MỞ ĐẦU Từ lâu trong dân gian ngƣời dân đã có thói quen sử dụng mƣớp đắng (MĐ)(Momordica charantia) và giảo cổ lam (GCL) (Gynostemma pentaphyllum) với mục đích hỗ trợ điều trị các bệnh về men gan cao, tiểu đƣờng, mỡ máu và phòng chống ung thƣ của MĐ [29],… Các thực vật này đƣợc sử dụng dƣới hình thức nhƣ phơi khô, đun nƣớc uống, hoặc có thể dùng làm thức ăn. Mặc dù có tác dụng dƣợc lý nhƣ vậy nhƣng thực tế cho thấy khi sử dụng hai loại thảo dƣợc này cũng có thể gây ra các tác dụng phụ không mong muốn nhƣ đau đầu, chóng mặt, buồn nôn, đau bụng tiêu chảy, sốt cao, hôn mê,… Những tác dụng phụ này là do các thảo đƣợc sử dụng với liều lƣợng không định lƣợng và quan trọng nhất là độc tính của chúng chƣa đƣợc biết đến nhiều. Gan là cơ quan đóng vai trò quan trọng trong việc tích tụ các chất độc cũng nhƣ chuyển hóa các thuốc do nó có chứa các protein tham gia vào quá trình chuyển hóa và đào thải các chất. Trong đó, protein Constitutive Androstane Receptor (CAR) là một thụ thể nhân tế bào, có khả năng cảm ứng hàng loạt các gen mã hóa cho enzyme cytochrome P450 (CYPs) tham gia chuyển hóa các chất nội sinh và ngoại sinh trong quá trình thải độc của cơ thể.
Do đó, CAR và các enzyme CYPs đóng vai trò quan trọng nhƣ là hàng rào phòng thủ của cơ thể chống lại các chất nội sinh và ngoại sinh. Khi bị kích thích bởi các chất ngoại lai (thuốc và các chất ô nhiễm), mức độ biểu hiện của các gen này có thể bị thay đổi và dẫn tới sự thay đổi các quá trình sinh lý trong cơ thể. Vì vậy, việc đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ và GCL sẽ cung cấp các thông tin về độc tính và dƣợc lý của chúng để ứng dụng vào phục vụ cuộc sống của con ngƣời. Do đó, đề tài: “Đánh giá một số đặc tính độc tố sinh thái của dịch chiết giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) và mƣớp đắng (Momordica charantia) trên dòng tế bào HepG2 và HEK293” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: - Đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ và GCL trên dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 và tế bào thận phôi ngƣời HEK293.
- Đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết MĐ và GCL lên mức độ biểu hiện và hoạt tính của thụ thể CAR. Hoàng Thị Trang: Sinh thái học - K25 Trang 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về loài mƣớp đắng 1. Đặc điểm sinh học Vị trí phân loại của cây MĐ [1, 4] Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ: Bầu bí (Cucurbitales) Họ: Bầu bí (Cucurbitaceae) Chi: Mƣớp đắng (Momordica) Loài: Momordica charantia Mô tả thực vật [1, 4] MĐ là loại cây dây leo bằng tua cuốn, đơn, mảnh, thân có cạnh, ở ngọn có mọc lông tơ.
Lá của MĐ mọc kiểu so le, chia thành từ 5-7 thùy, hình trứng, mép lá khía răng cƣa đều, mặt dƣới có màu nhạt hơn so với mặt trên, gốc hình tim, đầu thùy nhọn hoặc hơi tù, trên gân lá có lông ngắn. Hoa đực và hoa cái mọc riêng ở kẽ lá, có cuống dài, màu vàng nhạt. Hoa đực có đài và ống rất ngắn, tràng hoa gồm 5 cánh mỏng hình bầu dục, nhụy 5 rời nhau. Hoa cái có đài và tràng hoa giống hoa đực.
Quả có hình thoi và đầu thuôn nhọn. Mặt vỏ quả có nhiều u lồi với kích thƣớc to nhỏ không đều. Quả khi chƣa chín có màu xanh, khi chín chuyển sang màu vàng hồng. Khi chín quả nứt ra dần từ đầu, tách ra làm 3 phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên trong [6, 7].
Hạt dẹt, có màng đỏ bao quanh. Mùa hoa từ tháng 2 đến tháng 4 và mùa quả vào khoảng từ tháng 5 đến tháng 6 [1, 4]. Thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lý của mƣớp đắng Cũng nhƣ các loài thực vật khác, MĐ cũng chứa các nhóm chất gồm carbohydrate, protein, chất béo, vitamin và khoáng chất [14]. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học của quả MĐ đã đƣợc phát hiện, phân lập và chứng minh có tác Hoàng Thị Trang: Sinh thái học - K25 Trang 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ dụng dƣợc lý trong các nghiên cứu gần đây.
Các nghiên cứu này cho thấy, MĐ chứa những hợp chất có tính dƣợc lý cao nhƣ tripterpen, flavonoid, alkaloid và sterol,. Đã có nhiều nghiên cứu công bố về thành phần hóa học chính của cây MĐ là những triterpen thuộc các nhóm cucurbitan, olean và ursan tồn tại cả dƣới dạng aglyco và glucoside. Triterpen là chất mang tính dƣợc lý cao bởi rất nhiều công dụng chữa bệnh, nó đã đƣợc sử dụng nhƣ là một trong những căn cứ chính để đánh giá chất lƣợng của các dƣợc liệu đƣợc chiết xuất từ thực vật chẳng hạn nhƣ nấm lim xanh. Các thành phần này đƣợc tìm thấy trong các bộ phận của cây nhƣng nhiều nhất là trong thân, lá và quả của MĐ.
Các triterpen thuộc nhóm cucurbitan và nhóm ursan từ quả, lá MĐ đã đƣợc các nghiên cứu ở Nhật công bố gồm: momordicin, momordicinin và momordicilin. Các triterpen thuộc nhóm olean đƣợc tìm thấy trong hạt MĐ. Một số glycoside cũng đã đƣợc phân lập từ thân và quả cây MĐ, nó đƣợc phân nhóm theo chi của các loại triterpenoid cucurbitan [58]. Đặc biệt triterpenoid có hoạt tính nhƣ kinaza protein kích hoạt AMP làm tăng quá trình đƣờng phân, đây cũng chính là cơ chế hạ đƣờng huyết của MĐ, góp phần làm hạn chế bệnh tiểu đƣờng [58].
Một số lƣợng lớn cucurbitan glycoside trong MĐ cũng đã đƣợc xác định cấu trúc gồm: momordicosid A, B, C, D, E,… Trong đó có hai chất đƣợc xác định mang lại vị đắng là momordicosid K và L. Các momordicin (charantin) I, II, III,. là các saponin thuộc nhóm olean và đặc biệt nhóm hợp chất này cũng đã đƣợc công bố có hoạt tính kháng đái tháo đƣờng [1]. Charantin cũng là một loại triterpenoid dạng cucurbitan điển hình trong MĐ và là một chất có tiềm năng với đặc tính chống đái tháo đƣờng.
Nó là một hỗn hợp của hai hợp chất, cụ thể là sitosteryl glucoside và stigmasteryl glucoside. Chen và cộng sự đã phân lập đƣợc 14 cucurbitane triterpenoid, kuguacin, bao gồm hai pentanorcucurbitacin, một octanorcucurbitacin, và hai trinorcucurbitacins, cùng với sáu chất tƣơng tự đã biết từ thân và lá của MĐ, các hợp chất này đã thể hiện hoạt động chống HIV trong ống nghiệm. Hoàng Thị Trang: Sinh thái học - K25 Trang 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ Các protein, peptide và axit amin cũng là thành phần chính có trong quả và hạt MĐ. Nhiều loại protein và peptide đã đƣợc phân lập từ các phần khác nhau của MĐ nhƣ protein RIP.
Protein này làm bất hoạt riboxome ngăn chặn sự tổng hợp protein do đó có thể làm chết tế bào. Ngoài ra, các hợp chất: Momordica charantia lectin, α-momorcharin, β-momorcharin, γ-momorcharin, δ-momorcharin, trong MĐ đã thể hiện hoạt tính chống hình thành khối u cả trong nghiên cứu in vitro và in vivo. Do đó, chúng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất thuốc chống ung thƣ, ức chế miễn dịch và kháng vi sinh vật [28]. Protein chống HIV của Momordica 30 kD (MAP30) là một chuỗi RIP, đƣợc đặt tên cho khối lƣợng phân tử của nó là 30kD, nó đã đƣợc tìm thấy có tiềm năng chống khối u mạnh tƣơng tự nhƣ Momordica charantia lectin [29].
Protein này cũng ức chế đáng kể sự gia tăng khối u và gây apoptosis đối với các tế bào ung thƣ nhƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ vú, ung thƣ phổi, ung thƣ gan, và u nguyên bào thần kinh đệm [29]. Ngoài ra trong quả MĐ có rất nhiều loại axit amin có hoạt tính sinh học cao nhƣ axit aspartic, threonin, serin, acid glutamic, prolin, alanin, glycin, valin, cystein, phenylalanin, histidin, lysin, arginin,… Các sắc tố lycopen, vitamin, chất khoáng nhƣ Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, P, N,… các alcol, aldehyd, acid béo,… cũng có mặt trong MĐ [1]. Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới công bố và chứng minh về tác dụng dƣợc lý của các sản phẩm từ cây MĐ trong hỗ trợ điều trị các bệnh nhƣ đái tháo đƣờng, kháng khuẩn, kháng viêm, hạn chế ung thƣ. Cây MĐ và các dịch chiết của nó đƣợc cho là có tác dụng hạ đƣờng huyết thông qua các cơ chế sinh lý, dƣợc lý và sinh hóa khác nhau.
Dịch MĐ giúp hạ đƣờng huyết bằng các con đƣờng nhƣ kích thích việc sử dụng glucose ở các cơ bắp, ức chế sự hấp thu glucose đƣờng ruột, hoạt hóa enzim kinase để tăng quá trình đƣờng phân, bảo tồn các tế bào bê-ta ở tuyến tụy và duy trì chức năng của chúng,. Có tới trên 140 nghiên cứu khác nhau trên thế giới đã điều tra tác dụng hạ đƣờng huyết và chống tăng đƣờng huyết của dịch chiết từ cây MĐ ở trên cả mô Hoàng Thị Trang: Sinh thái học - K25 Trang 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Luận văn thạc sỹ hình ngƣời và động vật [70]. Min-Jia Tan và cộng sự đã chiết tách momordicosid Q, R, S, và T từ MĐ, sau đó nghiên cứu tác dụng điều trị đái tháo đƣờng và béo phì của các chất này. Kết quả cho thấy các momordicosid làm tăng quá trình oxy hoá acid béo và glucose trên cả chuột còn nhạy cảm insulin và chuột đề kháng insulin, bƣớc cần thiết cho cảm ứng hấp thụ glucose vào tế bào.
Điều này có liên quan với các hoạt động tăng AMP-activated protein kinase (AMPK), một con đƣờng trung gian hấp thu glucose và quá trình oxy hoá acid béo [58]. Cao methanol 50% quả MĐ cho tác dụng hạ đƣờng huyết 25% (liều dùng 30mg/kg), cao butanol cho kết quả là 34% với liều dùng nhƣ vậy. Các tác giả này cho rằng các hợp chất phân cực tan nhiều trong butanol có khả năng làm giảm đƣờng huyết tốt hơn. Cơ chế hoạt động tƣơng tự nhƣ insulin hoặc thông qua việc điều tiết insulin từ tuyến tụy [1].
Bên cạnh đó, các nghiên cứu in vitro cũng cho thấy dịch chiết từ MĐ, điển hình là protein MAP30 đƣợc phân lập từ những hạt của MĐ có hoạt động kháng sinh phổ rộng. Dịch chiết cây MĐ ức chế sự phát triển của nhiều vi khuẩn gram âm và gram dƣơng E. coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Pseudomonas, Streptobacillus, Streptococcus, Helicobacter pylori, ký sinh trùng E. histolytica và Plasmodium falciparum, ức chế sự nhiễm và tăng trƣởng của một số virus, bao gồm cả HIV, Herpes simplex [13],… Dịch chiết MĐ có tác dụng ức chế vi khuẩn H.
pylori, gây ra bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng. MĐ đã đƣợc chứng minh là có tác dụng chống loét dạ dày trên chuột do rƣợu gây ra sau khi dùng indomethacin [22].