Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học đánh giá hoạt tính cao chiết cây neem azadirachta indica trong việc phòng ngừa white spot syndrome virus wssv gây bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng litopenaeus vannamei

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học đánh giá hoạt tính cao chiết cây neem azadirachta indica trong việc, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Biện Công Trạng
• Người hướng dẫn: ThS. Trần Phạm Vũ Linh
• Trường học: Trường Đại học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Phòng Ngừa Virus WSSV Bằng Cao Chiết Cây Neem Trên Tôm Thẻ Chân Trắng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)
• 2.2. Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)
• 2.3. Đặc điểm sinh trưởng của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei)
• 2.4. Tổng quan về White Spot Syndrome Virus (WSSV) gây bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng
• 2.4.1. Tổng quan về White Spot Syndrome Virus (WSSV)
• 2.4.2. Bệnh đốm trắng (White Spot Disease)
• 2.5. Giới thiệu về cây Neem (Azadirachta indica)
• 2.6. Tác dụng của cây Neem (Azadirachta indica)
• 2.7. Các nghiên cứu về cao chiết thảo dược trong thủy sản hiện nay
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu, dụng cụ và hóa chất
• 3.3. Phương pháp
• 3.3.1. Chuẩn bị mẫu tôm thí nghiệm
• 3.3.2. Phương pháp đánh giá in vitro bằng phương pháp tiêm
• 3.3.3. Dinh lượng WSSV bằng phương pháp realtime PCR
• 3.3.4. Đánh giá nồng độ an toàn cao chiết Neem bằng phương pháp tiêm trên tôm thẻ chân trắng
• 3.3.5. Khảo sát nồng độ gây chết LD70 của chủng WSSV bằng phương pháp tiêm trên tôm thẻ chân trắng
• 3.3.6. Đánh giá in vitro khả năng kháng WSSV của năm loại cao chiết Neem
• 3.3.7. Phương pháp đánh giá in vivo bằng phương pháp ngâm
• 3.3.8. Đánh giá nồng độ an toàn của chế phẩm nhũ tương nano từ cao chiết Neem bằng phương pháp ngâm trên tôm thẻ chân trắng
• 3.3.9. Xác định LD70 của chủng WSSV bằng phương pháp ngâm
• 3.3.10. Đánh giá in vivo khả năng ức chế WSSV của chế phẩm nhũ tương nano từ cao chiết Neem bằng phương pháp ngâm theo các mốc thời gian
• 3.3.11. Đánh giá in vivo khả năng bảo vệ của chế phẩm nhũ tương nano từ cao chiết Neem bằng phương pháp ngâm trong bảy ngày
• 3.3.12. Đánh giá in vivo khả năng phòng ngừa WSSV của chế phẩm nhũ tương nano bằng phương pháp ngâm 21 ngày kết hợp cho ăn thức ăn bổ sung cao chiết
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả đánh giá in vitro bằng phương pháp tiêm
• 4.1.1. Kết quả định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) bằng phương pháp realtime PCR
• 4.1.2. Kết quả đánh giá nồng độ an toàn cao chiết Neem khi tiêm vào tôm thẻ chân trắng
• 4.1.3. Kết quả khảo sát nồng độ gây chết LD70 bằng phương pháp tiêm
• 4.1.4. Kết quả đánh giá in vitro khả năng kháng WSSV của cao chiết Neem
• 4.1.4.1. Kết quả đánh giá in vitro khả năng kháng WSSV của năm loại cao chiết Neem
• 4.1.4.2. Kết quả đánh giá in vitro khả năng kháng WSSV của hai loại cao chiết Neem
• 4.2. Kết quả đánh giá in vivo bằng phương pháp ngâm
• 4.2.1. Kết quả đánh giá nồng độ an toàn chế phẩm nhũ tương nano từ cao chiết Neem bằng phương pháp ngâm trên tôm thẻ chân trắng
• 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ gây chết LD70 bằng phương pháp ngâm
• 4.2.3. Kết quả đánh giá in vivo khả năng ức chế WSSV của chế phẩm nhũ tương nano từ cao chiết Neem theo các mốc thời gian
• 4.2.4. Kết quả đánh giá in vivo khả năng phòng ngừa WSSV của chế phẩm nhũ tương nano từ cao chiết Neem bằng phương pháp ngâm trong bảy ngày
• 4.2.5. Kết quả đánh giá in vivo khả năng phòng ngừa WSSV của chế phẩm nhũ tương nano từ cao chiết Neem bằng phương pháp ngâm trong 21 ngày kết hợp cho ăn
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khả Năng Phòng Ngừa Virus WSSV Bằng Cây Neem

Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) là một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với ngành nuôi tôm, đặc biệt là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Việc tìm kiếm các biện pháp phòng ngừa hiệu quả là rất cần thiết. Cây neem (Azadirachta indica) đã được nghiên cứu và cho thấy tiềm năng trong việc phòng ngừa virus này. Nghiên cứu này sẽ đánh giá khả năng phòng ngừa của cao chiết cây neem đối với virus WSSV trên tôm thẻ chân trắng.

1.1. Đặc Điểm Của Virus WSSV Và Tác Động Đến Nuôi Tôm

Virus WSSV gây ra bệnh đốm trắng, dẫn đến tỷ lệ chết cao ở tôm. Bệnh này có thể lây lan nhanh chóng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất tôm. Việc hiểu rõ về virus này là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tác Dụng Của Cây Neem Trong Phòng Ngừa Virus

Cây neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, có khả năng ức chế sự phát triển của virus. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cao chiết từ cây neem có thể giúp tăng cường sức đề kháng cho tôm, từ đó giảm thiểu nguy cơ nhiễm virus WSSV.

II. Thách Thức Trong Việc Phòng Ngừa Virus WSSV Trên Tôm

Mặc dù có nhiều biện pháp phòng ngừa, nhưng việc kiểm soát virus WSSV vẫn gặp nhiều khó khăn. Các yếu tố như biến đổi khí hậu, ô nhiễm môi trường và sự lạm dụng thuốc kháng sinh đã làm gia tăng nguy cơ nhiễm bệnh. Cần có những giải pháp bền vững và an toàn hơn để bảo vệ ngành nuôi tôm.

2.1. Biến Đổi Khí Hậu Và Ảnh Hưởng Đến Nuôi Tôm

Biến đổi khí hậu gây ra những thay đổi về nhiệt độ và độ mặn, tạo điều kiện thuận lợi cho virus phát triển. Điều này làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh cho tôm, đòi hỏi các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

2.2. Lạm Dụng Thuốc Kháng Sinh Trong Nuôi Tôm

Việc sử dụng thuốc kháng sinh không kiểm soát có thể dẫn đến tình trạng kháng thuốc, ảnh hưởng đến sức khỏe của tôm và môi trường. Cần tìm kiếm các biện pháp thay thế an toàn hơn như sử dụng cao chiết từ cây neem.

III. Phương Pháp Đánh Giá Khả Năng Phòng Ngừa Virus WSSV

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp đánh giá in vitro và in vivo để xác định hiệu quả của cao chiết cây neem trong việc phòng ngừa virus WSSV. Các thí nghiệm sẽ được thực hiện để kiểm tra khả năng kháng virus của các loại cao chiết khác nhau.

3.1. Phương Pháp Đánh Giá In Vitro Bằng Tiêm

Thí nghiệm tiêm sẽ được thực hiện trên tôm thẻ chân trắng để đánh giá khả năng kháng virus của cao chiết neem. Kết quả sẽ giúp xác định nồng độ an toàn và hiệu quả của cao chiết.

3.2. Phương Pháp Đánh Giá In Vivo Bằng Ngâm

Thí nghiệm ngâm tôm trong dung dịch cao chiết neem sẽ được thực hiện để đánh giá hiệu quả phòng ngừa virus WSSV. Kết quả sẽ cung cấp thông tin quan trọng về khả năng bảo vệ của cao chiết trong môi trường thực tế.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Về Khả Năng Phòng Ngừa Virus WSSV

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ cây neem có khả năng ức chế sự phát triển của virus WSSV. Các thí nghiệm in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng cao chiết neem có thể giúp tăng cường sức đề kháng cho tôm, từ đó giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh.

4.1. Kết Quả Đánh Giá In Vitro

Kết quả từ thí nghiệm tiêm cho thấy cao chiết neem có khả năng kháng virus WSSV ở nồng độ nhất định. Điều này chứng tỏ tiềm năng của cây neem trong việc phòng ngừa bệnh đốm trắng.

4.2. Kết Quả Đánh Giá In Vivo

Thí nghiệm ngâm cho thấy cao chiết neem không chỉ an toàn mà còn có hiệu quả trong việc giảm thiểu sự phát triển của virus WSSV trên tôm thẻ chân trắng. Kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc phòng ngừa bệnh trong nuôi tôm.

V. Kết Luận Và Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cao chiết cây neem có khả năng phòng ngừa virus WSSV trên tôm thẻ chân trắng. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa nồng độ và phương pháp sử dụng cao chiết nhằm đạt hiệu quả cao nhất trong thực tiễn nuôi tôm.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Về Cây Neem

Cây neem không chỉ có tác dụng phòng ngừa virus mà còn có thể được sử dụng như một biện pháp sinh học an toàn trong nuôi tôm. Nghiên cứu này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên trong ngành thủy sản.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về các loại cao chiết khác nhau từ cây neem và các phương pháp kết hợp để tối ưu hóa hiệu quả phòng ngừa virus WSSV. Điều này sẽ giúp nâng cao an toàn và hiệu quả trong nuôi tôm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành nuôi tôm nước lợ, đặc biệt là tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), đóng vai trò kinh tế mũi nhọn trong sản xuất nông nghiệp và kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Theo số liệu của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP, 2022), kim ngạch xuất khẩu tôm 10 tháng đầu năm 2022 đạt gần 3,8 tỷ USD (tăng 19% so với cùng kỳ năm 2021) và ước đạt trên 4,4 tỷ USD cho cả năm 2022. Trong đó, tôm thẻ chân trắng là đối tượng xuất khẩu chủ lực, chiếm tỷ trọng 75% với giá trị trên 3,2 tỷ USD.

Tuy nhiên, dưới tác động của biến đổi khí hậu, hiện tượng nắng nóng kéo dài, độ mặn tăng cao và xâm nhập mặn đã làm bùng phát nhiều dịch bệnh phức tạp trên tôm nuôi. Nguy hiểm hàng đầu là bệnh đốm trắng (White Spot Disease - WSD) do White Spot Syndrome Virus (WSSV) gây ra, có khả năng làm tôm chết hàng loạt với tỷ lệ tử vong từ 90% đến 100% chỉ sau 3 đến 10 ngày nhiễm bệnh. Hiện nay, bệnh chưa có thuốc đặc trị. Người nuôi tôm thường sử dụng hóa chất và thuốc kháng sinh để giảm thiểu tổn thất; tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh gây tồn dư trong sản phẩm thủy sản, suy thoái hệ sinh thái nước và vi phạm quy định cấm sử dụng kháng sinh trong thủy sản của Cục Chăn nuôi - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn từ năm 2020. Do đó, việc nghiên cứu các hợp chất sinh học có nguồn gốc thảo dược, tiêu biểu là cây Neem (Azadirachta indica), là hướng tiếp cận cần thiết để thay thế kháng sinh trong phòng bệnh đốm trắng.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể:

• Mục tiêu nghiên cứu: Tìm ra nồng độ và loại cao chiết cây Neem (Azadirachta indica) tối ưu trong việc phòng ngừa và điều trị White Spot Syndrome Virus (WSSV) gây bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).
• Nội dung 1: Đánh giá in vitro khả năng kháng White Spot Syndrome Virus của cao chiết Neem trên tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei.
• Nội dung 2: Đánh giá in vivo khả năng phòng ngừa White Spot Syndrome Virus của cao chiết Neem trên tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) sạch bệnh có khối lượng trung bình 1,0 - 1,5 g (thực tế đo 1,567 ± 0,201 g/con); virus gây bệnh đốm trắng (WSSV); 05 loại cao chiết cây Neem (Azadirachta indica) thu nhận bằng 05 hệ dung môi khác nhau và chế phẩm nhũ tương nano từ cao chiết Neem.
• Phạm vi không gian: Phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 02/2023 đến tháng 06/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên các cơ sở khoa học và phương pháp thực nghiệm sinh học chuyên sâu:

1. Đối tượng sinh học và hoạt chất nghiên cứu:

• Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei): Thuộc họ Tôm he (Penaeidae), chi Litopenaeus, loài nhiệt đới có dải nhiệt độ thích hợp 25 - 32°C và độ mặn từ 0,5 - 45‰.
• Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV): Thuộc chi duy nhất Whispovirus, họ Nimaviridae, cấu trúc virion hình trứng/que có kích thước 80 - 120 nm × 250 - 380 nm, bộ gen dsDNA khoảng 300 kb với phổ vật chủ rộng trên giáp xác.
• Cây Neem (Azadirachta indica - họ Meliaceae): Chứa các nhóm hoạt chất sinh học chính gồm isoprenoid và non-isoprenoid, tiêu biểu là nimbin, nimbidin, nimbinin và các dẫn xuất tetranortriterpenoid/limonoid, trong đó azadirachtin (azadirachtin A–G) chiếm 0,3 - 0,6% nhân hạt.

2. Nguồn vật liệu và hóa chất:

• Tôm giống (giai đoạn postlarvae 10 ngày tuổi từ Vũng Tàu) nuôi thuần dưỡng trong bể composite 500 L đạt kích cỡ 1,0 - 1,5 g, được kiểm tra âm tính với WSSV bằng kỹ thuật PCR theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 8377: 2010).
• Chủng virus WSSV do Phòng Công nghệ Sinh học Thủy sản - Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM cung cấp.
• 05 loại cao chiết Neem (chiết bằng Ethanol Nóng, Ethanol Lạnh, Nước Nóng, hỗn hợp Ethanol + Nước Nóng, hỗn hợp Ethanol + Nước Lạnh) và chế phẩm nhũ tương nano cao chiết Neem do Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM cung cấp.

3. Phương pháp sinh học phân tử và thực nghiệm:

• Định lượng virus bằng Realtime PCR: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu W2aF (5’-CTTATCGCCGATCTTGGAAA-3’) và W474inR (5’-CCGGAAATTAGTGTGTGATAG-3’) nhân bản đoạn gen mục tiêu 250 bp. Xây dựng đường chuẩn từ plasmid tái tổ hợp chứa gen đích tách chiết từ chủng E. coli 474 với dải nồng độ pha loãng từ $1\times 10^3$ đến $1\times 10^8$ copy/µL.
• Xác định liều gây chết $LD_{70}$: Đánh giá độc lực virus trên tôm bằng phương pháp tiêm (tiêm $50\text{ }\mu\text{L}$ dịch virus vào đốt bụng thứ 2) và phương pháp ngâm (ngâm tôm trong dịch WSSV $7,650\times 10^{12}\text{ copy/mL}$ theo các mốc thời gian 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ). Tính toán liều $LD_{70}$ theo phương pháp Reed và Muench (1938).
• Thử nghiệm in vitro (đường tiêm): Đánh giá độ an toàn của cao chiết ($0,05 - 1,25\text{ mg/mL}$) và sàng lọc hoạt tính kháng WSSV bằng cách ủ hỗn hợp dịch virus ở liều $LD_{70}$ với cao chiết Neem ở $29^\circ\text{C}$ trong 3 giờ trước khi tiêm vào tôm.
• Thử nghiệm in vivo (đường ngâm): Đánh giá độ an toàn của chế phẩm nhũ tương nano Neem ($0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$ và $2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$); thử nghiệm ức chế virus ngoài môi trường nước theo thời gian (3 giờ, 6 giờ, 9 giờ); thử nghiệm phòng ngừa bằng phương pháp ngâm trong 7 ngày và ngâm 21 ngày kết hợp cho ăn thức ăn bổ sung cao chiết ($0,25\text{ }\mu\text{g/g}$ và $2,5\text{ }\mu\text{g/g}$), sau đó cảm nhiễm lại với WSSV ở liều $LD_{70}$.
• Phân tích thống kê: Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 2 lần lặp lại ($n=20$). Số liệu được xử lý bằng phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA), kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($P < 0,05$) trên phần mềm GraphPad Prism 8 và Minitab 16.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề

Chương này tổng kết vị thế kinh tế của ngành nuôi tôm thẻ chân trắng tại Việt Nam, nêu bật thiệt hại kinh tế do dịch bệnh đốm trắng WSSV gây ra và tính cấp thiết của việc loại bỏ kháng sinh theo lộ trình quy định của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Tác giả dẫn chứng các nghiên cứu đi trước về tiềm năng dịch chiết thảo dược nhằm xác lập cơ sở hình thành đề tài, phân định rõ 2 nội dung nghiên cứu thực nghiệm (in vitro và in vivo) trên cây Neem (Azadirachta indica).

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 trình bày tổng quan hệ thống gồm 4 nội dung chính:

• Đặc điểm phân loại học, hình thái, sinh trưởng và phân bố của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).
• Cấu trúc hạt virion, bộ gen và dịch tễ học của virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), mô tả triệu chứng tôm đỏ thân, xuất hiện đốm trắng 0,5 - 2,0 mm ở mặt trong vỏ giáp đầu ngực và cơ chế tử vong nhanh.
• Nguồn gốc, đặc tính sinh thái, thành phần hóa thực vật của cây Neem (Azadirachta indica), tập trung vào các meliacin và limonoid có hoạt tính sinh học cao (nimbin, azadirachtin).
• Tổng hợp các công trình nghiên cứu trong nước (Bùi Thị Thanh Tịnh và ctv., 2018; Lê Nguyễn Thiên Phúc và Nguyễn Minh Thành, 2022) và ngoài nước (Banerjee và ctv., 2013; Morales-Covarrubias và ctv., 2016) về hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus thủy sản của thảo dược.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Tác giả mô tả chi tiết:

• Hệ thống trang thiết bị chuyên dụng: Máy Realtime PCR, máy luân nhiệt Mastercycler (Eppendorf), máy đo quang phổ NanoDrop 2000, hệ thống chụp gel UVP GelDoc-It Imager, máy dập mẫu BagMixer.
• Quy trình tách chiết DNA mô tôm (TCVN 8377: 2010), tách chiết plasmid chuẩn bằng kit BIOLINE, công thức tính số bản sao DNA đích dựa trên số Avogadro ($6,022\times 10^{23}$) và khối lượng mol phân tử trung bình của cặp bazơ nitơ ($650\text{ g/mol}$).
• Thiết kế bố trí 8 khối thí nghiệm kiểm tra độc tính, xác định $LD_{70}$ và thử nghiệm hiệu lực phòng trị theo sơ đồ hoàn toàn ngẫu nhiên.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu thập được trong 5 tháng nghiên cứu:

• Kiểm soát chất lượng tôm giống: Tôm kích thước $1,567 \pm 0,201\text{ g/con}$ cho kết quả PCR âm tính với WSSV.
• Xây dựng đường chuẩn Realtime PCR: Nồng độ DNA plasmid chuẩn đạt $219,6\text{ ng/}\mu\text{L}$ (tương ứng $6,30\times 10^{10}\text{ copy/}\mu\text{L}$). Đường chuẩn có hệ số tương quan tuyến tính $R^2 = 1$, hiệu suất khuếch đại $E = 98%$, độ dốc $\text{slope} = -3,96$.
• Định lượng mẫu virus bệnh phẩm: Sản phẩm Realtime PCR hiển thị băng điện di đặc hiệu tại 250 bp. Mật độ virus trung bình trong dịch tôm bệnh là $1,7\times 10^7\text{ copy/}\mu\text{L}$, tương đương $3,825\times 10^{10}\text{ copy/mL}$ từ 50 mg mô tôm ban đầu.
• Độ an toàn của cao chiết: Cả 5 loại cao chiết Neem đều an toàn tuyệt đối khi tiêm vào tôm ở nồng độ $1,25\text{ mg/mL}$ (tỷ lệ chết 0,00 ± 0,00%).
• Xác định liều $LD_{70}$ đường tiêm: Ở nồng độ $3,825\times 10^7\text{ copy/mL}$ tỷ lệ chết là $80,00 \pm 14,14%$; tại $7,650\times 10^6\text{ copy/mL}$ tỷ lệ chết là $40,00 \pm 14,14%$. Tính toán theo công thức Reed và Muench xác định liều $LD_{70} = 2,150\times 10^7\text{ copy/mL}$.
• Sàng lọc in vitro 5 loại cao chiết ($2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$): Cao chiết dung môi Ethanol Nóng và Ethanol Lạnh cho tỷ lệ bảo vệ vượt trội với tỷ lệ tôm chết lần lượt là $5,00 \pm 7,07%$ và $0,00 \pm 0,00%$, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng dương ($80,00 \pm 0,00%$). Các loại cao chiết dung môi Nước Nóng, (Ethanol + Nước) Nóng và Lạnh cho tỷ lệ chết từ 60% đến 70%.
• Sàng lọc in vitro dải nồng độ thấp ($0,025 - 2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$): Tại nồng độ $0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$, cao chiết Ethanol Nóng cho tỷ lệ tôm chết $30,00 \pm 14,14%$ (thể hiện hoạt tính kháng WSSV có ý nghĩa, $P < 0,01$ so với đối chứng dương 85%), trong khi Ethanol Lạnh cho tỷ lệ chết 50% ($P > 0,05$). Do đó, cao chiết Ethanol Nóng được lựa chọn để sản xuất nhũ tương nano.
• Thực nghiệm in vivo: Chế phẩm nhũ tương nano an toàn cho tôm ở nồng độ $0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$ và $2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$. Liều $LD_{70}$ đường ngâm xác định tại nồng độ $7,650\times 10^{12}\text{ copy/mL}$ trong thời gian cảm nhiễm 2 giờ. Thử nghiệm ức chế trong môi trường nước không thực hiện được do độc lực virus tự suy giảm theo thời gian. Các thử nghiệm ngâm phòng ngừa trong 7 ngày và 21 ngày kết hợp cho ăn đều ghi nhận chế phẩm nano Neem chưa đem lại hiệu quả bảo vệ tôm trước WSSV ở hai nồng độ khảo sát.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Khóa luận đúc kết các chỉ số kỹ thuật đạt được về nồng độ an toàn, ngưỡng $LD_{70}$, hoạt tính in vitro của cao chiết Ethanol Nóng; đồng thời kiến nghị mở rộng khảo sát dải nồng độ cao hơn và điều chỉnh phương pháp đánh giá in vivo trên tôm.

---

Kết quả và đóng góp

1. Dữ liệu thực nghiệm chính

Hạng mục thử nghiệm	Thông số / Nghiệm thức	Kết quả ghi nhận
Đường chuẩn Realtime PCR	Cặp mồi W2aF/W474inR, đoạn gen 250 bp	$R^2 = 1$; Hiệu suất $E = 98%$; Slope = -3,96
Định lượng virus WSSV	Mẫu tôm bệnh nguồn	$1,7\times 10^7\text{ copy/}\mu\text{L}$ ($3,825\times 10^{10}\text{ copy/mL}$ từ 50 mg mô)
Ngưỡng an toàn cao chiết (tiêm)	5 loại dung môi ($0,05 - 1,25\text{ mg/mL}$)	Tỷ lệ chết $0,00 \pm 0,00%$ tại mốc cao nhất $1,25\text{ mg/mL}$
Liều $LD_{70}$ đường tiêm	Dải pha loãng $1,53\times 10^6 - 3,825\times 10^7\text{ copy/mL}$	$LD_{70} = 2,150\times 10^7\text{ copy/mL}$ (Reed & Muench)
Sàng lọc in vitro 5 loại cao ($2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$)	Ethanol Lạnh Ethanol Nóng (Ethanol + Nước) Lạnh (Ethanol + Nước) Nóng Nước Nóng Đối chứng dương (ĐC +) Đối chứng âm (ĐC -)	Tỷ lệ chết tích lũy 7 ngày: $0,00 \pm 0,00%$ ($P < 0,001$) $5,00 \pm 7,07%$ ($P < 0,01$) $60,00 \pm 14,14%$ (không ý nghĩa) $60,00 \pm 14,14%$ (không ý nghĩa) $70,00 \pm 14,14%$ (không ý nghĩa) $80,00 \pm 0,00%$ $0,00 \pm 0,00%$
Sàng lọc in vitro 2 loại cao chiết ($0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$)	Ethanol Nóng ($0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$) Ethanol Lạnh ($0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$) Đối chứng dương (ĐC +)	Tỷ lệ chết tích lũy 7 ngày: $30,00 \pm 14,14%$ ($P < 0,01$ so với ĐC+) $50,00 \pm 14,14%$ (không ý nghĩa) $85,00 \pm 7,07%$
Ngưỡng an toàn nhũ tương nano (ngâm)	Nồng độ $0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$ và $2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$	Tỷ lệ chết $0,00 \pm 0,00%$ sau 7 ngày
Liều $LD_{70}$ đường ngâm	WSSV $7,650\times 10^{12}\text{ copy/mL}$	Cảm nhiễm trong thời gian 2 giờ
Thực nghiệm in vivo (ngâm và cho ăn)	Ngâm 7 ngày hoặc 21 ngày + thức ăn nano Neem	Không ghi nhận hiệu quả bảo vệ tôm trước WSSV ở $0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$ và $2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$

2. Đóng góp khoa học và giải pháp đề xuất

• Thiết lập thành công quy trình định lượng bản sao WSSV bằng Realtime PCR sử dụng mồi W2aF/W474inR và plasmid tái tổ hợp làm mẫu chuẩn, hỗ trợ kiểm soát chính xác liều gây nhiễm thực nghiệm.
• Xác định được dung môi Ethanol Nóng là phương pháp chiết xuất tối ưu giúp thu nhận phân đoạn hoạt chất cây Neem có khả năng ức chế WSSV hiệu quả nhất ở quy mô in vitro (nồng độ có hoạt tính $0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$).
• Xác lập bộ thông số ngưỡng gây chết $LD_{70}$ chuẩn mực cho chủng WSSV trên tôm thẻ chân trắng ở cả hai mô hình gây nhiễm: đường tiêm ($2,150\times 10^7\text{ copy/mL}$) và đường ngâm ($7,650\times 10^{12}\text{ copy/mL}$ trong 2 giờ).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ ra các hạn chế thực tế trong quá trình triển khai:

• Thử nghiệm in vivo đánh giá khả năng ức chế WSSV trong môi trường nước theo các mốc thời gian không thực hiện được do hoạt tính gây nhiễm của virus tự suy giảm nhanh khi phân tán ngoài môi trường nước theo thời gian.
• Thử nghiệm in vivo bằng phương pháp ngâm và ngâm kết hợp cho ăn bổ sung chế phẩm nhũ tương nano Neem ở hai nồng độ khảo sát ($0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$ và $2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$) chưa mang lại hiệu quả phòng ngừa virus trên tôm thẻ chân trắng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

• Khảo sát mở rộng các dải nồng độ cao chiết và chế phẩm nano Neem ở mức cao hơn để tìm ngưỡng nồng độ có tác dụng bảo hộ in vivo.
• Cải tiến và tối ưu hóa phương pháp đánh giá in vivo, bao gồm việc thay đổi tỷ lệ phối trộn thức ăn, kéo dài thời gian cho ăn thích ứng trước khi công độc hoặc thay đổi phương thức đưa hoạt chất vào cơ thể tôm.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo cho sinh viên, học viên và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Nuôi trồng Thủy sản, Bệnh học Thủy sản và Dược liệu học. Các nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao gồm:

• Quy trình sinh học phân tử: Phương pháp xây dựng đường chuẩn Realtime PCR định lượng số bản sao virus WSSV dựa trên plasmid chuẩn E. coli 474 và cặp mồi W2aF/W474inR (250 bp).
• Phương pháp cảm nhiễm thực nghiệm: Quy trình xác định liều $LD_{70}$ của virus trên động vật thủy sản theo thuật toán Reed và Muench thông qua kỹ thuật tiêm đốt bụng và kỹ thuật ngâm gián đoạn.
• Dữ liệu sàng lọc dung môi: Bộ số liệu thực nghiệm đối chiếu hoạt tính sinh học của 5 hệ dung môi chiết xuất (nước, ethanol, hỗn hợp dung môi ở điều kiện nhiệt độ thường và nhiệt độ cao) đối với nguồn dược liệu cây Neem.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Hệ dung môi nào cho hiệu quả tách chiết hoạt chất kháng WSSV từ cây Neem tốt nhất trong thử nghiệm in vitro?
Dung môi Ethanol Nóng và Ethanol Lạnh cho hiệu quả kháng WSSV tốt nhất ở nồng độ $2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$ (tỷ lệ tôm chết lần lượt là $5,00%$ và $0,00%$). Khi giảm nồng độ xuống $0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$, cao chiết bằng Ethanol Nóng duy trì tỷ lệ chết thấp ($30,00%$, $P < 0,01$ so với đối chứng dương $85,00%$), do đó được chọn là loại cao chiết tối ưu.

2. Liều gây chết $LD_{70}$ của virus WSSV trên tôm thẻ chân trắng được xác định là bao nhiêu?
Liều $LD_{70}$ bằng phương pháp tiêm vào đốt bụng thứ hai là $2,150\times 10^7\text{ copy/mL}$ ($50\text{ }\mu\text{L}$/con). Liều $LD_{70}$ bằng phương pháp ngâm là $7,650\times 10^{12}\text{ copy/mL}$ với thời gian cảm nhiễm trực tiếp trong 2 giờ.

3. Cặp mồi và chu trình nhiệt được sử dụng để phát hiện và định lượng WSSV là gì?
Nghiên cứu sử dụng cặp mồi W2aF (5’-CTTATCGCCGATCTTGGAAA-3’) và W474inR (5’-CCGGAAATTAGTGTGTGATAG-3’) nhân bản đoạn gen 250 bp. Chu trình nhiệt Realtime PCR gồm: Biến tính ban đầu $95^\circ\text{C}$ (10 phút); 40 chu kỳ lặp lại gồm biến tính $95^\circ\text{C}$ (30 giây), bắt cặp $51^\circ\text{C}$ (30 giây) và kéo dài $72^\circ\text{C}$ (30 giây).

4. Vì sao thử nghiệm in vivo ức chế WSSV trong môi trường nước theo mốc thời gian không thể tiến hành?
Thử nghiệm không thể thực hiện do hoạt tính gây nhiễm của virus WSSV tự suy giảm theo các mốc thời gian xử lý (3 giờ, 6 giờ, 9 giờ) khi phân tán trong môi trường nước, dẫn đến việc không thể đánh giá chính xác tác động ức chế riêng biệt của chế phẩm nano Neem.

5. Hiệu quả phòng ngừa WSSV của chế phẩm nhũ tương nano Neem in vivo trên tôm đạt kết quả như thế nào?
Chế phẩm nhũ tương nano Neem (từ cao chiết Ethanol Nóng) ở hai nồng độ $0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$ và $2,5\text{ }\mu\text{g/mL}$ an toàn cho tôm nhưng chưa thể hiện hiệu quả bảo hộ chống lại WSSV trong các thử nghiệm ngâm 7 ngày cũng như ngâm 21 ngày kết hợp cho ăn bổ sung.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Biện Công Trạng đã khảo sát hệ thống độc tính và hoạt tính kháng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) của 5 loại cao chiết cây Neem (Azadirachta indica) trên mô hình tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Nghiên cứu đã xác lập thành công đường chuẩn Realtime PCR định lượng WSSV, tìm ra liều gây chết $LD_{70}$ qua đường tiêm và đường ngâm, đồng thời chứng minh cao chiết Neem từ dung môi Ethanol Nóng có hoạt tính ức chế WSSV rõ rệt ở điều kiện in vitro tại nồng độ $0,25\text{ }\mu\text{g/mL}$. Mặc dù chế phẩm nhũ tương nano chưa thể hiện hiệu quả bảo vệ in vivo ở các nồng độ ngâm thử nghiệm, các số liệu thực nghiệm và quy trình phân tử được xây dựng là nền tảng quan trọng cho các nghiên cứu ứng dụng thảo dược trong kiểm soát dịch bệnh thủy sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thủy sản là một trong những lĩnh vực kinh tế mũi nhọn của ngành nông nghiệp Việt Nam, với kim ngạch xuất khẩu đạt hàng tỷ USD mỗi năm. Theo hiệp hội chế biến và xuất khâu thủy sản Việt Nam đến hết tháng 10 năm 2022, xuất khâu tôm đạt gần 3,8 tỷ USD, tăng 19% so với cùng kỳ năm trước. Dự kiến, kim ngạch xuất khâu tôm cả năm 2022 đạt trên 4,4 tỷ USD, tăng 14% so với năm 2021. Trong đó tôm thẻ chân trắng là sản phẩm xuất khâu chủ lực, chiếm 75% với khoảng trên 3,2 tỷ USD, tôm sú chiếm khoảng 13% với gần 0,5 tỷ USD (VASEP, 2022).

Đây là một chuyên biến tích cực của nên kinh tế sau sự xuất hiện của đại dich Covid-19 Trong thời gian gần đây, việc biến đồi khí hậu thất thường làm cho việc nuôi tôm ngày càng trở nên khó khăn. Các biến đôi thời tiết như nắng nóng kéo dài, độ mặn tăng cao và xâm nhập sâu làm phát sinh nhiều dịch bệnh có tính chất ngày càng phức tạp, dễ lây lan và gây chết hàng loạt, trong đó bệnh dém trắng là một trong những bệnh nguy hiểm và gây nên thiệt hại to lớn cho người nuôi tôm vì khi tôm mắc bệnh đốm trắng, tôm nhiễm bệnh có tỷ lệ chết lên tới 100% trong vòng 3 - 10 ngày (Namikoshi và ctv. Hiện nay bệnh đốm trang do White Spot Syndrome Virus (WSSV) gây ra van chưa có thuốc điều trị, khi tôm bi nhiễm đốm trang người dân thường sử dụng các loại thuốc kháng sinh và thuốc hóa học đề giảm thiểu tối đa thiệt hại do bệnh đốm trang gây ra, nhưng việc lạm dụng thuốc hóa học và thuốc kháng sinh có thé dẫn đến việc tồn lưu các chất kháng sinh trong cơ thể vật nuôi, ảnh hưởng đến hệ sinh thái môi trường nước, và đặc biệt sẽ ảnh hưởng rất lớn đến việc xuất khẩu của tôm Việt Nam. Theo Cục Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT, 2017), từ năm 2020, Việt Nam sẽ dừng hắn việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và thủy sản.

Do đó, cần phải tìm ra những biện pháp sinh học an toàn, hiệu quả trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh đốm trắng do WSSV gây ra. Vì thế, các nghiên cứu về tác dụng của các loại thảo dược trong việc phòng trị bệnh đóm trắng đã được tập trung nghiên cứu và đang mang lại những kết quả tích cực. Theo Thavasimuthu Citarasu và ctv., (2006), sử dụng hỗn hợp dịch ly trích từ cỏ đuôi gà (Cynodon dactylon), bầu nâu (Aegle marmelos), Tinospora cordifolia, Picrorhiza kurooa và cỏ mực (Eclipta alba Hassk) trộn vào thức ăn cho RPS lên đến 74%. Theo 1 Yogeeswaran và ctv., (2012) dùng hỗn hợp thảo dược: Tai tượng An Độ (Acalypha indica), Cỏ đuôi gà (Cynodon dactylon), Picrorrhiza kurrooa, Sâm An Độ va Gừng (Zingiber officinalis) trộn vào thức ăn với liều lượng là 2.000 mg/kg và công độc lại với WSSV cho thấy RPS tới 60%.

Theo Bui Thị Thanh Tinh và ctv, (2018), đã đánh giá in vitro 15 loai cao chiét thao dugc cho thay 8 loại thao dược có hoạt tính kháng WSSV ở nông độ khảo sát 0,0025 mg/mL. Theo Sanjoy Banerjee và ctv., (2013), nước ép lá Neem (Azadirachta indica) có hoạt tính kháng khuẩn và rất hữu ich trong việc ức chế Vibrio spp. Từ những kết quả tích cực ké trên, cho thấy cao chiết thảo duoc đang mang đến những dấu hiệu tích cực trong việc phòng ngừa WSSV. Vi thế, nhóm nghiên cứu trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM đã chiết xuất hoạt chất từ cao chiết Neem bằng các loại dung môi khác nhau và kết hợp với Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.