Nghiên cứu tạo cơ chất peptide đặc hiệu cho protease HIV-1 tại Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu tạo cơ chất peptide đặc hiệu cho protease của hiv 1, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho thực tiễn.

• Tác giả: Trần Thi Thụy Huyền
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Loan
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Cơ Chất Peptide Cho Protease HIV-1: Nghiên Cứu Mới
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1
• 1.1.1. HIV-1 nguyên nhân của bệnh AIDS
• 1.1.2. Cấu trúc và chức năng của protease HIV-1
• 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA PROTEASE HIV-1
• 1.2.1. Phương pháp quang phổ kế
• 1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo
• 1.2.3. Phương pháp miễn dịch ELISA
• 1.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ của protease không đánh dấu theo thời gian (real time label free) bằng phân tích nanopore
• 1.3. ĐẶC TÍNH CƠ CHẤT PEPTIDE CỦA PROTEASE HIV-1
• 1.3.1. Trình tự amino acid trong cơ chất của protease HIV-1
• 1.3.2. Các nghiên cứu về cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1
• 1.4. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ HIV/AIDS
• 1.4.1. Các chất ức chế protease HIV-1
• 1.4.2. Ứng dụng chất ức chế protease HIV-1 trong điều trị HIV/AIDS
• 1.5. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ
• 1.5.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.2.1. Xác định hoạt độ của protease HIV-1 sử dụng cơ chất peptide cải biến trên máy quang phổ khả kiến
• 1.5.2.2. Xác định hoạt độ của protease HIV-1 bằng cơ chất huỳnh quang trên máy quang phổ kế huỳnh quang
• 1.5.2.3. Xác định các hằng số động học của protease HIV-1
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THIẾT KẾ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA CƠ CHẤT PEPTIDE CHO XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1
• 3.1.1. Trình tự amino acid của cơ chất protease HIV-1
• 3.1.2. Xác định một số đặc tính của cơ chất Peptide CH
• 3.1.3. So sánh ái lực của protease với Peptide CH và một số cơ chất khác
• 3.2. THỬ NGHIỆM DÙNG CƠ CHẤT PEPTIDE THIẾT KẾ TRONG PHẢN ỨNG SÀNG LỌC CHẤT ỨC CHẾ CỦA PROTEASE HIV-1
• 3.2.1. Sàng lọc chất ức chế tiềm năng của protease HIV-1
• 3.2.2. Khả năng ức chế protease HIV-1 của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost-4(28),7,24-trien-3,26-dioic
• 3.2.3. Xác định kiểu ức chế protease HIV-1 của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanosta-4(28),7,24-triene-3,26-dioic
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về cơ chất peptide cho protease HIV 1

Cơ chất peptide cho protease HIV-1 đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị HIV/AIDS. Protease HIV-1 là một enzyme thiết yếu trong chu trình tái bản của virus, có khả năng phân cắt các polyprotein thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết. Nghiên cứu về cơ chất peptide giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của protease và phát triển các chất ức chế hiệu quả.

1.1. Cơ chế hoạt động của protease HIV 1

Protease HIV-1 là một enzyme aspartyl, có chức năng phân cắt các polyprotein gag và gag-pol. Việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của enzyme này là cần thiết để phát triển các chất ức chế hiệu quả. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng protease HIV-1 có tính đặc hiệu cao trong việc nhận biết và phân cắt các cơ chất, điều này tạo ra thách thức trong việc phát triển các liệu pháp điều trị.

1.2. Tầm quan trọng của cơ chất peptide trong nghiên cứu HIV 1

Cơ chất peptide được thiết kế đặc hiệu cho protease HIV-1 giúp xác định hoạt độ của enzyme và phát triển các chất ức chế mới. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc tối ưu hóa trình tự amino acid trong cơ chất có thể cải thiện ái lực với enzyme, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

II. Thách thức trong nghiên cứu cơ chất peptide cho protease HIV 1

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu cơ chất peptide cho protease HIV-1, vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Kháng thuốc và tác dụng phụ của các liệu pháp hiện tại là vấn đề lớn. Việc phát triển các cơ chất mới với ái lực cao và tính đặc hiệu tốt hơn là cần thiết để cải thiện hiệu quả điều trị.

2.1. Vấn đề kháng thuốc trong điều trị HIV

Kháng thuốc là một trong những thách thức lớn nhất trong điều trị HIV. Protease HIV-1 có khả năng phát sinh đột biến, dẫn đến sự kháng thuốc của các chất ức chế hiện tại. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải liên tục phát triển các cơ chất mới có khả năng vượt qua sự kháng thuốc.

2.2. Tác dụng phụ của liệu pháp điều trị HIV

Các liệu pháp điều trị HIV hiện tại thường đi kèm với nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Việc phát triển các cơ chất peptide mới có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ này, đồng thời nâng cao hiệu quả điều trị. Nghiên cứu cần tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc của cơ chất để cải thiện tính an toàn và hiệu quả.

III. Phương pháp nghiên cứu cơ chất peptide cho protease HIV 1

Nghiên cứu cơ chất peptide cho protease HIV-1 sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định hoạt độ của enzyme. Các phương pháp này bao gồm quang phổ kế, sắc ký lỏng cao áp và phương pháp miễn dịch ELISA. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng.

3.1. Phương pháp quang phổ kế trong nghiên cứu

Phương pháp quang phổ kế là một trong những phương pháp phổ biến nhất để xác định hoạt độ của protease HIV-1. Phương pháp này sử dụng cơ chất peptide có gắn nhãn huỳnh quang, cho phép theo dõi quá trình phân cắt của enzyme một cách chính xác và nhanh chóng.

3.2. Sắc ký lỏng cao áp trong phân tích hoạt độ enzyme

Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là một phương pháp hiệu quả để phân tách và xác định các sản phẩm phân cắt của protease HIV-1. Phương pháp này cho phép phân tích nhanh chóng và chính xác các thành phần trong hỗn hợp phản ứng, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về hoạt độ của enzyme.

IV. Ứng dụng thực tiễn của cơ chất peptide trong điều trị HIV

Cơ chất peptide cho protease HIV-1 không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn trong điều trị HIV/AIDS. Việc phát triển các chất ức chế protease mới từ cơ chất peptide có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh. Các nghiên cứu hiện tại đang tập trung vào việc tối ưu hóa các cơ chất này để nâng cao hiệu quả điều trị.

4.1. Phát triển thuốc ức chế protease HIV 1

Các chất ức chế protease HIV-1 được phát triển từ cơ chất peptide có thể giúp cải thiện hiệu quả điều trị HIV. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa cấu trúc của cơ chất có thể dẫn đến sự phát triển của các thuốc mới với tính đặc hiệu cao hơn và ít tác dụng phụ hơn.

4.2. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các cơ chất peptide mới có thể cải thiện hoạt độ của protease HIV-1 và giảm thiểu kháng thuốc. Các ứng dụng lâm sàng của những phát hiện này có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị HIV/AIDS, mang lại hy vọng cho bệnh nhân.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu cơ chất peptide cho protease HIV 1

Nghiên cứu cơ chất peptide cho protease HIV-1 đang mở ra nhiều triển vọng mới trong điều trị HIV/AIDS. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng việc phát triển các cơ chất mới có thể giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại những tiến bộ đáng kể trong cuộc chiến chống lại HIV.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các cơ chất peptide mới với ái lực cao và tính đặc hiệu tốt hơn. Việc áp dụng công nghệ mới trong thiết kế cơ chất có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị HIV/AIDS.

5.2. Tầm quan trọng của hợp tác nghiên cứu

Hợp tác giữa các nhà nghiên cứu, tổ chức y tế và ngành công nghiệp dược phẩm là rất quan trọng để phát triển các liệu pháp điều trị HIV hiệu quả. Sự kết hợp này có thể giúp đẩy nhanh quá trình nghiên cứu và phát triển các sản phẩm mới.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Virus HIV-1 là tác nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), với hơn 90% các ca nhiễm HIV thuộc nhóm M đa dạng về phân nhóm và biến thể. Protease HIV-1 đóng vai trò thiết yếu trong quá trình trưởng thành của virus bằng cách phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết. Do đó, protease HIV-1 là mục tiêu quan trọng trong liệu pháp ức chế protease (PI) chống HIV-1. Tuy nhiên, hiện nay, việc điều trị HIV/AIDS vẫn gặp nhiều thách thức do tình trạng kháng thuốc và tác dụng phụ của các thuốc PI.

Nghiên cứu này tập trung thiết kế và đánh giá cơ chất peptide đặc hiệu cho protease HIV-1 nhằm xác định hoạt độ enzyme và sàng lọc các chất ức chế tiềm năng. Cơ chất peptide được thiết kế dựa trên trình tự cắt đặc hiệu tại vị trí RT-IN trên polyprotein gag-pol, với các biến đổi amino acid nhằm tăng ái lực và khả năng phát hiện hoạt tính enzyme. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong năm 2016, sử dụng enzyme protease HIV-1 tái tổ hợp và các phương pháp quang phổ khả kiến, quang phổ huỳnh quang để đánh giá hoạt độ enzyme.

Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển các công cụ phân tích hoạt tính protease HIV-1 hiệu quả, đồng thời hỗ trợ sàng lọc các hợp chất ức chế protease có nguồn gốc thực vật, mở ra hướng đi mới trong phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và chức năng protease HIV-1: Protease HIV-1 là enzyme aspartyl homodimer gồm 2 monomer 99 amino acid, có trung tâm hoạt động chứa bộ ba Asp25-Thr26-Gly27, chịu trách nhiệm phân cắt các polyprotein gag và gag-pol thành các protein cấu trúc và enzyme cần thiết cho virus trưởng thành.

• Đặc tính cơ chất peptide của protease HIV-1: Cơ chất peptide đặc hiệu gồm chuỗi 7 amino acid (P4-P3-P2-P1*P1'-P2'-P3') với vị trí cắt giữa P1 và P1'. Các amino acid tại các vị trí này ảnh hưởng đến ái lực và hiệu quả phân cắt của enzyme. Ví dụ, P1 thường là amino acid kỵ nước như Phe hoặc Tyr, P1' thường là Leu hoặc Val.

• Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: Sử dụng các cơ chất peptide cải biến có khả năng hấp thu ánh sáng hoặc phát huỳnh quang để đo hoạt độ protease HIV-1 qua sự thay đổi tín hiệu quang học theo thời gian. Các phương pháp phổ biến gồm quang phổ khả kiến, quang phổ huỳnh quang dựa trên nguyên lý FRET, sắc ký lỏng cao áp (HPLC), và phân tích nanopore.

• Động học enzyme: Các hằng số Michaelis-Menten (Km, Vmax) và hệ số xúc tác (Kcat) được sử dụng để đánh giá ái lực và hiệu quả xúc tác của enzyme với các cơ chất khác nhau.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Enzyme protease HIV-1 tái tổ hợp được cung cấp từ đề tài mã số ĐT-PTNTĐ; cơ chất peptide cải biến được tổng hợp bởi các hãng uy tín; 20 hợp chất thực vật thứ sinh tinh sạch được cung cấp bởi Viện Dược liệu Trung ương.

• Phương pháp phân tích: Hoạt độ protease HIV-1 được xác định bằng hai phương pháp chính:

  1. Quang phổ khả kiến: Sử dụng cơ chất peptide cải biến có liên kết hấp thu cực đại tại bước sóng 300 nm. Hoạt độ enzyme được đo qua sự giảm hấp thu ánh sáng theo thời gian trên máy quang phổ DU800.

  2. Quang phổ huỳnh quang: Sử dụng cơ chất peptide gắn cặp chất phát và thu huỳnh quang (HiLyte Fluor 488/QXL 520) theo nguyên lý FRET, đo tín hiệu huỳnh quang tăng dần khi enzyme thủy phân cơ chất.

• Xác định hằng số động học: Đo vận tốc phản ứng ở các nồng độ cơ chất khác nhau, tính toán Km, Vmax, Kcat và Kcat/Km theo phương trình Michaelis-Menten và Lineweaver-Burk.

• Sàng lọc chất ức chế: Đánh giá khả năng ức chế hoạt động protease HIV-1 của 20 hợp chất thực vật ở nồng độ 1-5 µM bằng phương pháp huỳnh quang.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2016, bao gồm tổng hợp cơ chất, thiết lập phương pháp đo hoạt độ enzyme, xác định hằng số động học, và sàng lọc chất ức chế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế cơ chất peptide đặc hiệu Peptide CH: Cơ chất được thiết kế dựa trên trình tự cắt RT-IN của polyprotein gag-pol với trình tự Ac-Arg-Lys-Ile-Nle*Nph-Leu-Asp-Gly-Nle-NH2, trong đó Nle và Nph là các amino acid biến đổi nhằm tăng ái lực và khả năng hấp thu ánh sáng. Cơ chất có độ tinh sạch trên 95%.

2. Xác định điều kiện phản ứng tối ưu: Nồng độ enzyme protease HIV-1 thích hợp là khoảng 134 nM trong thể tích phản ứng 300 µl. Nồng độ cơ chất Peptide CH tối ưu là 50-60 µM để đảm bảo phản ứng tuyến tính. Đệm phản ứng tối ưu là Na-acetate 100 mM, pH 4,7, có bổ sung CaCl2 5 mM, EDTA 4 mM, β-ME 5 mM, NaCl 0,9 M.

3. Hằng số động học của protease với các cơ chất:

   • Với Peptide CH: Km = 82,1 µM, Kcat = 0,41 s⁻¹, Kcat/Km = 5052 M⁻¹s⁻¹.
   • So sánh với cơ chất thương mại L6525: Km = 26 µM, Kcat = 0,72 s⁻¹, Kcat/Km = 27708 M⁻¹s⁻¹.
   • Với cơ chất huỳnh quang Peptide HF: Km = 3,13 µM, Kcat = 0,034 s⁻¹, Kcat/Km = 10821 M⁻¹s⁻¹.

   Kết quả cho thấy Peptide CH có ái lực và hiệu quả xúc tác thấp hơn so với các cơ chất khác, tuy nhiên vẫn phù hợp để sử dụng trong các phòng thí nghiệm không có thiết bị huỳnh quang.

4. Sàng lọc 20 hợp chất thực vật: Acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost-4(28),7,24-trien-3,26-dioic thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất, với IC50 khoảng 0,05 µM, ức chế hoàn toàn hoạt độ protease HIV-1 ở nồng độ 1 µM. Các hợp chất khác như acid maslinic và acid ursolic có IC50 lần lượt là 3 µM và 3,7 µM, thể hiện hoạt tính ức chế yếu hơn.

5. Kiểu ức chế của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost-4(28),7,24-trien-3,26-dioic: Là chất ức chế hỗn hợp, làm giảm cả Km và Vmax của enzyme, không phụ thuộc vào thời điểm bổ sung chất ức chế trước hay sau khi thêm cơ chất.

Thảo luận kết quả

Việc thiết kế cơ chất peptide Peptide CH dựa trên trình tự cắt RT-IN của polyprotein gag-pol đã tạo ra một cơ chất có ái lực tương đối với protease HIV-1, phù hợp cho các phòng thí nghiệm có trang thiết bị quang phổ khả kiến. So với các cơ chất huỳnh quang, Peptide CH có độ nhạy thấp hơn nhưng chi phí và yêu cầu thiết bị thấp hơn, thuận tiện cho nghiên cứu trong nước.

Điều kiện phản ứng tối ưu với pH 4,7 và đệm chứa CaCl2 giúp duy trì cấu trúc và hoạt tính enzyme, phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Hằng số động học cho thấy sự khác biệt về ái lực và hiệu quả xúc tác giữa các cơ chất, phản ánh ảnh hưởng của trình tự amino acid và các biến đổi hóa học trên cơ chất.

Kết quả sàng lọc các hợp chất thực vật cho thấy acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost-4(28),7,24-trien-3,26-dioic là chất ức chế protease HIV-1 mạnh, vượt trội so với các triterpen khác như acid maslinic và acid ursolic. Kiểu ức chế hỗn hợp của hợp chất này cho thấy khả năng tương tác phức tạp với enzyme, mở ra hướng nghiên cứu phát triển thuốc ức chế protease HIV-1 mới có nguồn gốc tự nhiên.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ thể hiện sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất, đồ thị Lineweaver-Burk để xác định hằng số động học, và biểu đồ hoạt tính ức chế của các hợp chất thực vật theo nồng độ.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Cải tiến cơ chất peptide: Tiếp tục tối ưu trình tự amino acid và các biến đổi hóa học trên cơ chất Peptide CH nhằm tăng ái lực và độ nhạy, hướng tới phát triển cơ chất huỳnh quang có hiệu quả cao hơn, phục vụ cho các phòng thí nghiệm hiện đại.

2. Mở rộng sàng lọc chất ức chế tự nhiên: Tăng cường nghiên cứu và sàng lọc các hợp chất thực vật, đặc biệt các triterpen có cấu trúc tương tự acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost-4(28),7,24-trien-3,26-dioic, nhằm phát hiện các chất ức chế protease HIV-1 tiềm năng với độc tính thấp.

3. Phát triển phương pháp phân tích đa dạng: Áp dụng kết hợp các kỹ thuật quang phổ khả kiến, huỳnh quang và sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) để đánh giá hoạt tính enzyme và chất ức chế, nâng cao độ chính xác và hiệu quả nghiên cứu.

4. Hợp tác nghiên cứu liên ngành: Khuyến khích hợp tác giữa các nhóm nghiên cứu sinh học phân tử, hóa học dược liệu và y học lâm sàng để phát triển các thuốc ức chế protease HIV-1 mới, đồng thời đánh giá hiệu quả và an toàn trong các mô hình in vivo và thử nghiệm lâm sàng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và enzyme: Có thể ứng dụng phương pháp thiết kế cơ chất peptide đặc hiệu và kỹ thuật đo hoạt độ enzyme để nghiên cứu các enzyme khác có tính đặc hiệu cao.

2. Chuyên gia dược liệu và hóa học tự nhiên: Tận dụng kết quả sàng lọc các hợp chất thực vật để phát triển các dẫn chất thuốc mới chống HIV-1, đặc biệt các triterpen có hoạt tính ức chế protease.

3. Bác sĩ và chuyên gia điều trị HIV/AIDS: Hiểu rõ cơ chế hoạt động của protease HIV-1 và các chất ức chế để lựa chọn liệu pháp điều trị phù hợp, đồng thời cập nhật các nghiên cứu mới về thuốc điều trị.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học thực nghiệm, dược học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu enzyme, thiết kế cơ chất và phân tích động học enzyme, cũng như ứng dụng trong phát triển thuốc.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao protease HIV-1 là mục tiêu quan trọng trong điều trị HIV/AIDS?
   Protease HIV-1 chịu trách nhiệm phân cắt các polyprotein tiền thân thành các protein cấu trúc và enzyme cần thiết cho sự trưởng thành và lây nhiễm của virus. Ức chế protease ngăn chặn quá trình này, làm virus không hoàn chỉnh và không lây nhiễm được.

2. Cơ chất peptide đặc hiệu được thiết kế dựa trên nguyên tắc nào?
   Cơ chất được thiết kế dựa trên trình tự cắt đặc hiệu của protease trên polyprotein gag hoặc gag-pol, với các biến đổi amino acid nhằm tăng ái lực và khả năng phát hiện hoạt tính enzyme qua các phương pháp quang học.

3. Phương pháp nào được sử dụng để đo hoạt độ protease HIV-1 trong nghiên cứu này?
   Nghiên cứu sử dụng phương pháp quang phổ khả kiến đo sự giảm hấp thu ánh sáng của cơ chất peptide cải biến và phương pháp quang phổ huỳnh quang dựa trên nguyên lý FRET với cơ chất gắn cặp chất phát và thu huỳnh quang.

4. Các hợp chất thực vật nào có khả năng ức chế protease HIV-1 mạnh nhất?
   Acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost-4(28),7,24-trien-3,26-dioic thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất với IC50 khoảng 0,05 µM, vượt trội so với các triterpen khác như acid maslinic và acid ursolic.

5. Kiểu ức chế của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost-4(28),7,24-trien-3,26-dioic là gì?
   Chất này là chất ức chế hỗn hợp, làm giảm cả Km và Vmax của enzyme, cho thấy nó ảnh hưởng đến cả sự gắn kết cơ chất và hiệu quả xúc tác của protease HIV-1.

Kết luận

• Thiết kế thành công cơ chất peptide đặc hiệu Peptide CH dựa trên trình tự cắt RT-IN của polyprotein gag-pol, phù hợp cho xác định hoạt độ protease HIV-1 bằng phương pháp quang phổ khả kiến.
• Xác định được điều kiện phản ứng tối ưu với nồng độ enzyme 134 nM, cơ chất 50-60 µM, đệm Na-acetate pH 4,7 có CaCl2.
• Hằng số động học cho thấy Peptide CH có ái lực và hiệu quả xúc tác thấp hơn so với các cơ chất huỳnh quang và thương mại, nhưng vẫn phù hợp cho nghiên cứu trong nước.
• Sàng lọc 20 hợp chất thực vật cho thấy acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost-4(28),7,24-trien-3,26-dioic là chất ức chế protease HIV-1 mạnh với IC50 0,05 µM.
• Kiểu ức chế hỗn hợp của hợp chất này mở ra hướng phát triển thuốc ức chế protease HIV-1 mới có nguồn gốc tự nhiên.

Next steps: Cải tiến cơ chất peptide để tăng độ nhạy, mở rộng sàng lọc các hợp chất tự nhiên, và tiến hành thử nghiệm in vivo để đánh giá hiệu quả và an toàn của các chất ức chế tiềm năng.

Call to action: Các nhà nghiên cứu và chuyên gia trong lĩnh vực sinh học phân tử, dược liệu và điều trị HIV/AIDS nên tiếp tục hợp tác để phát triển các công cụ và thuốc điều trị mới dựa trên kết quả nghiên cứu này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trầ n Thi Thu ̣ Huyề n NGHIÊN CỨU TẠO CƠ CHẤT PEPTIDE ĐẶC HIỆU CHO PROTEASE CỦA HIV-1 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trầ n Thi Thu ̣ Huyề n NGHIÊN CỨU TẠO CƠ CHẤT PEPTIDE ĐẶC HIỆU CHO PROTEASE CỦA HIV-1 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Thị Hồng Loan GS. Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội – 2016 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên , tôi xin đƣợc bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối với GS. Phan Tuấn Nghĩa và TS.

Nguyễn Thị Hồng Loan đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhấ t cho tôi trong suốt quá trình học tập , nghiên cứu và thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhấ t đến các thầy giáo , cô giáo của Khoa Sinh học cũng nhƣ các thầy , cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức nền tảng bổ ích. Lời cảm ơn tiếp theo tôi xin gửi tới các cán bộ, học viên sau đại học và sinh viên Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã chia sẻ và tạo những điều kiện tốt nhất để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đin ̀ h và ba ̣n bè đã luôn dành tình cảm , động viên và khích lệ tôi trong suố t quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn.

Luận văn đƣợc thực hiện trong phạm vi nội dung và kinh phí của đề tài KLEPT-14-03. Hà Nội, 15 tháng 12 năm 2016 Học viên, Trầ n Thi Thu ̣ Huyề n TIEU LUAN MOI download : [e-mail] MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦ A HIV-1.

HIV-1 nguyên nhân của bệnh AIDS. Cấ u trúc và chƣ́c năng của protease HIV-1. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA PROTEASE HIV -1. Phƣơng pháp quang phổ kế.

Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo. Phƣơng pháp miễn dich ̣ ELISA. Phƣơng pháp xác đinh ̣ hoa ̣t đô ̣ của protease không đánh dấ u theo thời gian (real time label free) bằ ng phân tić h nanopore. ĐẶC TÍNH CƠ CHẤT PEPTIDE CỦA PROTEASE HIV-1.

Trình tự amino acid trong cơ chất của protease HIV-1. Các nghiên cứu về cơ chất đă ̣c hiê ̣u của protease HIV-1. CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV -1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ HIV/AIDS. Các chấ t ƣ́c chế protease HIV-1.

Ứng dụng chất ức chế protease HIV-1 trong điề u tri ̣HIV/AIDS. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U.

Xác định hoạt độ của protease HIV -1 sƣ̉ du ̣ng cơ chấ t peptide cải biế n trên máy quang phổ khả kiến. Xác định hoạt độ của protease HIV -1 bằ ng cơ chấ t huỳnh quang trên máy quang phổ kế huỳnh quang. Xác định các hằng số động học của protease HIV-1. 26 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Chƣơng 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. THIẾT KẾ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA CƠ CHẤT PEPTIDE CHO XÁC ĐINH ̣ HOA ̣T TÍNH PROTEASE HIV-1. Trình tự amino acid của cơ chất protease HIV-1. Xác định một số đặc tính của cơ chất Peptide CH.

So sánh ái lƣ̣c của protease với Peptide CH và mô ̣t số cơ chấ t khác. THƢ̉ NGHIỆM DÙ NG CƠ CHẤT PEPTIDE THIẾT KẾ TRONG PHẢN Ƣ́NG SÀNG LỌC CHẤT ỨC CHẾ CỦA PROTEASE HIV-1. Sàng lọc chất ức chế tiềm năng của protease HIV-1. Khả năng ức chế protease HIV-1 của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanost- 4(28),7,24-trien-3,26-dioic.

Xác đinh kiểu ức chế protease HIV -1 của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanosta- 4(28),7,24-triene-3,26-dioic. ̣ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 47 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] BẢNG VIẾT TẮT AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome) ART Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus (Antiretroviral Drug Therapy) BSA Albunin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin) DABCYL 4-(4-Dimethylaminophenylazo) Benzoic Acid DMSO Dimethyl sulphoxide DTT Dithiothreitol EDANS 5-[(2-Aminoethyl) amino] naphthalene-1-sulfonic acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ELISA Kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme-linked immunosorbant assay) FRET Chuyển năng lƣợng cộng hƣởng huỳnh quang (Fluorescence resonance energy transfer) HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human Immunodeficiency Virus) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography) MES 2-(N-morpholino) ethanesulphonic acid MOPS 3-(N-orpholino) propanesulphonic acid Nle Norleucine Nph Nitrophenylalanine PI Chất ức chế protease (Protease Inhibitor) TCA Trichloroacetic acid CH Chromogenic HF Hilyte fluor IC50 Nồng độ chất ức chế tại đó 50% hoạt tính của enzyme bị ƣ́c chế TIEU LUAN MOI download : [e-mail] DANH MỤC HÌ NH Hình 1: Mô hình cấu trúc không gian của protease HIV-1. 5 Hình 2: Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1.

5 Hình 3: Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag, gag-pol. 7 Hình 4: Công thƣ́c cấ u ta ̣o của norleucine (A) và nitrophenylalanine (B). 8 Hình 5: Nguyên tắc xác định hoạt độ của protease HIV-1 sử dụng cơ chất huỳnh quang Peptide HF. 25 Hình 6: Ảnh hƣởng nồ ng đô ̣ protease HIV -1 đến tốc độ phản ứng sử dụng cơ chất Peptide CH.

30 Hình 7: Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất Peptide CH đến phản ƣ́ng thủy phân bởi protease HIV-1. 31 Hình 8: Ảnh hƣởng của đệm 1 và 2 tới phản ƣ́ng phân cắ t Peptide CH. 33 Hình 9: Ảnh hƣởng của pH tới tốc độ phân cắt Peptide CH bởi protease HIV-1. 34 Hình 10: So sánh tố c đô ̣ thủy phân cơ chấ t Peptide CH (A), L6525 (B) và Peptide HF (C) bởi protease HIV-1.

36 Hình 11: Hoạt tính ức chế protease HIV-1 của 20 hơ ̣p chấ t thƣ̣c vâ ̣t thƣ́ sinh. 41 Hình 12: Khả năng ứ c chế protease HIV -1 của acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanosta- 4(28),7,24-triene-3,26-dioic (A), acid maslinic (B), acid ursolic (C). 42 Hình 13: Tố c đô ̣ phản ƣ́ng thủy phân cơ chấ t bởi protease HIV -1 khi có mă ̣t acid 24(E)-3,4-seco-9βH-lanosta-4(28),7,24-triene-3,26-dioic ở các nồ ng đô ̣ khác nhau. 43 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol.

12 Bảng 2: Tầ n số xuấ t hiê ̣n của các amino acid (P4-P4’) của 11 cơ chấ t hi ệu quả của protease HIV-1. 14 Bảng 3: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣ protease HIV -1 sƣ̉ du ̣ng cơ chấ t Peptide đặc hiệu cải biế n. 24 Bảng 4: Thành phần của phản ứng đo hoạt đô ̣ protease HIV -1 sƣ̉ du ̣ng cơ chấ t đặc hiệu huỳnh quang Peptide HF. 26 Bảng 5: Các hằ ng số đô ̣ng ho ̣c của protease HIV -1 đố i với cơ chấ t Peptide CH (A), Cơ chấ t L6525 (B) và cơ chất HF (C).

36 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] MỞ ĐẦU Virus type 1 gây suy giảm viễn dich ̣ ở ngƣời (HIV-1) là tác nhân chính gây nên hô ̣i chƣ́ng suy giảm miễn dich ̣ mắ c phải (AIDS) ở ngƣời. Trong chu trình tái bản của HIV-1, protease có vai trò quan tro ̣ng phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho quá trình trƣởng thành của virus [19]. Vì vậy , protease của HIV -1 (protease HIV-1) đƣợc xem nhƣ một trong các đích quan trọng nhất cho liệu pháp dùng thuốc ức chế protease (PI) chống HIV-1 [18]. Cho đế n hiê ̣n nay , phƣơng thƣ́c điề u tri ̣phổ biế n cho ngƣời nhiễm HIV-1 là sử dụng liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART).

Tuy nhiên, kháng thuốc và tác dụng phụ vẫn đang là vấn đề lớn đối với các thuốc PI nói riêng và các thuốc điều trị HIV nói chung. Vì vậy, các nghiên cứu điều tra, phát triển chất ức chế mới của HIV vẫn đang đƣợc tiến hành [72] và các phƣơng pháp phù hợp cho xác định hoạt độ của protease là cần thiế t. Khác với các protease khác , protease HIV -1 có tính đă ̣c hiê ̣u cao trong nhận biết và phân cắt các cơ chất , enzyme chỉ thủy phân các cơ chấ t c ó liên kết đặc hiệu tƣơng tự nhƣ các vị trí cắt của nó trong cấu trúc của protein gag và gag -pol trong HIV-1. Vì vậy, phần lớn cơ chất của protease HIV -1 là các chuỗi peptide gồm tƣ̀ 7 amino acid P4-P3’có trình tự giống với một trong các vị trí cắt đặc hiệu của protease HIV-1 trên các chuỗi polyprotein này [29].

Mặt khác, các nghiên cứu cũng cho thấy kích thƣớc, trình tự và đặc tính của các amino acid đều ảnh hƣởng đến cấu hình của cơ chất với trung tâm hoạt động của protease HIV-1, qua đó ảnh hƣởng đến ái lực của cơ chất với enzyme [66]. Hiện nay, có nhiều loại cơ chất huỳnh quang hoặc cơ chấ t cải biế n tại vi ̣trí phân cắ t khác nhau cho xác định hoat độ của protease HIV-1 đã đƣợc thƣơng mại hóa. Tuy nhiên, trình tự amino acid của các cơ chất này thƣờng không đƣợc công bố. Ngoài ra, giá thành của các cơ chất này khá cao và cần có trang thiế t bi ma ̣ ́ y móc phù hơ ̣p.

1 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên , chúng tôi tiế n hành nghiên cƣ́u thiết kế cơ chất đặc hiệu có ái lực cao với protease HIV-1 sử dụng trong phân tích hoạt độ của enzyme, đồ ng thời sàng lo ̣c và phát hiê ̣n mô ̣t số chấ t ƣ́c chế protease HIV -1, góp phầ n tạo cơ sở cho các nghiên cứu phát triển các thuốc ức chế protease HIV-1 trong nƣớc. 2 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦ A HIV-1 1.

HIV-1 nguyên nhân của bệnh AIDS Năm 1983, virus HIV với tên go ̣i ban đầ u là virus liên quan tới viêm ha ̣ch (LAV) lần đầu tiên đƣơ ̣c phân lâ ̣p thành công bởi Montagnier và tập thể ở viện Pasteur. Virus này đƣợc Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV (type 1) vào năm 1986 [27]. Cùng thời điểm này, ngƣời ta đã phân lập đƣợc HIV- type 2 ở Tây Phi, đây là virus gốc của HIV-type 1.