Luận văn thạc sĩ đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu việt nam thuộc chỉ đảng sâm codonopsis sp bằng kỹ thuật and mã vạch

Luận văn thạc sĩ y tế nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu việt nam thuộc chỉ đảng sâm codonopsis sp bằng, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Nga
• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Đoàn Long
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Đánh Giá Đa Dạng Di Truyền Một Số Loài Cây Dược Liệu Việt Nam Thuộc Chi Đảng Sâm (Codonopsis sp.) Bằng Kỹ Thuật ADN Mã Vạch
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Chi Codonopsis
• 1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố
• 1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ truyền
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đánh giá đa dạng di truyền cây dược liệu Việt Nam

Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đặc biệt là các loài cây dược liệu. Đánh giá đa dạng di truyền của các loài cây dược liệu không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen mà còn hỗ trợ trong việc phát triển và ứng dụng trong y học cổ truyền. Việc nghiên cứu này cần thiết để xác định các loài cây thuốc, tránh nhầm lẫn và bảo tồn di truyền cho các thế hệ sau.

1.1. Đặc điểm và phân bố của cây dược liệu Việt Nam

Việt Nam có khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao, trong đó có nhiều loài được sử dụng làm thuốc. Các loài cây dược liệu chủ yếu phân bố ở các vùng rừng, với gần 90% là cây mọc tự nhiên. Việc xác định chính xác các loài cây thuốc là rất quan trọng để bảo tồn và phát triển.

1.2. Vai trò của cây dược liệu trong y học cổ truyền

Cây dược liệu đóng vai trò quan trọng trong y học cổ truyền Việt Nam. Chúng không chỉ được sử dụng để điều trị bệnh mà còn có giá trị kinh tế cao. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền giúp nâng cao chất lượng và hiệu quả sử dụng các loại dược liệu này.

II. Thách thức trong việc đánh giá đa dạng di truyền cây dược liệu

Mặc dù có nhiều lợi ích từ việc đánh giá đa dạng di truyền, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức. Việc phân loại và nhận diện các loài cây dược liệu gặp khó khăn do sự tương đồng về hình thái giữa các loài. Hơn nữa, việc khai thác quá mức và mất môi trường sống cũng đe dọa đến sự tồn tại của nhiều loài.

2.1. Khó khăn trong việc phân loại cây dược liệu

Nhiều loài cây dược liệu có hình thái tương tự nhau, dẫn đến nhầm lẫn trong việc nhận diện. Phương pháp phân loại truyền thống không đủ chính xác để phân biệt các loài, đặc biệt là trong trường hợp các loài có đặc điểm hình thái gần giống nhau.

2.2. Nguy cơ từ việc khai thác quá mức

Việc khai thác quá mức các loài cây dược liệu tự nhiên đã dẫn đến sự suy giảm số lượng và đa dạng di truyền. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến nguồn cung dược liệu mà còn đe dọa đến sự tồn tại của nhiều loài quý hiếm.

III. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền cây dược liệu

Để đánh giá đa dạng di truyền, các nhà nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó có kỹ thuật ADN mã vạch. Phương pháp này cho phép xác định chính xác các loài cây dược liệu thông qua phân tích trình tự ADN, giúp nâng cao độ chính xác trong việc nhận diện.

3.1. Kỹ thuật ADN mã vạch trong nghiên cứu

Kỹ thuật ADN mã vạch là một công cụ mạnh mẽ trong việc xác định các loài thực vật. Phương pháp này sử dụng các đoạn ADN ngắn đặc trưng để phân biệt các loài, giúp nhận diện chính xác ngay cả khi mẫu vật đã qua xử lý.

3.2. Ứng dụng của phương pháp PCR trong nghiên cứu di truyền

Phương pháp PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) được sử dụng để khuếch đại các đoạn ADN cần thiết cho việc phân tích. Kỹ thuật này giúp tăng cường khả năng phát hiện và phân tích các loài cây dược liệu, từ đó hỗ trợ trong việc bảo tồn và phát triển nguồn gen.

IV. Kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền cây dược liệu

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có nhiều loài cây dược liệu tại Việt Nam có tính đa dạng di truyền cao. Việc phân tích trình tự ADN cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các loài, từ đó giúp xác định các mã vạch ADN đặc trưng cho từng loài.

4.1. Phân tích sự đa hình trình tự ADN

Kết quả phân tích cho thấy sự đa hình trong trình tự ADN giữa các loài cây dược liệu. Điều này không chỉ giúp nhận diện chính xác mà còn cung cấp thông tin quý giá cho việc bảo tồn và phát triển các loài cây thuốc.

4.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Dựa trên các dữ liệu ADN, các nhà nghiên cứu đã xây dựng cây phát sinh chủng loại cho các loài cây dược liệu. Cây phát sinh này giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài và hỗ trợ trong việc bảo tồn nguồn gen.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Đánh giá đa dạng di truyền cây dược liệu Việt Nam là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thực vật. Tương lai, việc áp dụng các công nghệ mới trong nghiên cứu sẽ mở ra nhiều cơ hội cho việc bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu quý hiếm.

5.1. Tầm quan trọng của việc bảo tồn di truyền

Bảo tồn di truyền không chỉ giúp duy trì nguồn gen mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu chất lượng cao. Việc này cần sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu, chính phủ và cộng đồng.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu cây dược liệu

Nghiên cứu về cây dược liệu sẽ tiếp tục phát triển với sự hỗ trợ của công nghệ sinh học. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong việc bảo tồn và phát triển các loài cây thuốc quý.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, sở hữu nguồn tài nguyên thực vật phong phú với khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, trong đó có gần 3.948 loài thực vật và nấm lớn được ghi nhận có công dụng làm thuốc. Theo báo cáo của ngành y tế, mỗi năm Việt Nam tiêu thụ từ 30 đến 50 tấn dược liệu để phục vụ y học cổ truyền và công nghiệp dược phẩm, trong đó hơn 2/3 nguồn dược liệu được khai thác từ tự nhiên. Chi Codonopsis, hay còn gọi là Đảng Sâm, là một trong những chi cây dược liệu quý hiếm, có giá trị y học cao và được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam và các nước châu Á. Tuy nhiên, việc xác định chính xác các loài Codonopsis gặp nhiều khó khăn do đặc điểm hình thái tương tự và sự xuất hiện của các loài giả mạo có thể gây nguy hiểm cho người sử dụng.

Mục tiêu nghiên cứu là đánh giá đa dạng di truyền của một số loài Codonopsis tại Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN, nhằm xác định các mã vạch ADN có khả năng phân biệt các loài trong chi này. Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau trên cả nước, tập trung vào các vùng miền núi phía Bắc và Tây Nguyên, trong khoảng thời gian gần đây. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm mà còn hỗ trợ kiểm định chất lượng dược liệu, giảm thiểu rủi ro do nhầm lẫn hoặc giả mạo trong thương mại dược liệu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên lý thuyết phân loại học phân tử và ứng dụng kỹ thuật mã vạch ADN (DNA barcode) để nhận diện loài. Mã vạch ADN là đoạn trình tự ADN ngắn đặc trưng, có khả năng phân biệt các loài dựa trên sự khác biệt trình tự nucleotide. Hai vùng gen được lựa chọn làm mã vạch trong nghiên cứu này là ITS (Internal Transcribed Spacer) thuộc hệ gen nhân và matK thuộc hệ gen lục lạp. Vùng ITS có độ biến đổi cao, phù hợp để phân biệt loài, trong khi matK là gen mã hóa protein có tốc độ tiến hóa nhanh, được sử dụng rộng rãi trong nhận dạng thực vật.

Các khái niệm chính bao gồm: đa dạng di truyền, mã vạch ADN, phân tích phát sinh chủng loại, PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp), và các chỉ số đánh giá chất lượng ADN như tỉ số A260/280.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 12 mẫu thực vật Codonopsis thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau như Lào Cai, Kon Tum, Lâm Đồng, Sơn La. Mẫu được bảo quản trong túi chứa silica gel và xử lý tại phòng thí nghiệm.

Phương pháp tách chiết ADN tổng số sử dụng quy trình mini-CTAB và bộ kit DNeasy® Plant Mini Kit của Qiagen để đảm bảo độ tinh sạch và nồng độ ADN phù hợp cho phản ứng PCR. Hai vùng gen ITS và matK được nhân bản bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu, sau đó sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự tại phòng thí nghiệm chuyên nghiệp.

Phân tích số liệu sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự, ClustalW để căn chỉnh, và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Maximum Parsimony (MP) và Bayesian với phần mềm PAUP và MrBayes. Nhóm ngoài (outgroup) gồm hai loài Cyananthus lobatus và Campanula peregrina được chọn để định hướng cây phát sinh.

Thời gian nghiên cứu kéo dài trong khoảng một năm, từ thu thập mẫu đến phân tích dữ liệu và hoàn thiện luận văn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tách chiết ADN thành công và chất lượng cao: 12 mẫu Codonopsis được tách chiết ADN tổng số với tỉ số A260/280 dao động từ 1,5 đến 2,0, nồng độ ADN đạt từ 80 đến 229 µg/µl, đảm bảo chất lượng cho phản ứng PCR.

2. Khuyếch đại gen ITS và matK hiệu quả: 11/12 mẫu được nhân bản thành công vùng gen ITS (~900 bp), 10/12 mẫu thành công với gen matK (~900 bp). Sản phẩm PCR có băng rõ nét, không có băng phụ, phù hợp cho giải trình tự.

3. Đa hình trình tự ADN vùng ITS cao: Vùng ITS dài khoảng 638-650 bp, có 113 điểm sai khác giữa các loài, chiếm 17,4% toàn bộ trình tự. Sai khác nội loài rất thấp (0-0,2%), trong khi sai khác giữa các loài đạt đến 15,4%, cho thấy ITS có khả năng phân biệt loài cao.

4. Xác định loài chính xác: Mẫu C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 có trình tự ITS tương đồng 100% với Codonopsis javanica; mẫu C4 tương đồng với Codonopsis tangshen. Kết quả này khẳng định hiệu quả của mã vạch ITS trong nhận dạng loài Codonopsis.

Thảo luận kết quả

Sự thành công trong tách chiết và nhân bản ADN cho thấy phương pháp mini-CTAB kết hợp với kit thương mại là phù hợp với mẫu thực vật Codonopsis có chứa nhiều hợp chất thứ sinh. Đa hình cao ở vùng ITS phù hợp với các nghiên cứu trước đây, cho thấy vùng này là mã vạch ADN tiềm năng để phân biệt các loài thực vật có quan hệ gần gũi.

Việc xác định chính xác các loài Codonopsis giúp giảm thiểu rủi ro nhầm lẫn với các loài độc hại hoặc giả mạo, góp phần nâng cao chất lượng và an toàn dược liệu. So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả tương đồng với hiệu quả phân biệt cao của ITS và matK trong nhận dạng thực vật dược liệu.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tần suất sai khác nucleotide giữa các loài và bảng so sánh tỉ lệ nhận diện của từng vùng gen, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của từng mã vạch ADN.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Xây dựng thư viện mã vạch ADN cho các loài Codonopsis tại Việt Nam: Tạo cơ sở dữ liệu chuẩn để hỗ trợ nhận dạng và kiểm định dược liệu, nâng cao độ chính xác trong thương mại và bảo tồn nguồn gen. Thời gian thực hiện: 1-2 năm; chủ thể: Viện Dược liệu, các trường đại học.

2. Áp dụng kỹ thuật mã vạch ADN trong kiểm soát chất lượng dược liệu: Đưa phương pháp này vào quy trình kiểm nghiệm dược liệu tại các cơ sở sản xuất và xuất khẩu, nhằm phát hiện sớm các nguyên liệu giả mạo hoặc kém chất lượng. Thời gian: 6-12 tháng; chủ thể: Bộ Y tế, doanh nghiệp dược liệu.

3. Đào tạo chuyên gia và cán bộ kỹ thuật về kỹ thuật mã vạch ADN: Tổ chức các khóa đào tạo nâng cao năng lực phân tích ADN cho cán bộ kiểm nghiệm và nghiên cứu, đảm bảo ứng dụng hiệu quả công nghệ mới. Thời gian: liên tục; chủ thể: các trường đại học, viện nghiên cứu.

4. Nghiên cứu mở rộng đa dạng di truyền và ứng dụng mã vạch ADN cho các loài dược liệu khác: Mở rộng phạm vi nghiên cứu sang các chi, họ dược liệu quý hiếm khác nhằm bảo tồn và phát triển bền vững nguồn tài nguyên. Thời gian: 2-3 năm; chủ thể: các viện nghiên cứu, trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử: Nắm bắt phương pháp và ứng dụng mã vạch ADN trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phân loại học thực vật.

2. Cán bộ kiểm nghiệm dược liệu và quản lý chất lượng: Áp dụng kỹ thuật phân tích ADN để nâng cao độ chính xác trong nhận dạng và kiểm soát chất lượng nguyên liệu dược liệu.

3. Doanh nghiệp sản xuất và xuất khẩu dược liệu: Sử dụng kết quả nghiên cứu để đảm bảo nguồn nguyên liệu sạch, tránh rủi ro do giả mạo, nâng cao uy tín sản phẩm trên thị trường quốc tế.

4. Cơ quan bảo tồn và quản lý tài nguyên thiên nhiên: Hỗ trợ công tác bảo tồn nguồn gen quý hiếm, xây dựng chiến lược bảo vệ các loài dược liệu nguy cấp trong Sách Đỏ Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Mã vạch ADN là gì và tại sao lại quan trọng trong nhận dạng dược liệu?
   Mã vạch ADN là đoạn trình tự ADN ngắn đặc trưng giúp phân biệt các loài sinh vật. Nó quan trọng vì giúp nhận dạng chính xác các loài dược liệu, tránh nhầm lẫn và giả mạo, đảm bảo an toàn và chất lượng sản phẩm.

2. Tại sao chọn vùng gen ITS và matK làm mã vạch trong nghiên cứu này?
   Vùng ITS có độ biến đổi cao, dễ nhân bản và phân biệt loài tốt. Vùng matK có tốc độ tiến hóa nhanh, phù hợp nhận dạng thực vật. Kết hợp hai vùng giúp tăng độ chính xác trong phân loại.

3. Phương pháp tách chiết ADN nào được sử dụng và ưu điểm của nó?
   Sử dụng quy trình mini-CTAB và kit DNeasy® Plant Mini Kit. Phương pháp này giúp thu được ADN tinh sạch, nồng độ cao, phù hợp cho PCR và giải trình tự, tiết kiệm thời gian và tăng hiệu quả.

4. Làm thế nào để xây dựng cây phát sinh chủng loại từ dữ liệu ADN?
   Dữ liệu trình tự ADN được căn chỉnh và phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng như PAUP và MrBayes, sử dụng các phương pháp Maximum Parsimony và Bayesian để tái tạo mối quan hệ tiến hóa giữa các loài.

5. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu này trong ngành dược liệu là gì?
   Nghiên cứu giúp xác định chính xác các loài Codonopsis, hỗ trợ kiểm định chất lượng dược liệu, giảm thiểu rủi ro do giả mạo, góp phần bảo tồn nguồn gen và nâng cao giá trị thương mại của dược liệu Việt Nam.

Kết luận

• Đã tách chiết và nhân bản thành công ADN tổng số của 12 mẫu Codonopsis với chất lượng cao, đảm bảo cho phân tích mã vạch ADN.
• Vùng gen ITS và matK được xác định là mã vạch ADN hiệu quả để phân biệt các loài Codonopsis tại Việt Nam.
• Phân tích trình tự ADN cho thấy sự đa hình cao giữa các loài, giúp nhận dạng chính xác và hỗ trợ bảo tồn nguồn gen quý hiếm.
• Nghiên cứu góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN phục vụ kiểm định dược liệu và phát triển ngành dược liệu bền vững.
• Đề xuất áp dụng kỹ thuật mã vạch ADN trong kiểm soát chất lượng dược liệu và đào tạo chuyên gia nhằm nâng cao năng lực ứng dụng công nghệ sinh học phân tử.

Tiếp theo, cần triển khai xây dựng thư viện mã vạch ADN cho các loài dược liệu quý, đồng thời mở rộng nghiên cứu sang các nhóm thực vật khác để bảo vệ và phát triển nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam. Đề nghị các cơ quan quản lý, viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp thực hiện các giải pháp ứng dụng công nghệ mã vạch ADN trong thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo. Trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc. Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc.

Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây thuốc trồng. Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới hơn 20.

Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể. Những số liệu này cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh tế - xã hội. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự nhau.

Trên thế giới, thực vật cũng được sử dụng làm thuốc ngay từ thời tiền sử [8], [47], và được ghi nhận sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, phổ biến nhất là các loài gần gũi với con người [58]. Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược [73]. Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô 1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử dụng. Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện không hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng các thuốc thảo mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị.

Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát tiêu bản hiển vi) của mẫu vật. Công việc này thường được thực hiện bởi một chuyên gia về hình thái dược liệu. Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế. Vì vậy, các phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác các loài cây thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của chúng đã được phát triển vào cuối những năm 1990 [62].

Công việc này nối tiếp các thành tựu về ứng dụng các kỹ thuật phân tích DNA trong nghiên cứu hệ thống học thực vật được bắt đầu khoảng mười năm trước đó [20] kể từ sự phát minh phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR [13]. Phương pháp PCR và sau này là sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự ADN tự động đã tạo bước ngoặt có tính cách mạng trong các nghiên cứu về ADN. Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản lâu dài [29], [66]. Theo nguyên lý đó, các phương pháp định danh dựa trên ADN cũng đã được phát triển cho việc nhận dạng các loài cây thuốc.

ADN nhân và lạp thể được khuyếch đại (nhân bội) bằng PCR và các sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di gel, được giải trình tự hoặc được lai với các đầu dò (DNA probe) đặc hiệu loài. “Dấu vân tay” (fingerprinting) của hệ gen có thể giúp phân biệt từng cá thể trong loài, giữa các loài hoặc thậm chí giữa các quần thể trong cùng loài; điều này rất hữu ích cho việc đồng nhất hóa (tiêu chuẩn hóa) dược liệu và khả năng phát hiện các giả mẫu (tạp mẫu hay mẫu dễ nhầm lần về hình thái/hóa học) [73]. Dẫu trình tự 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] đơn gen nhân hay gen lạp thể đã được coi là hữu ích cho sự định loài, thì các nghiên tiến hóa hoặc phân loại các loài vẫn thường yêu cầu phân tích các dữ liệu về ADN từ nhiều hơn một gen hoặc một số locut của bộ gen. Việc phát hiện ra các mã vạch ADN ở các loài cây thuốc sẽ có giá trị bổ sung cho các nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và kiểm định dược liệu nói riêng, và đóng góp vào nỗ lực xác định mã vạch cho tất cả các loài sinh vật trên trái đất nói chung.

Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK. 3 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Chi Codonopsis Chi Codonopsis có tên thường gọi ở Việt Nam là Đảng Sâm. Đây là chi thực vật hai lá mầm, thuộc họ Hoa chuông, với cấu tạo hoa đặc trưng dạng hình chuông. Chi này gồm khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng Trung và Đông Á. Codonopsis được coi là Nhân sâm của người nghèo vì theo y học cổ truyền, nó có nhiều công dụng giống Nhân sâm nhưng lại sẵn và rẻ tiền hơn, thường được dùng thay thế Nhân sâm [75].

Phân loại học Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:  Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)  Giới: Plantae (Thực vật)  Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)  Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)  Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm)  Phân lớp: Asteriades  Bộ: Asterales (Bộ Cúc)  Họ: Campanulaceae (Họ Hoa chuông; Cát kiến)  Phân họ: Campanuloideae  Chi: Codonopsis 1. Sơ lƣợc đặc điểm hình thái và phân bố Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có nhiều vết sẹo lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn [1]. Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông.

Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, mép nguyên, màu 4 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] xanh hơi pha vàng, mặt trên có lông nhung, mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có lông rải rác, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hình thái loài Codonopsis pilosula Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài tràng hình chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc sắp rụng trở thành màu vàng nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nhụy hơi dẹt, bao phấn đính gốc. Quả bổ đôi, hình chùy tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng, có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra. Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng.

Trên thế giới, chi Codonopsis có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu từ Hymalaya đến Nhật bản, trong đó có ít nhất 39 loài đã được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc đại lục [75], Châu Á có khoảng 11 loài, Việt Nam có 2 loài đã được mô tả và dùng làm thuốc với tên gọi chung trong dân gian là Đảng sâm.Một số loài Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm có: - Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy; cây này chưa được mô tả trong tập Flore générale de l‟Indochine, đây là cây thảo lâu năm, thân mọc bò hay leo. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm. Lá mọc đối có khi mọc cách hay hơi vòng. Hoa (Hình 1) mọc đơn độc ở nách lá.

Đài 5, Tràng hình chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5. Bầu 5 ô, quả nang, phía trên có một núm nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ. Ra hoa vào tháng 7 tháng 8, có quả vào tháng 5 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] 9 tháng 10. Cây mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi đông bắc và tây bắc (như Lạng sơn, Cao bằng và khu Tây Bắc); người ta thu hái về bán với tên gọi là Phòng đảng sâm.

- Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.) còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô (Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân leo. Rễ hình trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít khi mọc so le hình tim, nhẵn hoặc có ít lông, đầu lá nhọn, mép lá nguyên hoặc có khía răng nhỏ, bấm vào lá có nhựa mủ. Phiến lá dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hoa (Hình 2) mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông màu trắng Hình 2.

Hoa của loài C. javanica hoặc hơi vàng, họng có vân tím. Đài 5, tràng 5 cánh, nhị 5. Quả nang, màu tím, chứa nhiều hạt hình trái xoan, màu vàng bóng.