Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học evaluate the antimicrobial and antioxidant activities of some lacticaseibacillus rhamnosus and streptococcus thermophilus strains

Khóa luận đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của một số chủng Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus.

• Tác giả: Truong Ngoc Hai Yen
• Người hướng dẫn: Assoc. Douglas Shyu
• Trường học: Nong Lam University Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh Giá Hoạt Động Kháng Khuẩn và Chống Oxy Hóa của Các Chủng Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus
• Loại tài liệu: Undergraduate thesis
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGMENTS
• CONFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: OVERVIEW
• 1.1. Synthetic antioxidants such as butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxy-anisole (BHA), and n-propyl gallate (PG)
• 1.2. Objective
• 1.3. Contents
• 2. CHƯƠNG 2: OVERVIEW
• 2.1. Introduction of lactic acid bacteria
• 2.2. Application
• 2.3. Introduction of Lacticaseibacillus rhamnosus
• 2.4. Studies related to Lacticaseibacillus rhamnosus
• 2.5. Introduction of Streptococcus thermophilus
• 2.6. Studies related to Streptococcus thermophilus strains
• 2.7. Introduction of reactive oxygen species
• 2.8. Introduction of some pathogenic microorganisms
• 3. CHƯƠNG 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Materials and equipment
• 3.2. Preparation of pathogenic
• 3.3. Cell-free supernatants (CFSs) preparation
• 3.4. Intact cells (ICs) preparation
• 3.5. Agar diffusion method
• 3.6. Antibiotic susceptibility testing method
• 3.7. Determination of the DPPH radical scavenging effect
• 3.8. Superoxide anion scavenging activity
• 3.9. Hydroxyl radical scavenging activity
• 4. CHƯƠNG 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Antibiotic susceptibility testing
• 4.2. DPPH scavenging method
• 4.3. Superoxide anion scavenging ability
• 4.4. Hydroxyl radical scavenging ability
• 5. CHƯƠNG 5: CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hoạt Động Kháng Khuẩn và Chống Oxy Hóa

Hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của các chủng vi khuẩn lactic như Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu. Những vi khuẩn này không chỉ có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh mà còn có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ. Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá các hoạt động này, từ đó mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng vi khuẩn lactic trong thực phẩm chức năng và y học.

1.1. Đặc Điểm Của Vi Khuẩn Lacticaseibacillus rhamnosus

Vi khuẩn Lacticaseibacillus rhamnosus là một trong những chủng vi khuẩn lactic phổ biến, được biết đến với khả năng sống sót trong môi trường axit và khả năng kháng lại các tác nhân gây bệnh. Chúng có thể sản xuất axit lactic, giúp bảo quản thực phẩm và cải thiện sức khỏe đường ruột.

1.2. Đặc Điểm Của Vi Khuẩn Streptococcus thermophilus

Streptococcus thermophilus là một vi khuẩn lactic quan trọng trong sản xuất sữa chua và phô mai. Chúng không chỉ giúp lên men mà còn có khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa, góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Hoạt Động Kháng Khuẩn

Mặc dù Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus có nhiều tiềm năng, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc nghiên cứu và ứng dụng. Một trong những vấn đề chính là khả năng kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh, điều này làm giảm hiệu quả của các liệu pháp điều trị hiện tại. Hơn nữa, việc xác định chính xác các cơ chế hoạt động của các chủng vi khuẩn này cũng là một thách thức lớn.

2.1. Kháng Thuốc Của Vi Khuẩn Gây Bệnh

Sự gia tăng kháng thuốc trong các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli và Staphylococcus aureus đã làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tìm kiếm các phương pháp điều trị mới từ vi khuẩn lactic.

2.2. Cơ Chế Hoạt Động Của Vi Khuẩn Lactic

Việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus trong việc kháng khuẩn và chống oxy hóa là rất cần thiết. Nghiên cứu này sẽ giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của chúng trong việc ức chế vi sinh vật gây bệnh.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Động Kháng Khuẩn

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thạch khuếch tán để đánh giá hoạt động kháng khuẩn của các chủng Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus. Các thí nghiệm được thực hiện trên nhiều loại vi khuẩn gây bệnh khác nhau, nhằm xác định khả năng ức chế của các chủng này. Kết quả sẽ cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng ứng dụng của chúng trong y học.

3.1. Phương Pháp Thạch Khuếch Tán

Phương pháp thạch khuếch tán là một kỹ thuật phổ biến để đánh giá hoạt động kháng khuẩn. Bằng cách sử dụng môi trường thạch, các nhà nghiên cứu có thể quan sát sự ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh khi tiếp xúc với các chủng vi khuẩn lactic.

3.2. Các Loại Vi Khuẩn Được Nghiên Cứu

Nghiên cứu này tập trung vào các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, và Candida albicans. Việc đánh giá khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic đối với những vi khuẩn này sẽ giúp xác định tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Động Chống Oxy Hóa

Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus đều có hoạt động chống oxy hóa đáng kể. Các phương pháp như DPPH và hydroxyl radical scavenging đã được sử dụng để đánh giá khả năng này. Kết quả cho thấy rằng dịch chiết từ các chủng vi khuẩn này có khả năng loại bỏ các gốc tự do, góp phần bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do oxy hóa.

4.1. Phương Pháp Đánh Giá Hoạt Động Chống Oxy Hóa

Các phương pháp như DPPH và hydroxyl radical scavenging được sử dụng để đánh giá hoạt động chống oxy hóa. Những phương pháp này cho phép xác định khả năng loại bỏ các gốc tự do của các chủng vi khuẩn lactic.

4.2. Kết Quả Hoạt Động Chống Oxy Hóa

Kết quả cho thấy rằng dịch chiết từ Streptococcus thermophilus có hoạt động chống oxy hóa cao hơn so với Lacticaseibacillus rhamnosus. Điều này cho thấy tiềm năng của các chủng vi khuẩn này trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Vi Khuẩn Lactic

Các chủng vi khuẩn lactic như Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, từ thực phẩm chức năng đến y học. Chúng không chỉ giúp cải thiện sức khỏe đường ruột mà còn có khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa, mở ra nhiều cơ hội mới cho nghiên cứu và phát triển sản phẩm.

5.1. Ứng Dụng Trong Thực Phẩm Chức Năng

Vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm chức năng. Chúng giúp cải thiện sức khỏe đường ruột và tăng cường hệ miễn dịch, mang lại lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng.

5.2. Tiềm Năng Trong Y Học

Nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của các chủng vi khuẩn lactic có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh. Việc phát triển các sản phẩm từ vi khuẩn lactic có thể giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào kháng sinh.

VI. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus đã chỉ ra tiềm năng lớn của các chủng vi khuẩn này trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng và y học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng mới, góp phần cải thiện sức khỏe cộng đồng.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của các chủng vi khuẩn lactic. Việc phát triển các sản phẩm mới từ vi khuẩn này có thể mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

6.2. Ứng Dụng Trong Ngành Công Nghiệp

Các ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm sẽ là một trong những hướng đi quan trọng trong tương lai. Việc khai thác tiềm năng của vi khuẩn lactic có thể giúp phát triển các sản phẩm an toàn và hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Các hợp chất chống oxy hóa tổng hợp như butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA) và n-propyl gallate (PG) được sử dụng phổ biến nhằm ngăn chặn quá trình oxy hóa trong bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất này tiềm ẩn nguy cơ gây tổn thương gan và có khả năng gây ung thư, dẫn đến việc chúng bị hạn chế hoặc cấm sử dụng tại một số quốc gia. Song song với đó, sự gia tăng của các chủng vi sinh vật kháng kháng sinh (đối với tetracycline, cephalosporin, aminoglycoside, macrolide) do lạm dụng thuốc đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các nguồn chất kháng khuẩn và chống oxy hóa tự nhiên, an toàn sinh học.

Nhóm vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) có lịch sử sử dụng an toàn lâu dài trong thực phẩm lên men và được công nhận rộng rãi về các đặc tính probiotic. Trong đó, hai loài Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus là các thành phần vi sinh vật quan trọng có khả năng thích ứng đường tiêu hóa, tăng cường miễn dịch và bảo vệ tế bào trước áp lực oxy hóa. Khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học của tác giả Trương Ngọc Hải Yến (Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh phối hợp thực hiện tại Đại học Khoa học và Công nghệ Quốc gia Bình Đông - NPUST, Đài Loan) tập trung giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ sau:

• Mục tiêu tổng quát: Sàng lọc và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng vi sinh vật (kháng khuẩn và kháng nấm), đồng thời xác định độ nhạy cảm kháng sinh của một số chủng vi khuẩn Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus.
• Nhiệm vụ nghiên cứu:
  1. Nội dung 1: Xác định độ nhạy cảm với 10 loại kháng sinh của các chủng L. rhamnosus và S. thermophilus.
  2. Nội dung 2: Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng L. rhamnosus và S. thermophilus.
  3. Nội dung 3: Sàng lọc và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các chủng nghiên cứu thông qua ba mô hình dọn gốc tự do (DPPH, superoxide anion, hydroxyl radical).
• Đối tượng nghiên cứu: 8 chủng vi khuẩn lactic, gồm 3 chủng Lacticaseibacillus rhamnosus (JHH-2, B9, 38) và 5 chủng Streptococcus thermophilus (Jt1, Jt4, Jt5, Jt9, Jt12). Vi sinh vật kiểm định gồm 7 tác nhân gây bệnh: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella enterica, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Bacillus cereus và nấm men Candida albicans.
• Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ ngày 03/08/2023 đến ngày 31/12/2023 tại Phòng thí nghiệm Bộ gen Chức năng (BT306), Khoa Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Quốc gia Bình Đông (NPUST), Đài Loan.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu dựa trên các cơ sở khoa học về vi khuẩn lactic và các hệ thống phòng vệ chống oxy hóa:

• Vi khuẩn lactic (LAB): Nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, sản sinh acid lactic qua con đường lên men hexose. Phân loại theo Bergey xếp L. rhamnosus vào họ Lactobacillaceae, chi Lacticaseibacillus; S. thermophilus thuộc họ Streptococcaceae, chi Streptococcus.
• Cơ chế chống oxy hóa: Các chủng probiotic LAB có thể dọn dẹp các gốc oxy hóa hoạt tính (Reactive Oxygen Species - ROS như hydroxyl •OH, superoxide anion O2•-, hydroperoxyl HOO•) thông qua hệ thống enzym (Superoxide Dismutase - SOD, Catalase - CAT, Glutathione Peroxidase - GPx) hoặc các hợp chất phi enzym ngoại bào/nội bào.
• Đánh giá an toàn vi sinh: Đánh giá tính kháng kháng sinh theo hướng dẫn của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) dựa trên điểm gãy vi sinh vật (microbiological breakpoints) nhằm phát hiện khả năng kháng nội tại hoặc kháng thu nhận qua chuyển gen ngang.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm	Phương pháp / Kỹ thuật	Điều kiện & Hóa chất chuẩn
Chuẩn bị mẫu phân tích	Ly tâm thu nhận dịch nổi không tế bào (CFS) và huyền phù tế bào nguyên (ICs)	CFS: Ly tâm 8.000 ×g (5 phút), pha loãng 10% (v/v) trong nước khử ion; ICs: Ly tâm 4.000 ×g (10 phút), rửa 3 lần bằng PBS, chuẩn độ mật độ $10^8\text{ CFU/mL}$.
Độ nhạy kháng sinh	Pha loãng liên tiếp trong đĩa 96 giếng xác định MIC và cấy trải xác định MBC	10 loại kháng sinh (nồng độ $0.5 - 256\text{ }\mu\text{g/mL}$). So sánh điểm gãy EFSA; đối chứng âm môi trường M17.
Hoạt tính kháng khuẩn	Khuếch tán giếng thạch (Agar-diffusion method)	Thạch Nutrient agar (vi khuẩn) và Sabouraud agar (nấm men); giếng $100\text{ }\mu\text{L}$ mẫu; đối chứng dương ampicillin, kanamycin, amphotericin B.
Bắt gốc tự do DPPH	Đo quang phổ ở bước sóng $517\text{ nm}$	Phản ứng mẫu với DPPH trong methanol ở $37^\circ\text{C}$ bóng tối (30 phút); đối chứng dương BHT $100\text{ }\mu\text{g/mL}$.
Bắt gốc Superoxide anion	Phương pháp tự oxy hóa pyrogallol ở bước sóng $325\text{ nm}$	Đệm phosphate $\text{pH } 8.2$, pyrogallol $3\text{ mM}$ trong $\text{HCl } 10\text{ mM}$; đối chứng dương Acid Ascorbic $100\text{ }\mu\text{g/mL}$.
Bắt gốc Hydroxyl radical	Phản ứng Fenton ($\text{Fe}^{2+}/\text{H}_2\text{O}_2$) với chất chỉ thị Brilliant Blue	$\text{FeSO}_4\text{ } 0.5\text{ mM}$, Brilliant Blue, $\text{H}_2\text{O}_2\text{ } 3%$, ủ $37^\circ\text{C}$ (20 phút), đo quang ở bước sóng $624\text{ nm}$; đối chứng dương BHT $1.000\text{ }\mu\text{g/mL}$.

• Xử lý số liệu: Thí nghiệm được lặp lại 3 lần ($n=3$). Số liệu biểu diễn dưới dạng Trung bình $\pm$ Độ lệch chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SD}$). Phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) và so sánh bội Tukey (Tukey's test, $p < 0.001$) trên phần mềm Microsoft Excel.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Overview (Tổng quan mở đầu)

Chương 1 thiết lập tính cấp thiết của việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa và kháng khuẩn sinh học nhằm thay thế chất hóa học tổng hợp. Tác giả xác định mục tiêu đánh giá toàn diện 8 chủng LAB (L. rhamnosus và S. thermophilus), đồng thời vạch rõ cấu trúc nghiên cứu bao gồm 3 nội dung chính: đánh giá an toàn kháng sinh, khảo sát khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh và đo lường năng lực khử gốc tự do.

Chương 2: Review (Tổng quan tài liệu)

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến vi khuẩn lactic:

• Lacticaseibacillus rhamnosus: Phân loại, đặc điểm hình thái trực khuẩn Gram dương, lên men dị hình tùy ý, đạt chuẩn GRAS (FDA) và QPS (EFSA). Tác giả phân tích các nghiên cứu điển hình như chủng L. rhamnosus GG và chủng CA15 (DSM 33960) có khả năng sinh acid hữu cơ và bắt giữ gốc tự do.
• Streptococcus thermophilus: Phân loại, hình thái cầu khuẩn tạo chuỗi, lên men đồng hình, có hoạt tính enzyme lactase hỗ trợ dung nạp đường lactose và sinh tổng hợp bacteriocin.
• Gốc tự do ROS và tác nhân gây bệnh: Trình bày cơ chế gây tổn thương cấu trúc DNA, protein, lipid màng của các gốc ROS ($\text{O}_2^{\bullet-}$, $^{\bullet}\text{OH}$) và tổng quan đặc điểm dịch tễ, độc lực của 7 vi sinh vật kiểm định (E. coli, S. aureus, S. enterica, E. faecium, K. pneumoniae, B. cereus, C. albicans).

Chương 3: Materials and Methods (Vật liệu và phương pháp nghiên cứu)

Chương 3 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi sinh vật, môi trường nuôi cấy (M17 broth/agar, Nutrient broth/agar, Sabouraud dextrose), trang thiết bị (máy đọc ELISA BioTek, tủ ấm, máy ly tâm) và hóa chất phân tích. Các quy trình chuẩn bị dịch nổi CFS, tế bào nguyên ICs, thử nghiệm giếng thạch, xác định MIC/MBC trên đĩa 96 giếng và các công thức tính toán tỷ lệ dọn gốc DPPH, Superoxide, Hydroxyl được trình bày cụ thể.

Chương 4: Results and Discussion (Kết quả và thảo luận)

Chương 4 cung cấp số liệu thực nghiệm chi tiết và các phân tích so sánh:

• Thử nghiệm kháng sinh: Xác định giá trị MIC và MBC của 8 chủng đối với 10 loại kháng sinh.
• Thử nghiệm giếng thạch: Ghi nhận sự ức chế đối với 7 vi sinh vật chỉ thị.
• Thử nghiệm chống oxy hóa: So sánh năng lực quét gốc tự do giữa hai phân đoạn CFS và ICs của từng chủng vi khuẩn.

Chương 5: Conclusions and Suggestions (Kết luận và kiến nghị)

Chương này tóm tắt kết quả về tính chất chống oxy hóa chủ yếu ở môi trường ngoại bào của các chủng LAB, nổi bật là chủng S. thermophilus Jt9, đồng thời đề xuất định hướng nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử và tối ưu hóa lên men.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm chính

1. Độ nhạy cảm với kháng sinh (MIC và MBC)

Các chủng vi khuẩn được phân loại nhạy cảm hoặc kháng dựa trên điểm gãy vi sinh vật của EFSA:

Chủng vi khuẩn	Kháng sinh nhạy cảm	Kháng sinh bị kháng (Tỷ lệ)	Đặc điểm kháng sinh không thuộc bảng EFSA
L. rhamnosus (JHH-2, B9, 38)	Ampicillin (2/3), Erythromycin (3/3), Tetracycline (3/3)	Vancomycin ($3/3$), Chloramphenicol ($3/3$), Kanamycin ($2/3$ - JHH-2 nhạy), Ampicillin ($1/3$ - chủng 38 có $\text{MIC} = 16\text{ }\mu\text{g/mL}$)	$\text{MIC}$ với Sulfamethoxazole $> 256\text{ }\mu\text{g/mL}$; $\text{MIC}$ với Ciprofloxacin $4 - 8\text{ }\mu\text{g/mL}$, Cefotaxime $16\text{ }\mu\text{g/mL}$, Rifampicin $0.25\text{ }\mu\text{g/mL}$.
S. thermophilus (Jt1, Jt4, Jt5, Jt9, Jt12)	Ampicillin ($5/5$), Vancomycin ($5/5$), Erythromycin ($5/5$), Chloramphenicol ($1/5$ - chủng Jt9 nhạy cảm)	Kanamycin ($5/5$), Chloramphenicol ($4/5$)	$\text{MIC}$ với Sulfamethoxazole $> 256\text{ }\mu\text{g/mL}$; $\text{MIC}$ với Cefotaxime và Rifampicin là $0.125\text{ }\mu\text{g/mL}$; Ciprofloxacin từ $1 - 8\text{ }\mu\text{g/mL}$.

2. Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh

Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch cho thấy cả dịch nổi không tế bào (CFS) và dịch huyền phù tế bào (Ss) của 8 chủng L. rhamnosus và S. thermophilus đều không tạo vòng vô khuẩn đối với 7 tác nhân gây bệnh (E. coli, S. aureus, S. enterica, E. faecium, K. pneumoniae, B. cereus, C. albicans).

3. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro

Năng lực dọn gốc tự do: Dịch nổi không tế bào (CFS) > Huyền phù tế bào nguyên (ICs)

• Bắt giữ gốc tự do DPPH:
  • Tế bào nguyên (ICs): Dao động trong khoảng $27.\text{x}%$, các chủng nằm chung trong nhóm phân vị $b$ (không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê giữa các chủng).
  • Dịch nổi (CFSs): Dao động từ $57.\text{x}%$ đến $70.\text{x}%$. Chủng L. rhamnosus 38 đạt hoạt tính cao nhất ($70.\text{x}%$), cao gấp $\approx 1.3$ lần so với đối chứng dương BHT $100\text{ }\mu\text{g/mL}$ ($54.441%$). Chủng S. thermophilus Jt9 đạt $64.\text{x}%$.
• Bắt giữ gốc Superoxide anion ($\text{O}_2^{\bullet-}$):
  • Tế bào nguyên (ICs): Dao động từ $7.\text{x}%$ đến $30.\text{x}%$, cao nhất ở chủng S. thermophilus Jt9.
  • Dịch nổi (CFSs): Dao động từ $12.\text{x}%$ đến $60.\text{x}%$. Hai chủng S. thermophilus Jt9 và S. thermophilus Jt12 có hoạt tính cao nhất ($\approx 60.\text{x}%$). Đối chứng Acid Ascorbic $100\text{ }\mu\text{g/mL}$ đạt $84.227%$.
• Bắt giữ gốc Hydroxyl radical ($^{\bullet}\text{OH}$):
  • Tế bào nguyên (ICs): Dao động từ $2.900%$ đến $7.900%$ (thấp hơn đối chứng BHT $1.000\text{ }\mu\text{g/mL}$ đạt $7.900%$). Chủng S. thermophilus Jt9 thể hiện hoạt tính cao nhất ở dạng ICs.
  • Dịch nổi (CFSs): Năng lực bắt gốc đạt từ $13.\text{x}%$ đến $84.\text{x}%$. Nhóm S. thermophilus cho hiệu quả cao hơn rõ rệt so với nhóm L. rhamnosus, trong đó S. thermophilus Jt9 đạt giá trị cao nhất.

Đóng góp của nghiên cứu

Khóa luận đã chứng minh thực nghiệm rằng hoạt tính chống oxy hóa của các chủng L. rhamnosus và S. thermophilus phân bố chủ yếu ở khu vực ngoại bào (dịch nổi nuôi cấy CFS) thay vì tập trung bên trong màng tế bào (ICs). Nghiên cứu đã định danh được chủng S. thermophilus Jt9 sở hữu tiềm năng chống oxy hóa vượt trội trên cả 3 mô hình thử nghiệm, đồng thời cung cấp hồ sơ nhạy cảm kháng sinh cơ bản phục vụ đánh giá mức độ an toàn vi sinh vật.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận

• Phương pháp khuếch tán giếng thạch chưa ghi nhận được hoạt tính kháng khuẩn của các chủng, điều này có thể do nồng độ mẫu chưa đủ nhạy, điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, thành phần dinh dưỡng) chưa kích hoạt sinh tổng hợp bacteriocin hoặc biến đổi trong cấu trúc di truyền của chủng vi khuẩn lưu giữ.
• Nghiên cứu tập trung vào các thử nghiệm in vitro ở nồng độ cố định ($10^8\text{ CFU/mL}$ cho ICs và $10%$ v/v cho CFS), chưa khảo sát động học phụ thuộc liều lượng chi tiết cho từng chất chuyển hóa.

Định hướng nghiên cứu tiếp theo

• Nghiên cứu bổ sung các con đường phòng vệ phi enzym và hệ thống enzym chống oxy hóa khác trên các chủng Streptococcus thermophilus.
• Tiến hành phân tích chuyên sâu dịch nổi CFS của chủng S. thermophilus Jt9 nhằm tách chiết, định danh chính xác các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa và làm sáng tỏ cơ chế sinh học phân tử.
• Tối ưu hóa các điều kiện môi trường và thông số lên men (pH, nhiệt độ, cơ chất) của S. thermophilus để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp chất chống oxy hóa.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh học Ứng dụng và Dược học. Các nội dung có giá trị ứng dụng cao bao gồm:

• Quy trình thực nghiệm chuẩn hóa ba mô hình đánh giá năng lực chống oxy hóa in vitro (DPPH, tự oxy hóa pyrogallol, Fenton cải tiến với Brilliant Blue).
• Quy trình xác định chỉ số MIC/MBC trên đĩa 96 giếng theo khuyến cáo của EFSA đối với các chủng vi sinh vật probiotic.
• Dữ liệu sàng lọc thực nghiệm về đặc tính ngoại bào của dịch lên men vi khuẩn lactic làm tiền đề phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc phụ gia sinh học tự nhiên chống lại stress oxy hóa.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nghiên cứu khảo sát chính xác những chủng vi khuẩn lactic nào?

Khóa luận nghiên cứu tổng cộng 8 chủng vi khuẩn lactic thuộc hai loài: 3 chủng Lacticaseibacillus rhamnosus (JHH-2, B9, 38) và 5 chủng Streptococcus thermophilus (Jt1, Jt4, Jt5, Jt9, Jt12), được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm BT306, Đại học NPUST (Đài Loan).

2. Tại sao dịch nổi không tế bào (CFS) lại có khả năng chống oxy hóa cao hơn huyền phù tế bào nguyên (ICs)?

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hoạt chất chống oxy hóa của các chủng LAB được tiết chủ yếu ra môi trường ngoại bào. Dịch nổi CFS chứa các chất chuyển hóa hòa tan giúp dọn dẹp trực tiếp gốc tự do mà không cần cơ chế vận chuyển gốc tự do qua màng tế bào, từ đó giảm thiểu nguy cơ tổn thương các thành phần nội bào. Ngoài ra, quá trình ly tâm và rửa tế bào ICs có thể làm thất thoát một phần hoạt tính bám trên bề mặt.

3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng như thế nào?

Cả 8 chủng LAB (ở cả hai dạng dịch nổi CFS và dịch huyền phù tế bào) đều không thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng (không tạo vòng vô khuẩn) đối với cả 7 vi sinh vật chỉ thị gồm E. coli, S. aureus, S. enterica, E. faecium, K. pneumoniae, B. cereus và C. albicans.

4. Chủng vi khuẩn nào thể hiện tiềm năng chống oxy hóa tốt nhất trong nghiên cứu?

Chủng Streptococcus thermophilus Jt9 thể hiện tiềm năng vượt trội nhất, đặc biệt là dịch nổi CFS của chủng này đạt hiệu suất cao trong việc dọn dẹp gốc superoxide anion ($\approx 60.\text{x}%$) và đạt tỷ lệ dọn gốc hydroxyl cao nhất trong số các chủng khảo sát, bên cạnh hoạt tính bắt gốc DPPH đạt $64.\text{x}%$.

5. Hồ sơ kháng kháng sinh của các chủng theo tiêu chuẩn EFSA có điểm gì đáng lưu ý?

Hầu hết các chủng L. rhamnosus kháng vancomycin ($3/3$), chloramphenicol ($3/3$) và kanamycin ($2/3$). Các chủng S. thermophilus đều kháng kanamycin ($5/5$) và đa số kháng chloramphenicol ($4/5$), riêng chủng Jt9 nhạy cảm với chloramphenicol. Toàn bộ 8 chủng đều có giá trị MIC đối với sulfamethoxazole vượt mức $256\text{ }\mu\text{g/mL}$.

---

Kết luận

Khóa luận đã hoàn thành việc sàng lọc và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, đối kháng vi sinh vật và độ nhạy kháng sinh của 8 chủng Lacticaseibacillus rhamnosus và Streptococcus thermophilus. Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng năng lực chống oxy hóa của các chủng vi khuẩn lactic này tồn tại chủ yếu ở phân đoạn ngoại bào (dịch nổi CFS), trong đó dịch nổi của chủng Streptococcus thermophilus Jt9 cho thấy khả năng dọn gốc tự do superoxide và hydroxyl nổi bật. Công trình cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm phục vụ việc nghiên cứu phát triển các chế phẩm chống stress oxy hóa có nguồn gốc từ vi khuẩn probiotic.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES EVALUATE THE ANTIMICROBIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF SOME Lacticaseibacillus rhamnosus AND Streptococcus thermophilus STRAINS. Major : BIOTECHNOLOGY Student name : TRUONG NGOC HAI YEN Student ID : 19126242 Academic year : 2019 - 2023 Thu Duc City, 02/2024. MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS EVALUATE THE ANTIMICROBIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF SOME Lacticaseibacillus rhamnosus AND Streptococcus thermophilus STRAINS. Supervisor Student Assoc.

DOUGLAS SHYU TRUONG NGOC HAI YEN Assoc. NGUYEN BAO QUOC Thu Duc City, 02/2024. ACKNOWLEDGMENTS First of all, I would like to express my sincere thanks to my two supervisors Assoc. Dr DOUGLAS SHYU and Assoc.

DrNGUYEN BAO QUOC for their patience and wisdom, and for helping me conduct my thesis in a detailed and analytical way. This accomplishment would not have been possible without their guidance and the opportunity they provided me to undertake this project in BT306 lab and TEEP program. I would like to express my profound gratitude for their invaluable advice and patience throughout this journey. The experience of working with them and the other lab members has been truly enriching.

I would also like to extend my deepest gratitude to my labmates in BT306 (NPUST — Taiwan) and RIBE 304 (NLU - Vietnam). Their unwavering support, insightful thoughts, and inspiring ideas played a crucial role in my research. I consider myself fortunate to have such wonderful friends and colleagues by my side throughout this journey. Finally, I cannot express enough gratitude to my family.

Their unconditional support and encouragement have been my anchor during the challenging times. They believed in me, even when I doubted myself, and for that, I am eternally grateful. I am deeply thankful for everything and it's been a privilege learning under their mentorship. CONEIRMATION AND COMMITMENT My name is Truong Ngoc Hai Yen, student ID: 19126242, class: DH19SHD (Phone number: 0797783156, email: [e-mail]), of Biotechnology, Nong Lam University Ho Chi Minh city.

This is my undergraduate thesis which was conducted by myself. I hereby declare that, all the information in this document has been obtained and presented in accordance with academic rules and ethical conduct. I take full responsibility in front of the committee for these commitments. Thu Duc city, February 28", 2024 Student’s signature Truong Ngoc Hai Yen hị ABSTRACT Lactic acid bacteria (LAB) are one of the most significant groups of probiotic organisms, which are frequently used in a variety of fields including medical treatment, food industry, and livestock production.

These bacteria have attracted scientific attention due to their probiotic, antimicrobial and antioxidant properties since they were first discovered by Louis Pasteur in 1857. In this research, the study was conducted to screen the antimicroorganism and antioxidant activities of 8 strains of LAB including 2 species: L. The antimicrobial tests, using agar-diffusion, were carried out against various pathogens like Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella enterica, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Bacillus cereus, and Candida albicans. Results showed no inhibitory activity against these 7 pathogens.

Regarding antioxidant properties, several methods including DPPH scavenging, superoxide scavenging, and hydroxyl radical scavenging were conducted using cell-free supernatant (CFS) and intact cells (ICs) extract. The results showed that all of the target strains possessed antioxidant activity as determined by those methods with both types of extracts, in with the cell-free supernatant displayed higher activity than the intact cell, and S. thermophilus strains showed higher activities in eliminating superoxide and hydroxyl radical when compared to LZ. In addition, antibiotic susceptibility test was also performed, LZ.

rhamnosus was obsered to be resistant to vancomycin (3/3), chloramphenicol (3/3), kanamycin (2/3), and ampicillin (1/3), whereas, S. thermophilus was resistant to kanamycin (5/5), and chloramphenicol (4/5), all 8 studied strains showed low susceptibility to sulfamethoxazole (MIC higher than 256 pg/mL). The findings of this study suggest that the antioxidant characteristics of the studied strains mainly exist outside the cell and can be effectively harnessed by identifying them in the culture supernatant, in with CFSs of S. thermophilus Jt9 was suggested as promise sources against oxidative stress and warrants further investigation.

Keyword: Lacticaseibacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, lactic-acid bacteria, antimicrobial activities, antioxidant, antibiotic. 1H TÓM TẮT Vi khuẩn lactic (LAB) là một trong những nhóm probiotic quan trọng nhất, thường được sử dụng trong nhiều lĩnh vực bao gồm điều trị y tế, ngành công nghiệp thực pham và chăn nuôi. Những vi khuân này đã thu hút sự chú ý của giới khoa học đo tính chất probiotic, kháng khuẩn và chống oxi hóa của chúng từ khi được Louis Pasteur khám pha ra lần đầu tiên vào năm 1857. Trong nghiên cứu này, việc nghiên cứu được tiên hành dé sàng lọc hoạt động kháng khuẩn, kháng nam và chống oxi hóa của 8 chủng LAB bao gồm2 loài: 7.

Sử dụng phương pháp thạch khuếch tán để thí nghiệm kháng nhiều loại tác nhân như Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella enterica, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Bacillus cereus, va Candida albicans. Kết quả cho thay không có hoạt động ức chế đối với 7 loại tác nhân này. Đối với tính chất chống oxi hóa, một số phương pháp bao gồm bắt giữ DPPH, gốc superoxide và gốc hydroxyl đã được tiễn hành sử dụng mau dịch nồi (CFS) va dịch tế bào nguyên (ICs). Kết quả cho thấy tất cả các chủng mục tiêu đều có hoạt động chống oxi hóa được xác định bởi những phương pháp này với cả hai loại chiết xuất, trong đó dịch nồi hiển thị hoạt động cao hơn tế bào nguyên, và chung S.

thermophilus hién thi hoạt động cao hon trong việc loại bỏ gốc superoxide và gốc hydroxyl so với chủng L. Ngoài ra, thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh cũng được thực hiện, 7. rhamnosus được quan sát có khả năng khang với vancomycin (3/3), chloramphenicol (3/3), kanamycin (2/3), va ampicillin (1/3), trong khi đó, S. thermophilus kháng với kanamycin (5/5), va chloramphenicol (4/5), tat cả 8 chủng được nghiên cứu cho thay độ nhạy thấp với sulfamethoxazole (MIC > 256 pg/mL).

Những phat hiện của nghiên cứu này gợi ý rằng các đặc tính chống oxi hóa của các chủng được nghiên cứu chủ yếu tồn tại bên ngoài tế bào và có thê được khai thác hiệu quả bằng cách xác định chúng trong dịch nồi nuôi cấy, trong đó CFSs của S. thermophilus Jt9 được đề xuất là nguồn tiềm năng chống lại căng thăng oxi hóa và đáng được nghiên cứu thêm. Từ khóa: Lacticaseibacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, vi khuẩn lactic, hoạt động khang khuẩn, chống oxi hóa, khang sinh. IV TABLE OF CONTENTS Page ACKNOWLEDGMUENIS vss ssnsssssssnssasassssnceess ESiS.5GS:3M913238448eSEESaag93S8Sa§SEE4018iC883,3ã8gã23.00-836 i CONFIRMATION AND COMMITMENT .cececceceeccecceceeeceeceeeceeeeeeeeceseeseeesereereeees 1 ABSTRACT sscccatwosasomminasumnemcuc een mans EE 11 (Ener iv IV.

V LIST OF ABBREV LATIONS tesssssscessesonssnnessssnsersaense srenevesnecsssesrovesssopseaspeeeseseneneseeons vill LIST OF TABLES, apssssscsssssssnanassasnuxenssevaxasx ences snssassaaranesazsnasanecennsansans aessasenaweanectoansaneaseaes x LIST OF 0600. 21121221129 HH 1H HH HH re 1 PS Ocul geen rece terete ecrete eect eee tere cre cere sere eer ee ee 1 Bee CỊDĐ]GGV eee ee ee ee ee 2 1,8, CHÍ cence ccscaren sen neneeseninemccnme miner es orem EEE nen 2 CHAPTER. REV IE W sevcssssesosssrensaneswenesuaewaanesnonwseweevevsaniavessvectoupeusavses 3 2. Introduction of lactre acid, baCteia .ÔỎ 3 21D ip PM CaO ssysggisotcSgBISS NIQLDDEIEERRGRIGEESIEOESRNMSGSEEIEDEEEEEGDHEDSSIEESREIGHSEEGITGDHESUSHQĐĐĐSN0 008,86) 2.

Introduction of Lacticaseibacillus rhamnosus .-cS+cS-cSsesseseeeerrrrrrrrrrxre 4 22iLa OVERVIEW Gd TAR ON OTN Y serevecemsaraccsnrenersnemmanuamenuneemmma re EE! 4 2. Studies related to Lacticaseibacillus rhaMMOSUS. Introduction of Streptococcus thermophilus .1 OVELVIEW atid TAXONOMY serene sczsnernrsenaseaen nremecnenamene ua emannnmneeenenes 6 23D CAPAC LE TIS UI OS brestecoses retin emetic ne etme tc 00023200100 eo a 2.3 Studies related to Streptococcus thermophilus strains. Introduction of reactive OXYGEN SD€CI€S.

Introduction of some pathogenic microorganisms. 9 các su ESC METI GHIA C OIE a. ce cs Sa Oc Sa Soe aces Sasa ec Seen Seale eae 10 2 Sida SIPHVLOCOCCUS QUTCUS cecsmexcxssrecscraceratemivemeraintnronscte ca acc 10 2D A HD GHI scacosnssnanonwansassavansinnsstoasnanstnn vom notoanendinns sontetiencisheuisuntnineantisntwaseatsine 11 DicDid iEEFLCPOCOCOUS [AE CTU excess tạng tp oes gOI8Si10ã83033dl-83IS8900988400801046188i-20EMNGQGESRIGERGSINGGIHERGESSSSE 11 2. BACIIUS GBIl€ lút 161013341335813511158113113183XãS533S1553G333S835358S3885553513E51136L43XEXAEEBSBL35584355E 13 CHAPTER 3.

MATERIALS AND METHODS. Time aTBTĐldEESOEESÍUWPcsscessseoitirsiedsdgoBztndtgisEtiski8niuteSiu5guzz00g0n80018i030g308/430'5q00:E.qu25ogg244inSG 14 3. Materials and equipment 8. WE CLO OTS ATISTIG toss ses ss s6 1á hồ HH5 H6 senza nu SS: E514g838930538.

Required tools, equipments and chemicaÌS. MethodS cress eeaun arenes ease neey rent cemmanan anne teaadn deters ence asmaretiniauecuees 15 3. thermophilus stra1ms. Preparation of pathogenic ImICTOOTØATIISINS.

Cell-free supernatants (CFSs) preparatIOI.34, Intact cells: (ICs) DEGIDMESIOH ssssavsosczttasbeioiostsittgidtoglsstGsttoasiitilststBiBE4loiriogigs4e 16 323. Agar Gitius one tho so: csssxssisssssecLsrse15220256051E88863833495%38160630018645u08135gi601E6340123014i083. Antibiotic susceptibility testing method. Determination of the DPPH radical scavenging effect.

Superoxide anion scavenging aCfIVIẨY.-- --- - -c- c- + ss xxx nh ng ngư 19 3. Hydroxyl radical scavenging aC{IVIẨY.3210: SafIsHo:atalysistHiGNO(SiocessssesrenasosibndiiriooodgusientddioinsiibditSoifui9c500gi8080gi0u020g60004:nil 20 CHAPTER 4. RESULTS AND DISCUSSION. Antibiotic susceptibility testing 1077.

24 425i HHGXIOA7iL tGE HD ee 26 4. 1)P PH, scavenging method ns. eanuerumeomnsore onan 26 VI 4. Superoxide anion scavenging abIÏIfY.

Hydroxyl radical scavenging abIÏIEV. CONCLUSIONS AND SUGGESTIONS. CONCLUSIONS sccercunamenenecemmnsesew aces eee 35 5. -EiTSG22IG7100A3100380071/30000258/8545-02i-L302HE4E4208220i06.c cee cececcesceseeseeseesessesececenecsccnesaeesecseesecaeesesaesacssensesscsecseesecsecaesaeeaeeaeeatesenaeseeee vii LIST OF ABBREVIATIONS A : Ampicillin AA : Ascorbic acid ANOVA : Analysis of Variance ATCC : American type culture selection atm : Standard atmosphere BHA : Butylated Hydroxyanisole BHT : Butylated Hydroxyltoluene BP : Breakpoint CAT : Catalase CEF : Cefotaxime CFS : Cell-free supernatant CFU : Colony forming unit CH : Chloramphenicol CIP : Ciprofloxacin DNA : Deoxyribonucleic acid DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl E : Erythromycin EFSA : European Food Safety Authority et al.

: and others GPx : Glutathione peroxidase GR : Glutathione reductase GRAS : Generally recognized as safe HRS : Hydroxyl radical scavenging vill ICs : Intact cells K : Kanamycin LA : Lactic Acid LAB : Lactid acid bacteria MBC : Minimal Bactericidal Concentration MIC : Minimal Inhibitory Concentration MRS : De Man, Rogosa, and Sharpe medium NA : Nutrient Agar NPUST : National Pingtung University of Science and Technology OD : Optical density PBS : Phosphate buffer saline PG : n-propyl gallate QPS : Qualified presumption of safety RI : Rifampicin ROS : Reactive oxygen species SOD : Superoxide dismutase SU : Sulfamethoxazole TE : Tetracycline UV : Ultraviolet V : Vancomycin 1X LIST OF TABLES Page Table 3. Microbialogical breakpoints categorising bacteria as resistant. Minimum inhibitory concentration (MIC) values. Minimum bactericidal concentration (MBC) values.----- --+- 22 LIST OF FIGURES Page Figure 2.

Antimicrobial subtances of LAB.- - c5 St Sx St ssrsrksrrsrrrrrrrree 3 Figure 2. Proposed modes of action of probiotic LAB antioxidants. Colony morphology and cell morphology of L. Colony morphology of S.

thermophilus Jt1, Jt4, Jt5, Jt9. 96-wells plate with MIC experiment of S. thermophilus Jt\ after 24 hours incubated. st Si ee ie creel en es ee eto 22 Figure 4.

Inhibition growth of pathogens by L.cccceeceeeeeeeeee teens 25 Figure 4. Inhibition growth of pathogens by supernatant of S. Inhibition growth of pathogens by suspension of S. DPPH free radical scavenging activity (0).

96-wells plate with DPPH scavenging by ICs of L. Superoxide anion scavenging activity (9). 96-wells plate with superoxide anion scavenging by CEFSs. Hydroxyl scavenging activity (%) .eceeceeceeeeeeeeeeeeeteeeeeeteteeetettteteene dL Figure 4.

96-wells plate with hydroxyl scavenging by CFSs of S. icc ti i i ee i lsat edb gone. che 31 XI CHAPTER 1. Overview Synthetic antioxidants such as butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxy-anisole (BHA), and n-propyl gallate (PG) exhibit strong antioxidant against various oxidation systems; however, their use in food also have adverse effects such as liver damage and carcinogenic effects, which led to be restricted or prohibited in certain countries (Osuntoki, 2010).

Besides that, after the discovered revolution in the “golden era”, the main problems of chemotherapy were possessed when some exciting compounds (such as tetracyclines, cephalosporins, aminoglycosides, and macrolides) are in danger of losing their efficacy because of the increase in microbial resistance (Mayers, 2009) which led to the overuse of antimicrobial products and the growing emergence of various resistant pathogens.