CHƯƠNG 1. Đặt van đề Theo Tổ chức Y tế thế giới - WHO (2023) tỉ lệ vô sinh — hiếm muộn trung bình ở người trưởng thành trên toàn thế giới là 17,5%. Đây là một con số đáng báo động trên toàn thé giới, trong khi các biện pháp can thiệp — hỗ trợ sinh sản còn ít phổ biến và chưa thé tiếp cận được nhiều người do chi phí thực hiện cao. Vì thế, cho đến hiện tại, việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp dành cho hỗ trợ sinh sản vẫn đang được quan tâm, trong đó có kỹ thuật sản xuất phôi in vitro.
Mô hình nghiên cứu sản xuất phôi heo in vitro (p — IVP) đang được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu về: (i) nuôi cấy thành thục nhân tế bào, thực hiện các biện pháp thụ tinh trong ống nghiệm, kích hoạt phôi đơn tính; (11) tạo động vật chuyền gen phục vụ mục đích y tế, hỗ trợ, bảo tồn các loài động vật quý hiểm có nguy cơ tuyệt chủng và (iii) làm mô hình trong các công tác nghiên cứu về hỗ trợ sinh sản, làm công cụ trong việc huấn luyện kỹ năng cho sinh viên hay kỹ thuật viên chuyên về lĩnh vực phôi nhờ tính sẵn có và dễ thu nhận buồng trứng tại lò mồ với chi phí thấp nhất có thé so với mô hình chuột và thỏ. Yếu tổ tăng trưởng nội mô mach máu (VEGF) là yếu tố điều hòa chính của sự hình thành mạch sinh lý trong quá trình tạo phôi, phát triển xương và chức năng sinh sản (Ferrara va ctv, 2003). Việc bổ sung VEGF vào môi trường nuôi cấy hỗ trợ cho quá trình hình thành phôi được xem là một hướng đi rất hữu ích cho sự nghiên cứu và phát triển về kỹ thuật trên phôi heo (Biswas và ctv, 2010; Biswas và Hyun, 2011; Kere và ctv, 2014; Nguyễn Thị Ngọc Hân và Nguyễn Ngọc Tắn, 2020; Nguyễn Thanh Ngân và Nguyễn Ngọc Tắn, 2022), phôi bò (Luo va ctv, 2002; Luo và ctv 2006; Anchordoquy và ctv, 2015), cừu (Cao va ctv, 2009) và chuột (Shimizu và ctv, 2007). Cùng với đó, việc đánh giá được mức độ biéu hiện gen có anh hưởng đến chất lượng phôi (Oct-4 và Cdx2) sẽ phần nào giúp nhận biết sâu hơn về sự vai trò của VEGF đến sự phát triển và chất lượng phôi giai đoạn sớm.
Mục tiêu của đề tài Đánh giá ảnh hưởng và xác định nồng độ tối ưu của VEGF đến ty lệ hình thành phôi nang từ nguồn tế bao thu từ nang noãn trung bình; đánh giá sự biểu hiện gen liên quan đến chat lượng phôi: Oct-4 và Cdx2 ở phôi nang trong điều kiện có và/hoặc không có bổ sung VEGF trong quá trình nuôi phôi in vitro. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Ảnh hưởng của nồng độ VEGF khác nhau trong môi trường nuôi cấy phôi đến sự phát triển phôi nang. Nội dung 2: Ảnh hưởng của VEGF đến sự biểu hiện gen liên quan đến chất lượng phôi (Oct-4 và Cdx2). TONG QUAN TÀI LIEU 2.
Cau tao cơ quan sinh sản của heo cái Bộ phận sinh sản của heo cái gôm hai buông trứng nắm trong xoang chậu, đường sinh dục bao gồm ống dẫn trứng và vòi trứng, tử cung, cô tử cung, âm đạo và âm môn (Hình 2.1), bộ phận này có hai chức năng chính: 1. Sản xuât trứng, tê bào sinh dục cái. Sản xuât hormone progesterone va estrogen. Uterine corpus Uterine horns Cranial Vagina External urethral os \ \ Vestibule h À Clitoris Hình 2.
Cấu tạo cơ quan sinh sản của heo cái. Mỗi buồng trứng được bao quanh bởi một màng mỏng gọi là phễu, hoạt động như một cái phễu đề thu nhận tế bào trứng khi rụng trứng và chuyền chúng đến ống dẫn trứng. Ong dẫn trứng dài khoảng 15 — 26 cm và đóng vai trò là nơi thụ tinh (Oxford Sandy and Black Pig Foundation Charity). Các nang nguyên thủy là loại nang đầu tiên được hình thành trong buồng trứng trên heo cái, nang trứng nguyên thủy xuất hiện vào lúc phôi thai được 56 đến 70 ngày, với kích thước nang trứng khoảng 34 ym (Silva và ctv, 2011).
Khi các tế bào hạt tăng sinh và tế bào trứng phát triển lớn hơn, chúng bắt đầu tiết ra một loạt glycoprotein được tập hợp thành một lớp vỏ gọi là zona pellucida, bao quanh tế bào trứng và tách nó ra khỏi các tế bào hạt (Jiang và ctv, 2023). Phôi heo ở khoảng thời gian từ 75 — 90 ngày tuổi, nang nguyên thủy được kích hoạt và các tế bào hat det phát triển thành các tế bào hình thoi bao quanh tế bao trứng (Ford và ctv, 2020). Các nang ở giai đoạn này được gọi là nang sơ cấp có đường kính khoảng 40 um (Westergaard và ctv, 2007). Sau đó, các tế bào hạt đơn lớp của một số tế bào nang sinh sôi nảy nở thành nhiều lớp và các nang này bắt đầu có hệ thống mạch máu riêng và hình thành các nang thứ cấp xung quanh tế bào trứng (Jiang va ctv, 2023).
Trong các giai đoạn tiếp theo của quá trình hình thành nang trứng, các khoang nhỏ chứa đầy chất lỏng được hình thành bên trong nang trứng, cuối cùng hợp nhất với nhau dé tạo thành một khoang đơn lớn hơn (được gọi là hang vi), từ đó tạo thành nang trứng (Rimon-Dahari và ctv, 2016). Sau khi đã hình thành nang trứng, các nang này sẽ tiếp tục phát triển và ở các kích thước khác nhau như nang nhỏ (đường kính <3 mm), nang trung bình (đường kính từ 3—7 mm) và nang lớn (đường kính >7 mm) (Hình 2. Antral - : WA sisal G nàn @ : olliculogenesis Rs 7 - LH surge — meiosis resumption = CO MI — MII transition Meiosis II complete at fertilization Hình 2. Cấu trúc của buồng trứng.
Bộ phận sinh dục của heo cái có hai sừng tử cung, môi con có chiêu dài tử cung 60 — 90 cm ở heo nai không mang thai. Chúng hoạt động như một lối đi dé tinh trùng có thé đi đến ống dẫn trứng và đây cũng là nơi phát triển của thai heo. Cô tử cung là điểm nối cơ giữa âm đạo và tử cung, đây là nơi lắng đọng tỉnh dịch trong quá trình giao phối tự nhiên và nhân tạo. Tử cung giãn ra khi heo trong thời gian động dục nhưng co lại trong khoảng còn lại của chu kỳ động dục và trong thời kỳ mang thai.
Âm đạo kéo dài từ cô tử cung đến âm hộ và đóng vai trò là đường dẫn nước tiểu và heo con khi sinh (Theo Oxford Sandy and Black Pig Foundation Charity). Phức hợp tế bao trứng Các tế bào cumulus kết nối với tế bào trứng có các hình chiếu tế bào chất xuyên qua lớp màng zona trong suốt, tạo thành phức hợp tế bao trứng — cumulus. Các kết nối thông qua các khe hở cho phép vận chuyên các phân tử nhỏ giữa tế bao trứng và tế bào cumulus, chang hạn như các ion, chất chuyển hóa và axit amin cần thiết cho sự phát triển của tế bào trứng, cũng như các phân tử điều hòa nhỏ kiểm soát sự phát triển của tế bào trứng. Sự giao tiếp hai chiều giữa tế bào trứng và tế bào cumulus rất quan trọng cho sự phát triển và chức năng của cả hai loại tế bào (Hình 2.
Theca interna and externa Membrana granulosa cells Antrum (follicular fluid) Corona radiata (granulosa cells) Zona pellucida Cumulus oophorous Hình 2. Phức hợp tế bào trứng — cumulus. Phôi nang Phôi nang (blastocyst) được đặc trưng bởi sự hình thành một khoang chứa đầy chất lỏng (blastocoel) nằm ở vị trí trung tâm của phôi, được bao quanh bởi một lớp tế bào được gọi là trophectoderm (TE) sẽ hình thành hầu hết các mô ngoài phôi như nhau thai (Gardner và Harvey, 2015). Ngoài ra, cũng có thé nhìn thấy một khối u nhỏ của các tế bào được gọi là nguyên bào phôi hoặc khối tế bào bên trong (Inner Cell Mass - ICM, từ đó các mô của thai hình thành và phát triển).
Khoảng 7 ngày sau khi thụ tinh, mang trong suốt (zona pellucida) bao quanh phôi nang bị phá vỡ, cho phép nó làm tổ ở tử cung, đây chính là thời điểm đánh dấu sự kết thúc của giai đoạn mầm trong quá trình tạo phôi (Hình 2. Cau tạo phôi nang. Các phương pháp kích hoạt phôi Dé có thé thụ tinh thành công, cần phải kích hoạt tế bào trứng, gồm một chuỗi truyền tín hiệu tạo ra sự chuyên đổi tế bào trứng thành phôi lưỡng bội. Trong quá trình kích hoạt tế bào trứng, nồng độ canxi nội bào dao động liên tục gây ra hiện tượng xuất bào của các hạt vỏ não, các enzyme chứa trong hạt này được giải phóng vào khoang quanh hoàng thé, dẫn đến sự biến đổi của màng zona (ZP), ngăn can sự xâm nhập của tinh trùng vào phía trong ZP.
Sự giải phóng canxi nội bao (Ca?) lưu trữ trong mạng lưới nội chat (ER) được xem là một yếu tố cần thiết dé bat đầu cho việc kích hoạt tế bào trứng (Anifandis va ctv, 2016). Kich hoat bang tinh tring Theo nghiên cứu của Anifandis va ctv (2016), tinh trùng có sự xuất hiện của phospholipase C (PLC@), khi PLCC khuếch tán vào tế bào chất sẽ làm cho canxi nội bao dao động theo các chu kỳ khác nhau dẫn đến sự giải phóng Ca? vào noãn bào sau quá trình hợp nhất giao tử. Cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng tinh trùng dé thụ tinh cho tế bào trứng đã thành thục về nhân trên mô hình tế bao trứng heo (Biswas và ctv, 2011; Sakurai và ctv, 2013; Biswas và ctv, 2018; Linh và Hiep, 2020) hay trên mô hình tế bào trứng bò (Luo va ctv, 2002; Luo va ctv 2006; Anchordoquy và ctv, 2015). Kích hoạt phôi đơn tính Kích hoạt tế bào trứng bằng tinh trùng là một quy trình phức tạp, cả về các bước và thời gian thực hiện, vì vậy, các phương pháp thay thế khác như phương pháp bằng xung điện hay bằng hóa học được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu trên thế giới (Hosseini và ctv, 2008).
Kích hoạt bằng xung điện: xung điện với thời gian nano giây ở một điện trường vừa phải đã được nhận thấy rằng có ảnh hưởng đến nồng độ Ca?' trong tế bào. Việc kích thích bằng xung điện khiến cho lượng canxi nội bào tăng đột ngột nhờ sự giải phóng Ca?" được lưu trữ trong mạng lưới nội chất (ER) (Buescher và ctv, 2004) vào tế bào chất và tạo ra sự dao động Ca?* nội bào, từ đó hỗ trợ cho sự phát triển phôi đơn tính (Koo và ctv, 2008; Liu và ctv, 2015). Kich hoat bang calcium ionophore: khi kich hoat bang calcium ionophore sé tao ra su tác động đến tế bao trứng nhờ lượng Ca?