Phân lập và đánh giá hoạt tính kháng sinh ở vi nấm liên kết trên hải miên ở vùng biển bắc bộ việt nam

Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh từ vi nấm liên kết trên hải miên vùng biển Bắc Bộ Việt Nam mở ra tiềm năng… 76 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2022.

• Tác giả: Vũ Thị Thanh An
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Đình Luyện
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Sinh Của Vi Nấm Liên Kết Trên Hải Miên Bắc Bộ Việt Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sự đa dạng của vi sinh vật biển Việt Nam
• 1.2. Lý do chọn Hải miên làm đối tượng nghiên cứu
• 1.3. Giới thiệu về Hải Miên
• 1.4. Đánh giá hệ vi sinh vật trên bọt biển
• 1.5. Các nghiên cứu khoa học về Hải miên
• 1.6. Các nghiên cứu khoa học trên thế giới về tách chiết Hải miên để tìm hợp chất thứ cấp hiện nay
• 1.7. Các hợp chất sinh học được sinh tổng hợp từ vi sinh vật liên kết trên Hải miên ở Việt Nam
• 1.8. Vi sinh vật liên kết với Hải Miên
• 1.9. Nội dung thực hiện đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và môi trường nghiên cứu
• 2.2. Thu thập mẫu và các vi sinh vật kiểm định
• 2.3. Môi trường nghiên cứu
• 2.4. Hoá chất và dụng cụ nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp lấy mẫu
• 2.5.2. Phương pháp phân lập các chủng vi nấm liên kết trên Hải Miên
• 2.5.3. Phương pháp sàng lọc các chủng nấm có hoạt tính kháng VSVKĐ, bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
• 2.5.4. Phương pháp lên men và thu cao chiết của chủng vi nấm lựa chọn
• 2.5.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng VSVKĐ của cặn chiết Ethylacetate của các chủng
• 2.5.6. Xác định đặc điểm hình thái và phân loại vi nấm biển
• 2.5.7. Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm liên kết trên Hải miên
• 3.2. Kết quả sàng lọc các chủng nấm có hoạt tính kháng VSVKĐ, bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
• 3.3. Kết quả sàng lọc các chủng nấm có hoạt tính kháng VSVKĐ
• 3.4. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm tuyển chọn được
• 3.5. Kết quả xác định hoạt tính kháng VSVKĐ từ cặn chiết ethylacetate của các chủng nấm
• 3.6. Kết quả điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của vi nấm
• 3.6.1. Thời gian lên men
• 3.6.2. Ảnh hưởng của pH môi trường
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Sinh Vi Nấm Hải Miên

Nghiên cứu hoạt tính kháng sinh từ vi nấm liên kết trên hải miên vùng biển Bắc Bộ Việt Nam mở ra tiềm năng khai thác nguồn dược liệu mới. Hải miên, với cấu trúc phức tạp và hệ vi sinh vật phong phú, là môi trường lý tưởng để vi nấm phát triển và sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất này có thể ứng dụng trong y học, nông nghiệp và công nghiệp. Việc phân lập và đánh giá hoạt tính kháng sinh của vi nấm này là bước đầu quan trọng trong việc khám phá các nguồn tài nguyên biển, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế biển bền vững. Nghiên cứu này tập trung vào vi nấm cộng sinh, có thể là chìa khóa cho các loại thuốc mới.

1.1. Sự Đa Dạng Sinh Học của Vi Nấm trên Hải Miên

Hệ vi sinh vật trên hải miên vô cùng đa dạng và phức tạp, bao gồm vi khuẩn, vi tảo, và đặc biệt là vi nấm. Nghiên cứu tập trung vào việc khám phá sự đa dạng này, tìm kiếm những chủng vi nấm có khả năng sản xuất các hợp chất kháng sinh độc đáo. Sự đa dạng này được đánh giá thông qua các phương pháp phân lập, nuôi cấy và xác định đặc điểm hình thái, di truyền của vi nấm. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng về sự phong phú của vi nấm trên hải miên và tiềm năng ứng dụng của chúng.

1.2. Vai Trò Sinh Thái của Vi Nấm trong Hệ Sinh Thái Hải Miên

Vai trò của vi nấm trong hệ sinh thái hải miên vẫn còn là một lĩnh vực chưa được khám phá đầy đủ. Vi nấm có thể tham gia vào các quá trình dinh dưỡng, bảo vệ hải miên khỏi các tác nhân gây bệnh, hoặc thậm chí là tạo ra các hợp chất có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của hải miên. Việc hiểu rõ vai trò sinh thái của vi nấm sẽ giúp chúng ta khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên này, đồng thời bảo vệ và duy trì sự cân bằng của hệ sinh thái biển.

II. Thách Thức Khai Thác Hoạt Tính Kháng Sinh Từ Vi Nấm Biển

Việc khai thác hoạt tính kháng sinh từ vi nấm biển đối mặt với nhiều thách thức. Đầu tiên, việc phân lập và nuôi cấy vi nấm biển đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và môi trường nuôi cấy đặc biệt. Thứ hai, vi nấm biển thường sản xuất các hợp chất kháng sinh với hàm lượng thấp, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất và tinh chế. Cuối cùng, việc xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính của các hợp chất này cũng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và đội ngũ chuyên gia có kinh nghiệm. Vượt qua những thách thức này là chìa khóa để mở ra tiềm năng to lớn của vi nấm biển trong lĩnh vực dược phẩm.

2.1. Khó Khăn trong Phân Lập và Nuôi Cấy Vi Nấm Biển

Môi trường biển có độ mặn cao, áp suất lớn và thành phần dinh dưỡng đặc biệt, tạo ra những điều kiện sống khắc nghiệt cho vi nấm. Việc phân lập và nuôi cấy vi nấm biển đòi hỏi phải mô phỏng chính xác các điều kiện này trong phòng thí nghiệm. Các phương pháp truyền thống thường không hiệu quả, dẫn đến việc bỏ sót nhiều chủng vi nấm có tiềm năng. Các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc phát triển các môi trường nuôi cấy đặc biệt và các kỹ thuật phân lập tiên tiến để vượt qua những khó khăn này.

2.2. Hàm Lượng Thấp của Hợp Chất Kháng Sinh Tự Nhiên

Vi nấm biển thường sản xuất các hợp chất kháng sinh với hàm lượng rất thấp, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất và tinh chế. Để thu được một lượng đáng kể hợp chất kháng sinh, cần phải nuôi cấy một lượng lớn vi nấm, tốn kém về thời gian, công sức và chi phí. Các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các phương pháp để tăng cường sản xuất hợp chất kháng sinh của vi nấm, chẳng hạn như tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, sử dụng các chất kích thích sinh học, hoặc áp dụng công nghệ sinh học phân tử.

III. Phương Pháp Phân Lập Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Sinh

Nghiên cứu sử dụng phương pháp phân lập vi nấm từ hải miên bằng kỹ thuật cấy trực tiếp và pha loãng liên tục. Sau khi phân lập, các chủng vi nấm được sàng lọc hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Các chủng có hoạt tính cao được lên men để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học. Cuối cùng, các hợp chất này được xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi sinh vật kiểm định. Đây là quy trình cơ bản để khám phá và khai thác nguồn dược liệu tiềm năng từ vi nấm biển.

3.1. Quy Trình Phân Lập và Sàng Lọc Vi Nấm Liên Kết

Quy trình bắt đầu bằng việc thu thập mẫu hải miên từ vùng biển Bắc Bộ Việt Nam. Các mẫu được xử lý và cấy trên môi trường thạch đặc biệt để phân lập vi nấm. Sau khi vi nấm phát triển, các chủng khác nhau được phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Các chủng có vòng kháng khuẩn lớn được chọn lọc để tiếp tục nghiên cứu.

3.2. Lên Men và Chiết Xuất Hợp Chất Kháng Sinh Tự Nhiên

Các chủng vi nấm được chọn lọc được lên men trong môi trường lỏng hoặc rắn để sản xuất các hợp chất kháng sinh. Sau khi lên men, các hợp chất này được chiết xuất bằng dung môi hữu cơ. Quá trình chiết xuất cần được tối ưu hóa để thu được hàm lượng cao nhất các hợp chất kháng sinh.

3.3. Thử nghiệm Kháng Sinh và Phân Tích Hóa Học

Cao chiết từ quá trình lên men được thử nghiệm hoạt tính kháng sinh đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh. Các thử nghiệm này xác định khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm gây bệnh. Sau đó, các hợp chất có hoạt tính kháng sinh được phân tích bằng các phương pháp hóa học như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ (MS) để xác định cấu trúc.

IV. Kết Quả Hoạt Tính Kháng Sinh của Vi Nấm Phân Lập Được

Nghiên cứu đã phân lập được nhiều chủng vi nấm từ hải miên vùng biển Bắc Bộ Việt Nam, một số chủng cho thấy hoạt tính kháng sinh mạnh mẽ đối với các chủng vi khuẩn kiểm định. Cặn chiết ethylacetate từ các chủng nấm thể hiện tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc mới. Các kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc tìm kiếm nguồn dược liệu biển tiềm năng, đặc biệt là từ các vi nấm cộng sinh.

4.1. Danh Sách Các Chủng Vi Nấm Triển Vọng

Nghiên cứu đã xác định được một số chủng vi nấm có hoạt tính kháng sinh cao, bao gồm các chủng thuộc chi Aspergillus, Penicillium, và Fusarium. Các chủng này có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gram dương và gram âm, cũng như các loại nấm gây bệnh.

4.2. Hiệu Quả Kháng Sinh Đối Với Các Chủng Vi Khuẩn Kiểm Định

Cặn chiết ethylacetate từ các chủng vi nấm đã cho thấy hiệu quả kháng sinh đáng kể đối với các chủng vi khuẩn kiểm định như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và Pseudomonas aeruginosa. Vòng kháng khuẩn của một số chủng đạt kích thước lớn, cho thấy hoạt tính mạnh mẽ.

V. Ứng Dụng Phát Triển Dược Phẩm Từ Vi Nấm Biển Việt Nam

Kết quả nghiên cứu có tiềm năng ứng dụng lớn trong việc phát triển các loại dược phẩm mới từ nguồn tài nguyên vi nấm biển Việt Nam. Các hợp chất kháng sinh từ vi nấm có thể được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn và nấm gây ra. Việc phát triển các dược phẩm này không chỉ góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng mà còn mang lại giá trị kinh tế cao.

5.1. Tiềm Năng Điều Trị Bệnh Nhiễm Trùng

Các hợp chất kháng sinh từ vi nấm biển có thể được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn và nấm gây ra, đặc biệt là các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc. Việc phát triển các loại thuốc mới từ nguồn tài nguyên này sẽ giúp giải quyết vấn đề kháng thuốc ngày càng gia tăng.

5.2. Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp và Thú Y

Ngoài lĩnh vực y học, các hợp chất kháng sinh từ vi nấm biển cũng có thể được ứng dụng trong nông nghiệp và thú y để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra trên cây trồng và vật nuôi. Việc sử dụng các sản phẩm sinh học này sẽ giúp giảm thiểu việc sử dụng các loại thuốc hóa học độc hại, bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Vi Nấm Hải Miên

Nghiên cứu đã khẳng định tiềm năng to lớn của vi nấm liên kết trên hải miên vùng biển Bắc Bộ Việt Nam trong việc sản xuất các hợp chất kháng sinh. Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định cấu trúc chi tiết của các hợp chất có hoạt tính sinh học, đánh giá độc tính và hiệu quả điều trị của chúng, cũng như phát triển các phương pháp sản xuất quy mô lớn để đưa các sản phẩm này ra thị trường.

6.1. Nghiên Cứu Sâu Hơn về Cơ Chế Tác Động của Hợp Chất Kháng Sinh

Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất kháng sinh từ vi nấm biển là rất quan trọng để hiểu rõ cách chúng tiêu diệt vi khuẩn và nấm gây bệnh. Nghiên cứu này sẽ giúp tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ kháng thuốc.

6.2. Phát Triển Công Nghệ Lên Men và Chiết Xuất Hiệu Quả Cao

Phát triển các công nghệ lên men và chiết xuất hiệu quả cao là yếu tố then chốt để sản xuất quy mô lớn các hợp chất kháng sinh từ vi nấm biển. Các công nghệ này cần đảm bảo hiệu suất cao, chi phí thấp và thân thiện với môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hải miên (ngành Porifera) là nhóm động vật không xương sống cổ xưa sống bám và ăn lọc, phân bố rộng khắp các vùng biển trên thế giới. Do phải cạnh tranh sinh tồn trong môi trường biển khắc nghiệt và liên tục lọc qua cơ thể một lượng lớn nước biển, hải miên trở thành vật chủ lý tưởng chứa đựng các cộng đồng vi sinh vật cộng sinh và liên kết phong phú, bao gồm vi khuẩn, vi nấm và xạ khuẩn. Các nghiên cứu hóa sinh hiện đại đã chỉ ra rằng phần lớn các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao (như polyketides, nonribosomal peptides, alkaloids, terpenoids, steroids) từng được phân lập từ mô hải miên thực chất do các vi sinh vật liên kết tổng hợp nên.

So với việc khai thác một khối lượng lớn sinh khối hải miên tự nhiên – vốn gây tổn hại nghiêm trọng đến hệ sinh thái biển và tốn kém chi phí – việc phân lập và nuôi cấy các vi sinh vật liên kết mở ra hướng tiếp cận bền vững, hiệu quả nhằm thu nhận các hoạt chất tự nhiên có tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm và công nghệ sinh học. Trong khi vi khuẩn và xạ khuẩn biển đã được khảo sát tương đối nhiều, vi nấm liên kết với hải miên tồn tại với mật độ thấp hơn nhưng lại sở hữu nguồn gen sinh tổng hợp phong phú và độc đáo.

Tại Việt Nam, vùng biển nhiệt đới với đường bờ biển dài và nhiều đảo tạo nên hệ sinh thái sinh vật biển phong phú. Tuy nhiên, các dẫn liệu khoa học về sự đa dạng và tiềm năng sinh học của vi nấm liên kết trên hải miên tại khu vực vịnh Bắc Bộ vẫn còn rất hạn chế. Khóa luận tốt nghiệp được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này thông qua các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

• Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá sự đa dạng hình thái và lựa chọn các chủng vi nấm liên kết với hải miên tại vùng biển Bắc Bộ Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kháng sinh đối kháng với vi sinh vật kiểm định.
• Nhiệm vụ nghiên cứu:
  1. Thu thập các mẫu hải miên tại vùng biển Hải Phòng, tiến hành phân lập và làm thuần các chủng vi nấm liên kết (bao gồm cả dạng nội sinh và ngoại sinh).
  2. Phân loại sơ bộ các chủng vi nấm dựa trên đặc điểm hình thái học đại thể và vi thể dưới kính hiển vi quang học.
  3. Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định qua phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp đục lỗ thạch từ dịch lên men.
  4. Lên men môi trường rắn (RYE) đối với các chủng nấm tuyển chọn, ngâm chiết bằng ethyl acetate và đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên phiến vi lượng 96 giếng đối với 8 chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn.
  5. Khảo sát sơ bộ các điều kiện lên men rắn (thời gian lên men, nồng độ muối, pH môi trường) ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kháng sinh của các chủng nấm tuyển chọn.
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng: Các chủng vi nấm phân lập từ 07 mẫu hải miên (ký hiệu: HM01, BLVHM02, MXSHM, HM01HG, SHMO5, RB02IS2, SHCO13) thu thập tại vùng vịnh Hải Phòng, Việt Nam.
  • Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) phối hợp với Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và tiêu chuẩn phân loại

Nghiên cứu ứng dụng các nguyên lý vi sinh vật học biển và phân loại học vi nấm truyền thống. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và cấu trúc vi học của các chủng nấm được định loại và đối chiếu theo các tài liệu chuyên khảo quốc tế:

• Khóa phân loại chi Penicillium và Aspergillus của Raper & Thom (1949).
• Hệ thống phân loại nấm sợi và nấm biển của Stolk & Samson (1972), Samson và cộng sự (2011), Crous & Groenewald (2015).
• Đánh giá hoạt tính kháng sinh in vitro và xác định giá trị MIC trên phiến vi lượng 96 giếng dựa trên quy trình chuẩn của Vander Bergher và Vlietlinck (1991).

Hệ sinh phẩm, hóa chất và môi trường nuôi cấy

Thực nghiệm sử dụng hệ thống 8 chủng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) lưu giữ tại Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên:

• Vi khuẩn Gram dương: Bacillus subtilis ATCC 27212, Staphylococcus aureus ATCC 12222.
• Vi khuẩn Gram âm: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923.
• Nấm men: Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754, Candida albicans SH 20.
• Nấm mốc: Aspergillus niger 439, Fusarium oxysporum M24.

Các chất đối chứng dương sử dụng trong thử nghiệm kháng sinh gồm: Ampicillin (nồng độ 50 mM, đặc hiệu vi khuẩn Gram dương), Tetracyclin (nồng độ 10 mM, đặc hiệu vi khuẩn Gram âm) và Nystatin B (đặc hiệu nấm men, nấm mốc) được pha trong DMSO 100%. Đối chứng âm là dịch môi trường nuôi cấy không bổ sung hoạt chất kháng sinh.

Các môi trường nuôi cấy được chuẩn bị theo công thức chuẩn:

• Môi trường nấm biển thạch và dịch thể: Pepton 10 g/l, Glucose 20 g/l, NaCl 30 g/l, Kis-penicillin 30 g/l, Agar 18–20 g/l (đối với môi trường thạch).
• Môi trường nuôi cấy và kiểm định: Môi trường Hansen thạch/dịch thể (Glucose 50 g, Pepton 10 g, KH2PO4 3 g, MgSO4), Môi trường Nutrient Agar (NA - 014: Pepton 5 g, cao thịt 2 g, NaCl 1 g, Agar 18 g, pH 7), Môi trường Czapeck-Dox (Saccharose 30 g, NaNO3 3 g, K2HPO4 1 g, MgSO4).
• Môi trường lên men rắn (RYE): Chuẩn bị trong bình Erlenmeyer dung tích 1000 ml chứa 50 g gạo, 0,05 g cao nấm men, 0,02 g KH2PO4 và 50 ml nước biển (30 g/l NaCl).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm được triển khai tuần tự qua các bước:

1. Lấy mẫu và xử lý mẫu hải miên: Mẫu hải miên cắt đoạn 5–10 cm được vô trùng bề mặt bằng nước muối sinh lý 0,9% và cồn 70° (lắc trong 1–3 phút).
2. Phân lập vi nấm: Phân lập ngoại sinh bằng cách cấy trực tiếp 5 mẩu mô hải miên lên đĩa thạch nấm biển. Phân lập nội sinh bằng cách nghiền nát mô mẫu trong nước muối 0,9%, pha loãng theo các nồng độ $10^{-1}$, $10^{-2}$, $10^{-3}$, trải 150 µl dịch huyền phù lên đĩa thạch và ủ ở nhiệt độ 28°C trong 4 ngày.
3. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn:
   • Sàng lọc sơ bộ: Cấy chuyển sợi nấm thuần lên đĩa thạch đã trải sẵn 150 µl dịch VSVKĐ, ủ lạnh 1 giờ để khuếch tán rồi ủ ấm 24 giờ.
   • Sàng lọc thứ cấp: Nuôi lắc các chủng có hoạt tính trong môi trường nấm biển dịch thể 7 ngày, dùng khoan nút chai đục lỗ đường kính 1 cm trên thạch kiểm định, nhỏ dịch lên men và đo đường kính vòng kháng khuẩn sau 24 giờ ủ ấm ở 30°C.
4. Lên men rắn và thu hồi cao chiết: Nuôi cấy vi nấm tuyển chọn trên môi trường RYE trong 28 ngày ở nhiệt độ phòng. Ngâm chiết sinh khối và cơ chất bằng dung môi ethyl acetate (200 ml/bình 500 ml) trong 48 giờ (lặp lại 3 lần), sau đó cô quay chân không ở 40°C để thu hồi cặn chiết thô.
5. Xác định giá trị MIC trên phiến 96 giếng: Hòa tan cặn chiết trong DMSO, pha loãng theo dãy nồng độ giảm dần (200, 100, 50, 25, 12,5 µg/ml). Trộn 10 µl dịch mẫu với 190 µl dịch nuôi cấy VSVKĐ trong từng giếng, ủ ấm 1–2 ngày và xác định nồng độ thấp nhất làm giếng trong suốt hoàn toàn.
6. Khảo sát điều kiện lên men: Khảo sát các dải thông số gồm thời gian lên men (12–28 ngày), nồng độ muối biển bổ sung (10, 20, 25, 30, 33, 37, 40, 42 g/l) và pH môi trường (4, 5, 6, 7, 8, 9).

Nội dung chính theo từng chương

LỜI MỞ ĐẦU và TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương tổng quan tập trung hệ thống hóa các tư liệu nghiên cứu về sự đa dạng của vi sinh vật biển và vai trò của hải miên như một nguồn cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học. Tác giả phân tích cấu tạo giải phẫu, các kiểu cấu trúc cơ thể của hải miên (ascon, sycon, leucon, ragon) và cơ chế ăn lọc tạo điều kiện cho các vi sinh vật cư trú nội bào và ngoại bào. Phần tổng quan cũng điểm lại các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về các hợp chất tự nhiên tách chiết từ hải miên (như các dẫn xuất steroid, sesquiterpene, triterpene isomalabaricane, alkaloid bisquinolizidine) có hoạt tính gây độc tế bào ung thư và ức chế vi sinh vật gây bệnh. Qua đó, tác giả khẳng định việc nghiên cứu vi nấm liên kết trên hải miên là hướng tiếp cận cần thiết do tính chất sinh trưởng nhanh, khả năng nuôi cấy nhân tạo và tiềm năng sinh tổng hợp các hợp chất mới.

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc 07 mẫu hải miên thu thập tại vùng biển Hải Phòng, danh mục 8 chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn, các trang thiết bị phân tích (kính hiển vi Axio Olympus, tủ cấy vô trùng, máy đo mật độ quang Infinite F50 Tecan, máy cô quay chân không) và nguồn gốc các hóa chất đạt chuẩn tinh khiết. Toàn bộ quy trình phân lập ngoại sinh, nội sinh, tinh sạch giống, phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn định tính qua vòng khuếch tán thạch, phương pháp định lượng MIC trên phiến vi lượng 96 giếng và các bước bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện lên men rắn RYE đều được trình bày rõ ràng, chuẩn hóa theo các tài liệu tham khảo chuyên ngành.

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương III trình bày toàn bộ các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

1. Kết quả phân lập và đánh giá đa dạng hình thái: Từ 07 mẫu hải miên nuôi cấy trên môi trường nấm biển thạch ở 28°C trong 4 ngày, đã phân lập được 54 chủng vi nấm thuần. Sự đa dạng về hình thái biểu hiện qua 7 nhóm màu sắc khuẩn lạc và 5 dạng cấu trúc hệ sợi:
   • Phân bố màu sắc khuẩn lạc: Màu xanh chiếm ưu thế với 20 chủng (37,0%), màu trắng có 19 chủng (35,2%), màu vàng có 6 chủng (11,1%), màu hồng có 3 chủng (5,5%), màu cam có 3 chủng (5,5%), màu nâu có 2 chủng (3,7%) và màu đen có 1 chủng (1,85%).
   • Phân bố đặc điểm hệ sợi: Dạng bông sợi chiếm tỷ lệ cao nhất với 34 chủng (63,0%), dạng sợi thưa có 10 chủng (18,5%), dạng nhăn có 4 chủng (7,4%), dạng trơn có 3 chủng (5,5%) và dạng hạt có 3 chủng (5,5%).

STT	Đặc điểm hệ sợi	Số lượng chủng	Tỷ lệ (%)
1	Bông sợi	34	63,0%
2	Sợi thưa	10	18,5%
3	Nhăn	4	7,4%
4	Trơn	3	5,5%
5	Hạt	3	5,5%
Tổng	5 dạng cấu trúc	54	100%

2. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định:
   • Sàng lọc sơ bộ trên thạch: Trong 54 chủng phân lập, có 22 chủng (40,7%) thể hiện hoạt tính kháng ít nhất một chủng VSVKĐ; 32 chủng (59,3%) không thể hiện hoạt tính; 12 chủng (22,2%) kháng được 1–3 chủng VSVKĐ và 10 chủng (18,5%) kháng được 4–5 chủng VSVKĐ. Về phổ kháng: 20/22 chủng có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram âm (90,9%), 19/22 chủng kháng vi khuẩn Gram dương (86,4%), 12/22 chủng kháng nấm men (54,5%) và 0/22 chủng có khả năng ức chế nấm mốc.
   • Sàng lọc thứ cấp (lên men dịch thể 7 ngày, phương pháp đục lỗ thạch): Thử nghiệm lại 22 chủng có hoạt tính cho thấy 17 chủng (77,3%) mất hoạt tính, 3 chủng (13,6%) kháng 1–3 loài và 2 chủng (9,1%) kháng được 4–5 loài VSVKĐ. Hai chủng có hoạt tính mạnh nhất được ký hiệu là NH1 và NH2 (ức chế 5/8 chủng VSVKĐ, đạt tỷ lệ 62,5%).

Chủng vi nấm	B. subtilis	S. aureus	E. coli	P. aeruginosa	S. cerevisiae	C. albicans	A. niger	F. oxysporum	Tỷ lệ ức chế
NH1	+	+	++	-	++	-	++	-	5/8 (62,5%)
NH2	++	++	++	-	++	-	+	-	5/8 (62,5%)

Ghi chú: (-) không có hoạt tính; (+) vòng kháng khuẩn < 1 cm; (++) vòng kháng khuẩn 1–2 cm.

3. Đặc điểm hình thái học của hai chủng nấm tuyển chọn:

   • Chủng NH1: Khuẩn lạc sinh trưởng chậm trên môi trường nấm biển (đạt đường kính 2,5–3,0 cm sau 7 ngày ở 28°C). Bào tử đính dạng hình kim mọc từ 1 đến 3 bào tử; bào tử nhẵn, hình elip với kích thước 23 × 1,5–2,5 µm; cuống sinh bào tử có thành dày; sợi nấm có vách ngăn rõ rệt. Dựa trên đặc điểm vi học, chủng NH1 được dự báo sơ bộ thuộc chi Talaromyces sp.
   • Chủng NH2: Khuẩn lạc sinh trưởng nhanh (đạt đường kính 4 cm sau 4 ngày ở 28°C), hệ sợi tròn dày bông xốp màu trắng sữa nhạt dần ra mép, mép viền liền, không có giọt tiết bề mặt, tiết sắc tố hòa tan màu nâu vào môi trường. Cuống sinh bào tử dạng ống mọc trực tiếp từ sợi nấm, thành mịn thon ở đỉnh (kích thước 12–20 × 1,5–2,0 µm); sợi nấm phân nhánh; túi sinh bào tử hình bầu dục kích thước 3–3,5 × 2–3 µm. Chủng NH2 được dự báo sơ bộ thuộc chi Aspergillus sp.

4. Hoạt tính kháng sinh của cặn chiết Ethyl acetate (giá trị MIC): Cặn chiết thô từ sinh khối lên men rắn RYE của cả 2 chủng đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh với giá trị MIC dao động từ 50 đến 100 µg/ml đối với 5 chủng kiểm định, không ức chế được P. aeruginosa, C. albicans và F. oxysporum.

STT	Ký hiệu mẫu	Nồng độ ban đầu (µg/ml)	E. coli	P. aeruginosa	B. subtilis	S. aureus	S. cerevisiae	C. albicans	F. oxysporum	A. niger
1	NH1	200	50	(-)	50	100	50	(-)	(-)	50
2	NH2	200	50	(-)	50	50	100	(-)	(-)	50

Ghi chú: (-) không biểu hiện hoạt tính ức chế ở dải nồng độ thử nghiệm.

5. Kết quả khảo sát điều kiện lên men rắn RYE:
   • Thời gian lên men: Quá trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp và tích lũy hàm lượng cao chiết tăng dần theo thời gian nuôi cấy, đạt mức tối ưu ở giai đoạn cân bằng từ 18 đến 28 ngày.
   • Nồng độ muối và pH: Hoạt tính kháng sinh của chủng nấm duy trì ổn định trong dải độ mặn nước biển (tối ưu quanh mức 30–33 g/l NaCl) và dải pH trung tính đến kiềm nhẹ (pH 6–8), phản ánh tính thích nghi sinh lý đối với môi trường sống tự nhiên trong mô hải miên biển.

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Chương kết luận tổng kết lại các chỉ số đạt được về số lượng chủng phân lập, mức độ đa dạng màu sắc và hệ sợi, lựa chọn được 2 chủng ưu việt NH1 (Talaromyces sp.) và NH2 (Aspergillus sp.) cùng các thông số hoạt tính kháng sinh định lượng. Kiến nghị tập trung vào việc giải trình tự gen sinh học phân tử để định danh chính xác loài và tiến hành tinh sạch cấu trúc hóa học của các chất kháng sinh trong dịch chiết.

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

• Phân lập thành công 54 chủng vi nấm thuần từ 07 mẫu hải miên thu thập tại vùng biển Hải Phòng, xác lập cơ sở dữ liệu ban đầu về đặc tính hình thái khuẩn lạc (7 nhóm màu và 5 dạng hệ sợi).
• Đánh giá được phổ kháng sinh in vitro của tập đoàn vi nấm: 40,7% số chủng có hoạt tính ở bước sàng lọc sơ bộ và 9,1% số chủng giữ được hoạt tính ức chế đa vi sinh vật sau lên men dịch thể.
• Tuyển chọn được 2 chủng nấm tiềm năng NH1 (dự báo thuộc chi Talaromyces sp.) và NH2 (dự báo thuộc chi Aspergillus sp.) có khả năng ức chế 5/8 chủng VSVKĐ thử nghiệm.
• Xác định được giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cặn chiết ethyl acetate từ 2 chủng tuyển chọn: ức chế E. coli, B. subtilis, A. niger ở nồng độ 50 µg/ml; ức chế S. aureus và S. cerevisiae ở nồng độ từ 50 đến 100 µg/ml.
• Xác định được các điều kiện lên men rắn cơ bản trên môi trường RYE (thời gian nuôi cấy 18–28 ngày, độ mặn 30–33 g/l, pH 6–8) giúp tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh.

Đóng góp của đề tài

• Đây là một trong những công trình thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam khảo sát một cách có hệ thống về khu hệ vi nấm liên kết trên hải miên tại vùng biển vịnh Bắc Bộ.
• Chứng minh được tiềm năng ứng dụng của vi nấm liên kết hải miên trong việc sản xuất các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm chọn lọc, mở ra hướng nghiên cứu mới thay thế cho việc khai thác trực tiếp mô động vật biển.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của khóa luận

• Việc định danh 2 chủng nấm triển vọng NH1 và NH2 mới dừng lại ở mức độ phân loại hình thái học vi thể và đại thể (dự báo cấp chi), chưa tiến hành tách chiết DNA và giải trình tự vùng phiên mã nội bộ (vùng gen ITS/18S rDNA) để xác định chính xác tên loài.
• Dịch chiết ethyl acetate mới dừng lại ở mức cặn chiết thô tổng số; chưa thực hiện sắc ký phân đoạn để cô lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học phân tử của các hợp chất kháng sinh chịu trách nhiệm cho hoạt tính.
• Các khảo sát điều kiện lên men (thời gian, nồng độ muối, pH) mới khảo sát đơn yếu tố trên môi trường rắn RYE, chưa áp dụng các mô hình tối ưu hóa đa yếu tố (Response Surface Methodology - RSM).

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiến hành tách chiết DNA tổng số, nhân bản và giải trình tự đoạn gen ITS1-5.8S-ITS2 để định danh chính xác loài đối với chủng NH1 và NH2.
• Quy mô hóa quá trình lên men rắn trên môi trường RYE để thu nhận lượng lớn cao chiết; sử dụng các phương pháp sắc ký (sắc ký cột, HPLC) kết hợp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối (MS) nhằm phân lập, giải mã cấu trúc hóa học các hoạt chất kháng sinh tinh khiết.
• Mở rộng đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được trên các dòng tế bào ung thư người và các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc (MRSA, VRE).

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Dược học, Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên và Sinh học Biển.
• Nội dung giá trị:
  • Quy trình kỹ thuật phân lập vi sinh vật liên kết biển (phân lập nội sinh và ngoại sinh từ mô động vật không xương sống).
  • Phương pháp tích hợp sàng lọc hoạt tính sinh học từ thử nghiệm khuếch tán trên đĩa thạch đến đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên phiến 96 giếng.
  • Công thức môi trường lên men rắn RYE (Rice Yeast Extract) và quy trình chiết tách cặn ethyl acetate từ cơ chất nấm biển.

Câu hỏi thường gặp

1. Đề tài đã thu thập bao nhiêu mẫu hải miên và phân lập được tất cả bao nhiêu chủng vi nấm thuần?

Tác giả đã thu thập 07 mẫu hải miên tại khu vực vịnh Hải Phòng (vùng biển Bắc Bộ, Việt Nam) với các ký hiệu mẫu: HM01, BLVHM02, MXSHM, HM01HG, SHMO5, RB02IS2 và SHCO13. Từ 07 mẫu này, sau khi xử lý vô trùng bề mặt và nuôi cấy trên môi trường nấm biển thạch ở 28°C trong 4 ngày, đã phân lập và làm sạch được tổng cộng 54 chủng vi nấm khác nhau.

2. Sự đa dạng hình thái của 54 chủng vi nấm được phân lập thể hiện qua những đặc điểm nào?

Sự đa dạng của 54 chủng nấm biểu hiện rõ nét qua màu sắc khuẩn lạc và cấu trúc hệ sợi:

• Về màu sắc (7 nhóm): Màu xanh chiếm tỷ lệ cao nhất với 20 chủng (37,0%), màu trắng có 19 chủng (35,2%), màu vàng có 6 chủng (11,1%), màu hồng có 3 chủng (5,5%), màu cam có 3 chủng (5,5%), màu nâu có 2 chủng (3,7%) và màu đen có 1 chủng (1,85%).
• Về hệ sợi (5 dạng): Dạng bông sợi chiếm đa số với 34 chủng (63,0%), dạng sợi thưa có 10 chủng (18,5%), dạng nhăn có 4 chủng (7,4%), dạng trơn có 3 chủng (5,5%) và dạng hạt có 3 chủng (5,5%).

3. Hai chủng vi nấm NH1 và NH2 được tuyển chọn có đặc điểm hình thái và phân loại sơ bộ như thế nào?

• Chủng NH1: Khuẩn lạc sinh trưởng chậm (đạt 2,5–3,0 cm sau 7 ngày ở 28°C); sợi nấm có vách ngăn; cuống sinh bào tử thành dày; bào tử đính hình kim mọc từ 1 đến 3 bào tử; bào tử nhẵn hình elip kích thước 23 × 1,5–2,5 µm. Dựa trên hình thái vi học, NH1 được dự báo thuộc chi Talaromyces sp.
• Chủng NH2: Khuẩn lạc sinh trưởng nhanh (đạt 4 cm sau 4 ngày ở 28°C); hệ sợi dày bông xốp màu trắng sữa; tiết sắc tố hòa tan màu nâu; sợi nấm phân nhánh; cuống sinh bào tử dạng ống mọc trực tiếp từ sợi nấm (kích thước 12–20 × 1,5–2,0 µm); túi sinh bào tử hình bầu dục kích thước 3–3,5 × 2–3 µm. NH2 được dự báo thuộc chi Aspergillus sp.

4. Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cặn chiết từ chủng NH1 và NH2 đối với các vi sinh vật kiểm định là bao nhiêu?

Thử nghiệm trên phiến vi lượng 96 giếng cho thấy cặn chiết ethyl acetate của cả hai chủng đều có hoạt tính kháng tốt đối với 5/8 chủng VSVKĐ:

• Đối với Escherichia coli, Bacillus subtilis và Aspergillus niger, cả NH1 và NH2 đều đạt giá trị MIC là 50 µg/ml.
• Đối với Staphylococcus aureus, chủng NH1 đạt MIC = 100 µg/ml trong khi NH2 đạt MIC = 50 µg/ml.
• Đối với Saccharomyces cerevisiae, chủng NH1 đạt MIC = 50 µg/ml trong khi NH2 đạt MIC = 100 µg/ml.
• Cả hai cặn chiết đều không thể hiện hoạt tính ức chế đối với Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans và Fusarium oxysporum ở dải nồng độ thử nghiệm.

5. Phương pháp lên men và dung môi nào đã được sử dụng để thu hồi các hợp chất thứ cấp?

Các chủng nấm tuyển chọn được lên men rắn trên môi trường RYE (chứa 50 g gạo, 0,05 g cao nấm men, 0,02 g KH2PO4 và 50 ml nước biển nồng độ muối 30 g/l) trong bình tam giác 1000 ml ở nhiệt độ phòng. Sau thời gian nuôi cấy 28 ngày, toàn bộ sinh khối nấm và cơ chất được ngâm chiết tĩnh với dung môi ethyl acetate (tỷ lệ 200 ml dung môi cho mỗi bình lên men 500 ml) trong thời gian 48 giờ, lặp lại quá trình chiết 3 lần và cô quay chân không ở 40°C để thu hồi cặn chiết thô.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Vũ Thị Thanh An đã thực hiện thành công việc phân lập 54 chủng vi nấm liên kết từ 07 mẫu hải miên thu thập tại vùng biển Hải Phòng, phản ánh tính đa dạng hình thái phong phú của khu hệ vi nấm biển Bắc Bộ. Nghiên cứu đã sàng lọc và tuyển chọn được hai chủng vi nấm có tiềm năng sinh học cao là NH1 (dự báo thuộc chi Talaromyces sp.) và NH2 (dự báo thuộc chi Aspergillus sp.) với khả năng ức chế 5/8 chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn ở dải nồng độ MIC từ 50 đến 100 µg/ml. Kết quả đạt được cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng về phương pháp nuôi cấy, lên men rắn và đánh giá hoạt tính kháng sinh in vitro, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về phân lập và tinh sạch các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị dược học từ nguồn tài nguyên sinh vật biển Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Hải miên là nguồn giàu các sản phẩm tự nhiên có giá trị nhƣ polyketides , nonribosomal peptides , và alkaloids. Phần lớn các sản phẩm biển tự nhiên đƣợc tách từ động vật không xƣơng sống nhƣ hải miên (sponge), động vật có vỏ (tunicate), động vật thân mềm (mollusk) và bryozoans. Rất nhiều hợp chất có hoạt tính độc tế bào (cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm. Hải miên có một lƣợng lớn các loại vi khuẩn khác nhau trong mô của chúng.

Vi sinh vật liên đới với hải miên có cả nội bào và ngoại bào. Hiện nay, cộng đồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chƣa đƣợc hiểu rõ. Có giả thuyết cho rằng vi khuẩn trong các cộng đồng này tổng hợp rất nhiều hợp chất hoạt tính sinh học liên đới (associated). Ngƣời ta cho rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên đới sinh ra.

Ví dụ diketopiperazines của Tedania ignis đƣợc quy cho là sản phẩm trao đổi chất của Micrococcus sp. liên kết với hải miên. Kháng sinh polybrominated biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea herbacea (Demospongiae) thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra. Vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P.

clavata đƣợc nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin. Trong khi để nuôi động vật không xƣơng sống để tách chiết các sản phẩm tự nhiên nói chung là đắt đỏ hoặc không thực hiện đƣợc , nuôi cấy vi sinh vật có thể cung cấp các hợp chất quan trọng có tiềm năng y dƣợc rẻ và số lƣợng lớn. Cả ngành công nghiệp y dƣợc và nông nghiệp đều cần các chất trao đổi có hoạt tính sinh học (HTSH) mới. Để giải quyết yêu cầu này, điều quan trọng là chọn đúng nguồn nguyên liệu ban đầu, có nghĩa là hoặc các sản phẩm tự nhiên hoặc tổng hợp bằng đƣờng hóa học.

Trong khi các sản phẩm tổng hợp có cấu trúc đa dạng, nhƣng chúng khó tƣơng thích với thụ thể của đích đặc hiệu , nhƣng các sản phẩm tự nhiên lại tƣơng thích tốt. Trong thập kỷ gần đây, vi sinh vật biển, nhƣ vi khuẩn, vi tảo và nấm càng trở nên quan trọng nhƣ nguồn sản phẩm 1 HTSH tự nhiên mới. Hải miên đƣợc biết là vật chủ của cộng đồng vi sinh vật lớn và vai trò của những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh dƣỡng và sự cộng sinh, hỗ sinh với hải miên. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Sự đa dạng của vi sinh vật biển Việt Nam Vi sinh vật biển hiện đang là đối tƣợng mà các nhà khoa học trên toàn thế giới quan tâm nghiên cứu cho mục đích tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học. Ngoài những vi sinh vật cố hữu trong trầm tích biển , vi sinh vật sống cùng sinh vật biển khác gần đây đƣợc nghiên cứu nhiều hơn và thu đƣợc nhiều thành qua đáng kể , ứng dụng tìm kiếm thuốc chữa bệnh trong vài thập kỷ qua. Trong bài này , chúng tôi điểm lại những mốc quan trọng trong quá trình tìm kiếm “ thuốc từ biển ” , đồng thời tổng quan một số kết quả nghiên cứu nổi bật gần nhất đƣợc công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới về sự đa dạng của vi sinh vật biển sống cùng động vật không xƣơng sống và tiềm năng ứng dụng nghiên cứu đƣợc của chúng. Vi sinh vật biển tuy đƣợc quan tâm muộn hơn so với vi sinh vật trên cạn, tính đến nay đã có khoảng hơn 1 triệu loài khác nhau đƣợc công bố.

Tuy nhiên, sự hiểu biết của chúng ta về vi sinh vật biển có thể chỉ là 0,01 % về sinh thái, di truyền và đặc tính sinh học, trong khi vi sinh vật có thể nuôi cấy ƣớc tính chỉ khoảng 0,1 % trong số các loài đƣợc phát hiện. Vi sinh vật biển sớm đƣợc nghiên cứu trong nƣớc và trầm tích biển, vì chúng đóng vai trò quan trọng trong chuỗi thức ăn và lƣới thức ăn. Bất kể ở môi trƣờng giàu hay nghèo dinh dƣỡng, vi sinh vật cũng có mặt và càng không thể thiếu trong thành phần tham gia vào quá trình tuần hoàn vật chất đặc biệt nhƣ C, N, P và S trong đại dƣơng. Gần đây, vi sinh vật đƣợc nghiên cứu nhằm tìm kiếm các chất tự nhiên có hoạt tính sinh học vì chúng đƣợc xem là nguồn chứa các hợp chất này và là nguyên liệu cho nghiên cứu phát triển thuốc mới từ thế kỷ 20.

Mặc dù có lịch sử phát triển rất ngắn so với thực vật và sinh vật trên cạn, 10% các chất tự nhiên có hoạt tính đang thử nghiệm sinh học lâm sàng hiện nay có nguồn gốc từ vi sinh vật. Điều đó cho thấy vi sinh vật biển là đối tƣợng đang đƣợc quan tâm nhất đồng thời 3 cũng là đối tƣợng có tiềm năng để nghiên cứu các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Ngày càng có nhiều bằng chứng xác thực về “ nhà sản xuất chính ” của các chất tự nhiên quan trọng , vốn dĩ đƣợc cho là do sinh vật biển (hải miễn, san hô, bryozoan, hải tiêu .) nhƣng lại đƣợc chứng minh là vi sinh vật tạo ra, cụ thể nhất là hải miên, san hô. Ví dụ Pseudopterosin một chất tự nhiên thuộc Diterpene có khả năng kháng viêm đƣợc phân lập từ san hô Pseudopterogorgia elisabethae.

Tuy nhiên khi nghiên cứu sinh tổng hợp Pseudopterosin thì phát hiên chính Symbiodinium sp., một loài tảo cộng sinh với vật chủ san hô mới chính là vi sinh vật tạo ra Pseudopterosin. Một vấn đề nữa vô cùng quan trọng, đã đƣợc đề cập và thảo luận, khi sự thật cho thấy từ những nghiên cứu tìm kiếm các chất có hoạt tính từ sinh vật biển đó là từ: Phải khai thác cả tấn hải miền, hải tiêu hay bryozoa, để có đƣợc 1g chất tinh sạch lần lƣợt là halichondrin, ecteinascidin hay bryostatin, chƣa kể đến những vấn đề không thể giải quyết đƣợc khi thực hiện nuôi trồng các sinh vật biển kể trên để thu nguyên liệu thô cho những nghiên cứu tiếp theo, ví dụ nhƣ dùng các chất thu đƣợc để thực hiện các thử nghiệm sinh học ở nhiều cấp độ trong quá trình nghiên cứu thuốc. Với đặc tính ƣu việt của vi sinh vật về thời gian và tốc độ sinh trƣởng cũng nhƣ đặc tính sinh học khác, thực sự vi sinh vật biển đang đƣợc nghiên cứu và chúng là đối tƣợng tiềm năng cho nghiên cứu thuốc trong tƣơng lai gần. Trong bài bảo tổng quan này, em sơ lƣợc những mốc nghiên cứu trong quá trình tìm kiếm “thuốc từ biển”, đồng thời tổng quan những kết quả nổi bật về nghiên cứu vi sinh vật biển, vi sinh vật sống cùng động vật không xƣơng sống biển cho mục đích tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong nghiên cứu y dƣợc đƣợc đăng tải trên các tạp chỉ có uy tín trên thế giới.

Lý do chọn Hải miên làm đối tƣợng nghiên cứu? Môi trƣờng biển phức tạp và khắc nghiệt cho nên tạo ra những vi sinh vật có hoạt tính có giá trị dƣợc phẩm, mĩ phẩm, kinh tế từ bọt biển, san hô, cỏ biển, rong biển, động vật biển,…) Trong đó, Hải miên có một số các hợp chất có cấu trúc hóa học mới luôn đƣợc phát hiện ra. Cấu trúc hóa học của các hợp chất mới từ hải miên cũng rất đa dạng nhƣ acid béo, glycolipid, macrolide, peptide, peroxide, polyketide, quinon, steroi, terpenoid, alkaloid, các dẫn xuất halogen. Phần lớn cấu trúc hóa học của các hợp chất từ hải miên rất độc đáo, khác với các hợp chất nhận đƣợc từ thực vật, vì vậy chúng có hoạt tính sinh học dị thƣờng. Việt Nam là nƣớc nhiệt đới, có bờ biển dài và nhiều đảo, tạo nên hệ sinh thái rất đa dạng cho các loài sinh vật biển.

Những nghiên cứu về hóa học và các hợp chất có hoạt tính sinh học từ biển đã đƣợc quan tâm từ những năm 2006 đến nay, trong đó có khá nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của hải miền biển ( Phan Van Kiem et al. , 2019 ) Từ những lợi ích đem lại ở trên, chúng tôi quyết định chọn Hải miên (Bọt biển) làm đối tƣợng nghiên cứu cho đề tài khoa học này. Giới thiệu về Hải Miên Hải miên hay còn gọi là Bọt biển (ngành Porifera) là động vật đáy không cuống, ăn lọc, sống trong các loại môi trƣờng khác nhau ở biển cũng nhƣ trong nƣớc ngọt, và trong tất cả các vùng khí hậu: từ các vùng cực và ôn đới, đến hệ 5 sinh thái rạn san hô nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tính đến năm 2019, khoảng 9.125 loài hải miên nói chung đƣợc chấp nhận có trong danh sách của Cơ sở dữ liệu hải miên thế giới, trong đó gồm 20.000 taxon (http://www.org/poriferal; văn Soest et al, 2012).

Vì vậy, các quần thể hải miên có sự khác biệt về sự đa dạng, sự phong phú và mật độ. Các loài hải miên đƣợc chia thành 4 lớp: Calcarea (hải miên đá vôi), Demospongia (demosponges), Hexactinellida (hải miên thủy tinh), và Homoscleromorpha. Lớp lớn nhất là Demospongia, gồm khoảng 83,4% tất cả các loài đƣợc biết. Hải miên có các hình dạng khác nhau, từ hình cầu, hình ống, hình bình hoặc phân nhánh và kích thƣớc cũng khác nhau, từ một vài milimet (hải miên Cliona celata), đến vài mét (hải miên Xestospongia muta).

Phần lớn hải miên là động vật ăn lọc, trừ các loài ăn thịt cƣ trú ở môi trƣởng biển sâu nghèo dinh dƣỡng (Lee et al. Hình dáng cơ thể chung của loài ăn lọc đƣợc chuyên môn hóa cho lọc nƣớc để lấy dinh dƣỡng, hô hấp và bài tiết. Phụ thuộc vào thiết kế của hệ thống lọc nƣớc, hải miên đƣợc chia thành: (1) Asconoid, khi cơ thể hải miên có hình trụ rỗng, bề mặt (wall) có các lỗ nhỏ; (2) Syconoid, khi bề mặt cơ thể hải miên có xen kẽ các túi (pockets) chui và trong và lỗi ra ngòi, làm tăng tỉ lệ giữa diện tích và thể tích; hoặc (3) Leuconoid, khi cơ thể hải miền đƣợc tạo thành bởi các kênh dẫn nƣớc bao gồm rất nhiều các khoang hình cầu nối với nhau bởi các ống giống nhƣ mao mạch. Cấu tạo Hải miên đƣợc coi là động vật đa bào chƣa hoàn thiện (Parazoa) vì có các đặc điểm sau: - Cơ thể đa bào nhƣng chƣa có mô phân hóa.

Có nhiều lỗ thủng trên thân, trong thân có các khe, rãnh. - Đối xứng phóng xạ hay chƣa có kiểu đối xứng ổn định. - Biểu bì có các tế bào gai dẹp, có lớp tế bào cổ áo làm nhiệm vụ dẫn nƣớc vào và đẩy nƣớc ra. 6 - Tầng trung gian khá dày có các tế bào amip và gai xƣơng.

Xƣơng là canxi, silic hay sợi collagen (spongin). - Chƣa có miệng, tiêu hóa nội bào, bài tiết và hô hấp bằng thẩm thấu.