét gốc tự do và kháng khuẩn mạnh mẽ của phân đoạn ethyl acetate được giải thích là do sự tập trung của các hợp chất phenolic, flavonoid và dẫn xuất arbutin phân cực trung bình trong pha dung môi này. Cấu trúc hóa học của 6-O-benzoylarbutin chứa đồng thời các nhóm hydroxyl phenol và vòng thơm benzoyl, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng nhường nguyên tử hydro để vô hiệu hóa các chuỗi phản ứng gốc tự do sinh học, đồng thời làm tăng tính thân dầu cục bộ giúp phân tử dễ dàng xâm nhập qua lớp peptidoglycan dày của vi khuẩn Gram dương.

Hiện tượng Viscozyme L không cải thiện hiệu suất trích ly glycoside trong nghiên cứu này có thể xuất phát từ đặc tính cấu trúc thành tế bào lá Cù đè chứa hàm lượng sáp và cutin cao, cản trở sự tiếp xúc tối ưu của các enzyme carbohydrase hòa tan trong nước.

Khi so sánh với các công bố quốc tế tại Ấn Độ và Trung Quốc, kết quả này hoàn toàn tương thích về phổ kháng khuẩn của chi Breynia, nhưng mang tính đột phá khi lần đầu tiên xác nhận sự hiện diện và phân lập thành công 6-O-benzoylarbutin từ lá cây Cù đè sinh trưởng tại điều kiện thổ nhưỡng miền Nam Việt Nam.

Để tối ưu hóa tính trực quan trong công bố khoa học, toàn bộ động học quét gốc tự do DPPH và ABTS có thể được mô hình hóa dưới dạng biểu đồ đường cong ức chế phi tuyến tính sigmoid biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ chất chiết (từ 62,5 µg/ml đến 2000 µg/ml) và tỷ lệ ức chế phần trăm. Đồng thời, phổ kháng khuẩn nên được hệ thống hóa trong bảng ma trận so sánh đường kính vòng ức chế (tính bằng mm) và giá trị MIC (tính bằng mg/ml) đối chiếu trực tiếp giữa các dung môi trích ly với các kháng sinh đối chứng chuẩn.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học thu được, 4 giải pháp chiến lược được đề xuất nhằm phát triển chuỗi giá trị của cây Cù đè:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình chiết xuất quy mô bán công nghiệp (pilot) với mẻ nạp từ 10 kg đến 50 kg bột lá khô, sử dụng kỹ thuật chiết phân đoạn ethyl acetate tối ưu để đạt hiệu suất thu hồi hoạt chất 6-O-benzoylarbutin trên 85%, thời gian hoàn thiện trong vòng 6 đến 9 tháng do Trung tâm Sâm và Dược liệu chủ trì.

Thứ hai, triển khai các thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thực nghiệm (chuột nhắt trắng) ở các mức liều từ 100 mg/kg đến 500 mg/kg thể trọng trong thời gian 90 ngày, do Bộ môn Dược lý thuộc các trường đại học y dược phối hợp thực hiện nhằm xác định ngưỡng an toàn tuyệt đối.

Thứ ba, phát triển công thức ứng dụng hoạt chất 6-O-benzoylarbutin và cao chiết ethyl acetate vào các dạng chế phẩm kem bôi da kháng khuẩn trị mụn và serum chống lão hóa sáng da, hướng tới mục tiêu ức chế enzyme tyrosinase trên 70% trong lộ trình 12 tháng tiếp theo do các doanh nghiệp dược - mỹ phẩm đầu tư phát triển.

Thứ tư, xây dựng quy hoạch vùng trồng chuyên canh cây Cù đè đạt chuẩn thực hành tốt nuôi trồng và thu hái dược liệu (GACP-WHO) tại huyện Đức Huệ, tỉnh Long An với quy mô thử nghiệm ban đầu từ 2 đến 5 hecta giai đoạn 2026 - 2028, dưới sự điều phối của Sở Khoa học và Công nghệ địa phương nhằm đảm bảo nguồn cung nguyên liệu ổn định.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị thực tiễn cho 4 nhóm đối tượng cụ thể:

1. Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Hóa dược và Dược học: Sử dụng toàn bộ quy trình tinh sạch sắc ký cột và bộ dữ liệu phổ 1D/2D-NMR ở tần số 500 MHz làm tài liệu chuẩn mực trong công tác giảng dạy, nghiên cứu cấu trúc hợp chất tự nhiên.
2. Các doanh nghiệp sản xuất Dược phẩm và Thực phẩm chức năng: Ứng dụng số liệu kháng khuẩn trên chủng tụ cầu vàng kháng thuốc MRSA để nghiên cứu phát triển các viên nang hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn đường hô hấp và tiêu hóa.
3. Các công ty Dược - Mỹ phẩm chuyên về chăm sóc da: Khai thác hoạt chất 6-O-benzoylarbutin như một giải pháp hoạt chất làm trắng da và chống oxy hóa an toàn, thay thế hiệu quả cho các dẫn xuất tổng hợp có nguy cơ kích ứng.
4. Cơ quan quản lý nông nghiệp và các trung tâm bảo tồn tài nguyên dược liệu: Tham khảo dữ liệu phân loại học thực vật và đặc điểm phân bố tại Long An để xây dựng chiến lược bảo tồn nguồn gen quý và đa dạng hóa cơ cấu cây trồng dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

Cây Cù đè có đặc điểm thực vật học và thành phần hóa học nổi bật nào?

Cây Cù đè (Breynia vitis-idaea) là dạng cây bụi cao từ 1,5 đến 3 mét, thuộc họ Euphorbiaceae, phân bố rộng rãi tại vùng đồng bằng và ven biển Nam Bộ. Phân tích thực nghiệm chứng minh lá cây chứa phong phú các nhóm hoạt chất gồm alkaloid, flavonoid, tannin, saponin và đặc biệt là các glycoside có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ.

Tại sao phân đoạn chiết ethyl acetate lại thể hiện hoạt tính sinh học cao nhất?

Ethyl acetate là dung môi có độ phân cực trung bình lý tưởng, cho phép hòa tan chọn lọc và làm giàu các hợp chất phenolic, flavonoid và dẫn xuất arbutin. Do đó, phân đoạn này đạt giá trị IC50 quét gốc tự do DPPH và ABTS ở mức khoảng 99,66 µg/ml, vượt trội hoàn toàn so với cao chiết thô ban đầu.

Việc bổ sung enzyme Viscozyme L có mang lại hiệu quả kinh tế trong trích ly không?

Kết quả nghiên cứu thực nghiệm với các nồng độ enzyme từ 1% đến 6% cho thấy Viscozyme L không làm tăng đáng kể hiệu suất chiết xuất glycoside (mức chênh lệch dưới 3%). Do đó, quy trình ngâm chiết phân đoạn truyền thống bằng dung môi vẫn là phương án tối ưu về mặt kinh phí và kỹ thuật.

Hợp chất 6-O-benzoylarbutin phân lập được có tiềm năng ứng dụng gì?

Hợp chất 6-O-benzoylarbutin (eximine) là một dẫn xuất tự nhiên quý của arbutin, sở hữu tiềm năng ức chế sinh tổng hợp melanin và chống gốc tự do mạnh mẽ. Hợp chất này là ứng viên hàng đầu cho các dòng mỹ phẩm làm sáng da cao cấp và chế phẩm bôi ngoài da chống viêm nhiễm.

Phổ kháng khuẩn của cao chiết lá Cù đè có tác dụng mạnh nhất trên loại vi khuẩn nào?

Cao chiết ethyl acetate thể hiện hoạt tính ức chế chọn lọc rất cao trên các vi khuẩn Gram dương với giá trị MIC đạt 1,0 mg/ml trên cả chủng Staphylococcus aureus và chủng kháng thuốc nguy hiểm Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), mở ra hướng đi mới trong việc phát triển kháng sinh tự nhiên.

Kết luận

1. Đã giải mã toàn diện thành phần hóa thực vật sơ bộ của lá cây Cù đè thu hái tại Long An, xác định 8 nhóm hoạt chất tự nhiên có giá trị sinh học cao.
2. Chứng minh phân đoạn ethyl acetate có năng lực chống oxy hóa vượt trội với giá trị IC50 đạt 99,66 µg/ml trên cả hai mô hình thử nghiệm DPPH và ABTS.
3. Xác lập hoạt tính kháng khuẩn in vitro nổi bật trên vi khuẩn Gram dương với giá trị MIC đạt 1,0 mg/ml đối với tụ cầu vàng đa kháng thuốc MRSA ATCC 43300.
4. Đánh giá khách quan ảnh hưởng của enzyme Viscozyme L từ 1% đến 6%, cung cấp luận cứ khoa học chuẩn xác để tối ưu hóa quy trình trích ly công nghiệp.
5. Phân lập, tinh sạch và giải đoán thành công cấu trúc phân tử của hợp chất 6-O-benzoylarbutin bằng hệ thống phổ hiện đại HRMS và NMR 500 MHz.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là đã đặt nền móng khoa học thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam cho loài cây Cù đè, chuyển hóa tri thức dân gian thành dữ liệu phân tử chuẩn mực. Trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tới, việc tiếp tục mở rộng thử nghiệm dược lý in vivo và thử nghiệm lâm sàng trên dạng chế phẩm bôi ngoài da là bước đi cấp thiết. Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất quan tâm có thể khai thác trực tiếp quy trình công nghệ này để hiện thực hóa các sản phẩm chăm sóc sức khỏe chất lượng cao từ thảo dược nước nhà.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY — HO CHI MINH CITY HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF TECHNOLOGY NGUYEN THI LAN HUONG EVALUATION OF IN VITRO ANTIOXIDANT AND ANTIBACTERIAL PROPERTIES OF FRACTIONATED EXTRACTS AND ISOLATION OF BIOACTIVE COMPONENTS FROM BREYNIA VITIS-IDAEA (BURM. FISCHER LEAVES Major: Biotechnology Code: 60.80 MASTER’S THESIS Ho Chi Minh city, December 2015 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI ¬ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BACH KHOA - ĐHQG TPHCM VÀ TRUNG TAM SAM VÀ DƯỢC LIỆU TPHCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Thi Thu Hương Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ cham nhận xét 1: Phó Giáo sư Tiến sĩ Lê Phi Nga (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ cham nhận xét 2: Tiến sĩ Nguyễn Tú Anh (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai hoc Bach Khoa, DHQG Tp. HCM ngày 08 tháng 01 năm 2016. Thanh phân Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, hoc hàm, học vi của Hội đồng cham bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1.

Chủ tịch: Phó Giáo sư Tién sĩ Nguyễn Đức Lượng 2. Thư ký: Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương 3. Phản biện 1: Phó Giáo sư Tiến sĩ Lê Phi Nga 4. Phản biện 2: Tiến sĩ Nguyễn Tú Anh 5.

Ủy viên: Tiến sĩ Hoàng Mỹ Dung Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có). CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYÊN THỊ LAN HƯƠNG. MSHV:13313228 Ngày, tháng, năm sinh: 22/06/1990. Nơi sinh: thành phố Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học.80 LTÊN ĐÈ TÀI EVALUATION OF JN VITRO ANTIOXIDANT AND ANTIBACTERIAL PROPERTIES OF FRACTIONATED EXTRACTS AND ISOLATION OF BIOACTIVE COMPONENTS FROM BREYNIA_ VITIS-IDAEA (BURM.

FISCHER LEAVES Il. NHIEM VU VA NOI DUNG: - Obtaining and evaluation of biological properties of various extracts obtained by solvent and enzyme-assisted extraction technique from B. vitis-idaea leaves. - Isolation and determination of structure of some pure compounds in the fraction which showed the best bioactivities.

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/01/2015 IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 04/12/2015 V. CAN BO HƯỚNG DAN (Ghi rõ học hàm, học vi, họ, tên): - Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Thị Thu Hương - Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh Tp. HCM, ngày 04 thang 12 năm 2015 CÁN BỘ HƯỚNG DÂN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) TRUONG KHOA.

(Họ tên và chữ ký) ACKNOWLEDGEMENTS This study was sponsored by the Foundation for scientific research at university level with the code of T-KTHH-2014-44. First of all, | wish to take this opportunity to express my most sincere gratitude to all my supervisors, Assoc. Nguyen Thi Thu Huong and Dr. Huynh Ngoc Oanh, who had helped and supported me with the completion of this thesis.

Without their advice and encouragement, this thesis would not have been possible. In particular, | am sincerely grateful to my co-supervisior, Mrs. Nguyen Kim Minh Tam, for her long-term supervision and concern since 2008. Equally, I would like to thank Mr.

Bui Thanh Phong for his professional guidance and continuous encouragement throughout the course of this thesis. Besides that, I am thankful to all of the teachers in Department of Biotechnology because of highly valuable knowledge and experience that is foundation for me to do this project, and the board of examiners for reading this project and useful comments. I am also grateful to the colleagues as well as research fellows at Ho Chi Minh City University of Technology and Research Center of Ginseng and Medicinal Materials. Finally, I would like to thank my family, my parents and my sisters.

Their endless love, support and encouragement were the fuel driving me towards the accomplishment of this research. Ho Chi Minh City, December 30" 2015 Nguyen Thi Lan Huong ABSTRACT The present study was carried out to investigate the antioxidant and antibacterial activities of ethyl acetate, n-butanol and ethanol extracts of Breynia vitis-idaea (Burm. Fischer leaves using in vitro assays, to evaluate the effect of Viscozyme L treatment on extraction of glycosides from leaves of this plant, and to isolate bioactive compounds from the fractioned extract which showed the best properties by chromatography and spectrometry. All extracts showed significant radical scavenging activities and exhibited antibacterial activities against EF.

aureus and MRSA. Ethyl acetate extract showed the highest free radical scavenging capacity with the ICSO values of 99.66 ug/ml (in DPPH and ABTS assay, respectively) and exhibited the MIC values of 1.5, | and 1 mg/ml against the three bacteria, respectively. However, in the study of enzyme-assisted extraction, Viscozyme L treatments of leaf extracts did not bring any positive effect on extraction yield of glycosides. In addition, from ethyl acetate extract, one pure compound obtained was 6- O-benzoylarbutin and the procedure of obtaining 6-O-benzoylarbutin was also proposed.

GUARANTEE I guarantee that this is my individual research work. All of the figures as well as the results in the thesis are faithful and have not published in any research work yet. Author Nguyen Thi Lan Huong TABLE OF CONTENTS ABBREEVIATHONS. HH Họ Thọ nọ IV LIST OF DLAGRAMS.

- Q H Hnọ ọ Vv LIST OF FIGUIRES. HH Họ vi LIST OF TABLUE. Go HH tk Vill 582105077. General view about Breynid Vitis-idded.

Botanical description Of B. Preliminary phytochemical components of B. Traditional ethno-medicinal use of B. Overview of ØÏỢCOSI©.

cọ HH kh 6 1. Some common methods used in studying natural compounds. Chromatography mm€tÏOLC. - --- << s0 ng ng nh 10 1.

Method of antimicrobial susceptibility testing. Method of antioxidant testing .- -- - SG SH ng ng 13 1. Domestic research SIfUAfIOTI. Oversea research SIfUAfIOIN.

ng ngà 17 CHAPTER 2. MATERIALS AND METHODS. Material, chemical and apparatus. Media and chemicals.

Content Of €XD€TITTI€TIES. Analyze preliminary phytochemical COMPOSItON. Obtain fractionated extracts and evaluate antioxidant and antibacterial actiVity Of CACH €XÍTACẲ. Enzyme-assisted ©X{fACẨIOI.

- -- SG nọ ng 29 2. Isolation, refinement and structure determination of compound .7 SG HH ghe 35 3. Identification of herbal DÏATIE. Moisture content and total ash content of mater1aÌ.

Experiments of preliminary phytochemical composIfIon. Bioactivities of fractionated €XÍTACẨS.- -- --G SH ng ke 38 3. Enzyme-assIsted €XITACẨIOIN. Effect of enzyme conC€rIfFAfIOTIS.

Effect of treatment ẨIT ©. Results of purification and structure determination of compounds. Results of thin layer chromatography analysis. Results after running column chromatography.

Purification of fraction [Ñ.-- -- - sọ ng kn 50 3. Structure determination of the FI8C1 by spectrometry. HH Hi re 57 4. Characteristic of object Of StUCY.

Extraction mme€thOỞ. Antimicrobial aC[IVIẨY. cọ nh 59 AA. cọ nọ nọ ng gh 61 AS.

CONCLUSION AND PETTITON. ch ke, 64 SL. 65 APPENDIX ili ABBREVIATIONS ID-NMR One-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance 2D-NMR Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance 4-HNE 4-hydrox y-2-nonenal ABTS 2,2ˆ-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) CFU Colony Forming Unit COSY Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethylsulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl FBG Fungal Beta-Glucanase Units HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single-Quantum Correlation IC50 Median Inhibition Concentration IR Infrared IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry MBC Minimum Bactericidal Concentration MHA Mueller Hinton Agar MIC Minimum Inhibitory Concentration MS Mass Spectrometry MTT 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide NMR Nuclear Magnetic Resonance TLC Thin Layer Chromatography TSA Tryptic Soy Agar TSB Tryptic Soy Broth IV LIST OF DIAGRAMS Diagram 2. General outline of ExperiMeNts.

Process of preliminary phytochemical anaÏySIS. Process of extraction to get fractionated eXfFaCfS. Process of enzyme-assisted CXtractiONn 00. General process of purification and determination of structure of COMPOUNA.

Process of handling filtrate. Fractions after running column chromatography of EtOAc extract. Process of getting 6-O-benzoylarbutin from B. vitis-idaea leaves.

56 LIST OF FIGURES Figure 1. Upper and lower side Of B. Male flower of B. Female flower of B.

S0 ng re 4 Figure 1. Premature fruits Of B. S550 0 ng re 4 Figure 1. Cross section of B.

vitis-1dded ÍTUIÍ. Classification of glycosides. Reaction of neutralizing DPPH radical .-- -- -« «sex ks 15 Figure 1. Reaction of neutralizing ABTS radicall.

Mechanisms of antioxidant reacting with free radical: single electron transfer (SET) and hydrogen atom abstraction (HÀ TÌ). vitis-idaed leaf DOWT. cọ HH ke 35 Figure 3. Efficiency of extraction at different concentrations of enzyme.

Content of ethyl acetate extract at different concentrations of enzyme. DPPH radical scavenging activity of the extracts at different concentrations Of ENZYME 20. ABTS radical scavenging activity of the extracts at different concentrations Of ENZYME 77. Efficiency of extraction at different periods of treatment time.

Content of ethyl acetate extract at different periods of treatment time. DPPH radical scavenging activity of the extracts at different periods of treatMeNnt TIME 2. ABTS radical scavenging activity of the extracts at different periods of treatMeNnt TIME 2. Chromatogram of ethyl acetate extract with different developing solvent 9177 -.

Separation on chromatography COlUMMN. Chromatogram of samples in fraction Ï. Crystalizing phenomenon in fraction 18 after evaporating solvent. Feature of FI8CI1.

TLC of FI8C1 and FI8 2. Chemical structure of 6-O-benzoylarbutin .- -- «<< «<< << «2 53 Vil LIST OF TABLES Table 2. Ingredient and volume of systems of developing solvent in column Chromatography 272727277. Moisture content of material after drying (').

Total ash content of material (%). Preliminary phytochemical components in B. vitis-idaea leaves. Inhibition zone diameter of the extracts on tested bacteria (mm).

MIC value of the extracts on tested bacteria (mg/ml). Antioxidant activities of the extracts from B. Efficiency of extraction and content of ethyl acetate extract at different CONCENtrAalIONS Of €IZVIT€. Inhibition zone diameter of the extracts at different concentrations of IPA410U)01531100p:i0i5ïr-N0ii1 000886.

MIC value of the extracts at different concentrations of enzyme on tested bacteria (Mg/M]). Antioxidant activities of the extracts at different concentrations of enzyme Table 3. Efficiency of extraction and content of ethyl acetate extract at different periods of treatMent fIT €. Inhibition zone diameter of the extracts at different periods of treatment time on tested bacteria (MM).

MIC value of the extracts at different periods of treatment time on tested bacteria (Mg/M]). Antioxidant activities of the extracts at different periods of treatment time ¬—. Weight and result of TLC of fractions from EtOAc extract. Comparison of 'H-NMR spectrum data between FI8CI and 6-O- benzoylarbutin (DMSO, 6 ppm, SO0OMHZ) oo.

ee nàn HH HH cuc DO Vill Table 3. Comparison of "C-NMR spectrum data between FISCI and 6-O- benzoylarbutin (OMSO, 5 ppm, S50OMHZ) oc ch HH. HH hành ke che ccrseccvvc Po Table 3. Result of mass spectrometry Of FI8CI1 .-cẶS 5< 1 3 eeesse 54 1X PREFACE In nature, many plants seem to be incompetent but a good cure for treatment.

Medicinal herbs have been used such as direct or indirect raw materials or the first ingredients for semi-synthetic technology in order to find new compounds which have biological activities and more effective medical properties. Treatment by herbal remedy has become a positive heading encouraged in medicine field in Vietnam as well as the world because its faculties in curing are not so hazardous and expensive. Together with the development of modern science and technology, exploiting and using valuable medicinal herbs are relied on not only folk experiences but also other foundations of science. Among of them, medico-ethnobotanical knowledge plays an extremely important role in orienting initial research, helps to save time and labour.

Vietnam has rather abundant, diverse climate and vegetational cover. Breynia vitis-idaea (Burm.