Đồ án: Khảo sát phân đoạn TI-F từ cao Ethyl Acetate của hạt me

Tài liệu đồ án tốt nghiệp nghiên cứu chiết xuất cao ethyl acetate từ hạt me (Tamarindus indica L.). Khảo sát, phân tích phân đoạn hóa học TI-F.

• Tác giả: Đặng Hà Hoàng Bảo
• Người hướng dẫn: TS. Phan Thị Anh Đào
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học
• Đề tài: Khảo Sát Phân Đoạn Ti-F Của Cao Etyl Acetate Được Điều Chế Từ Hạt Me (Tamarindus Indica L.)
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp Đại Học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây Me Tamarindus indica

Cây me (Tamarindus indica L.) là một loài cây trropical có nguồn gốc từ châu Phi, được trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trên toàn thế giới. Hạt me không chỉ được sử dụng trong nấu ăn mà còn là nguồn nguyên liệu quý báu cho các nghiên cứu dược học và chiết xuất hóa chất. Cây me có giá trị dinh dưỡng cao với các hợp chất bioactive như polysaccharide, flavonoid và các chất chống oxy hóa tự nhiên. Những công dụng truyền thống của me trong y học cổ truyền đã được các nhà khoa học hiện đại xác nhận và phát triển thành các sản phẩm công nghiệp. Thành phần hóa học phong phú của hạt me làm cho nó trở thành đối tượng nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực hóa học dược phẩm và công nghệ sinh học.

1.1. Đặc điểm thực vật và phân loại

Tamarindus indica là cây gỗ cao có thân đơn, vỏ màu xám nâu. Lá cây me xếp so le, nhỏ, dài 10-15 cm. Hoa me có màu vàng nhạt, mọc thành chùm. Quả me là một quả hạc đặc trưng, có vỏ giòn, dài 10-15 cm chứa hạt me màu nâu sẫm bao quanh bởi thịt quả chua. Cây me thích hợp với khí hậu nóng, được trồng phổ biến ở các nước Đông Nam Á, đặc biệt là Việt Nam.

1.2. Hoạt tính sinh học và ứng dụng truyền thống

Trong y học cổ truyền, me được sử dụng để điều trị tiêu chảy, táo bón và các bệnh về tiêu hóa. Hoạt tính sinh học của hạt me bao gồm tính chống viêm, chống oxy hóa và kháng khuẩn. Các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh rằng cao ethyl acetate từ hạt me chứa các hợp chất polysaccharide và flavonoid có khả năng ức chế gốc tự do DPPH mạnh mẽ.

II. Quy trình chiết xuất Cao Ethyl Acetate từ Hạt Me

Chiết xuất cao ethyl acetate là một phương pháp hiệu quả để phân lập các hợp chất hoạt tính từ hạt me. Quá trình bắt đầu bằng việc xử lý mẫu hạt me, tiếp theo là chiết xuất dung môi sử dụng ethyl acetate làm dung môi chiết chính. Phương pháp sắc ký cột (CC) được sử dụng để phân tách cao thành các phân đoạn khác nhau dựa trên độ cực của các hợp chất. Sắc ký bản mỏng (TLC) được sử dụng để theo dõi tiến trình phân tách và xác định độ tinh khiết của các phân đoạn. Kết quả cuối cùng là các cao phân đoạn TI-F được phân lập, trong đó cao ethyl acetate chứa nồng độ cao các hợp chất fenolic và polysaccharide acetyl.

2.1. Các bước chuẩn bị mẫu và chiết xuất

Hạt me được thu thập, rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ phòng. Sau đó, mẫu được nghiền thành bột mịn và trộn đều. Chiết xuất ethanol được thực hiện đầu tiên bằng phương pháp ngâm hoặc soxhlet. Sau khi lọc, dịch chiết được cồn đặc bằng máy quay ở nhiệt độ thấp để tạo thành cao chiết. Cao này là nền tảng cho các bước phân đoạn tiếp theo.

2.2. Phân đoạn và sắc ký

Cao ethyl acetate được pha loãng và áp dụng lên cột sắc ký chứa silica gel. Hỗn hợp dung môi gradient từ nhẹ đến nặng được sử dụng để rửa cột. Phân đoạn TI-F được thu thập dựa trên giá trị Rf trên TLC. Mỗi phân đoạn được cồn tập trung và sấy khô để thu được bột cao tinh khiết cho các bước phân tích tiếp theo.

III. Phân tích cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập

Phân tích cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ cao ethyl acetate sử dụng các phương pháp phổ học hiện đại. Phổ NMR (¹H-NMR và ¹³C-NMR) giúp xác định cấu trúc carbon và proton trong phân tử. Phổ khối lượng (MS) cung cấp thông tin về khối lượng phân tử và mảnh vỡ đặc trưng. Phương pháp COSY, HSQC, HMBC được sử dụng để xác định liên kết giữa các nguyên tố và xác nhận cấu trúc. Kết quả cho thấy phân đoạn TI-F1A chứa (-)-epicatechin, một flavonoid quan trọng với hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ. Hợp chất polysaccharide acetyl (TSPA) cũng được phát hiện có hoạt tính sinh học đáng kể.

3.1. Kỹ thuật phổ NMR và xác định cấu trúc

Phổ ¹H-NMR của hợp chất TI-F1A cho thấy các mũi đôi (doublet) và mũi đơn (singlet) đặc trưng của flavonoid. Phổ ¹³C-NMR và DEPT xác nhận sự hiện diện của các carbon thơm và carbon aliphatic. Hằng số ghép (J) giữa các proton cung cấp thông tin về cấu trúc ba chiều. Những dữ liệu này được so sánh với tài liệu tham khảo để xác định chính xác hợp chất là (-)-epicatechin.

3.2. Phân tích bằng phổ khối lượng và các phương pháp hỗ trợ

Phổ MS của hợp chất cho m/z = 290, tương ứng với khối lượng phân tử của (-)-epicatechin. Các mảnh vỡ đặc trưng ở m/z = 245, 205 và 137 xác nhận cấu trúc flavonoid. Phương pháp HMBC cho thấy liên kết giữa carbon thơm và proton ở các vị trí xa, hỗ trợ xác định vị trí của các nhóm thay thế.

IV. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của Cao Ethyl Acetate

Cao ethyl acetate từ hạt me thể hiện hoạt tính chống oxy hóa ấn tượng, với IC50 giảm gốc tự do DPPH ở mức nanomol/mL. Hợp chất (-)-epicatechin được phân lập có khả năng ức chế 50% gốc tự do ở nồng độ rất thấp. Polysaccharide acetyl (TSPA) từ hạt me có hoạt tính kích thích miễn dịch và chống viêm được ghi nhận. Những phát hiện này mở ra tiềm năng ứng dụng của cao ethyl acetate trong phát triển thuốc, sản phẩm chức năng và mỹ phẩm. Hoạt tính chống oxy hóa đặc biệt hữu ích trong bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa các bệnh liên quan đến stress oxy hóa như ung thư, tim mạch và viêm.

4.1. Hoạt tính chống oxy hóa và các cơ chế tác động

Cao ethyl acetate chứa flavonoid và polysaccharide có khả năng khử gốc tự do thông qua cơ chế donation điện tử. Epicatechin có ba nhóm hydroxyl trên vòng flavonoid giúp ổn định gốc tự do DPPH hiệu quả. Polysaccharide acetyl có hoạt tính phụ thông qua chelation kim loại và ức chế lipid peroxidation.

4.2. Tiềm năng phát triển sản phẩm và ứng dụng thương mại

Cao ethyl acetate từ hạt me có thể được phát triển thành thuốc bổ, nutraceutical hoặc thành phần mỹ phẩm. Hoạt tính chống oxy hóa mạnh làm nó trở thành lựa chọn tự nhiên thay thế chất chống oxy hóa tổng hợp như BHA, BHT. Khả năng ức chế matrix metalloproteinase (MMPs) còn hữu ích trong chống lão hóa da và liệu pháp ung thư.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay, việc tìm kiếm, phát hiện và nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ nguồn tài nguyên thực vật phong phú của nước ta là mối quan tâm chung của các ngành Hoá, Sinh, , Dược. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các hợp chất thiên nhiên đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học Cho đến thời điểm này tại Việt Nam, cây me thuộc chi Tamarindus của họ Đậu (Fabaceae) chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học, chỉ số ít nghiên cứu về Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) của hạt me. Các nghiên cứu về ứng dụng hạt me hay cao chiết hạt me để tận dụng nguồn hoạt chất sinh học chưa được áp dụng rộng rãi và cần được nghiên cứu sâu hơn nữa, về mặt tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có trong quả me lại không có nhiều nghiên cứu , do vậy quả me là một đối tượng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học và thực tế. Theo như báo cáo TS.

Phan Thị Anh Đào và cộng sự (2017) đã công bố trên tạp chí ―Phân tích hóa, lý và sinh học‖ rằng khảo sát trên các loại hạt hiện có ở đất nước Việt Nam đã chứng minh được hạt me thuộc chi Tamarindus của họ Đậu (Fabaceae) có hoạt tính kháng oxy hóa, tổng hàm lượng flavonoid và phenolic cao. Theo nghiên cứu đó, để góp phần tìm hiểu và nhận danh một số hợp chất có trong thành phần của cây me Tamarindus indica (L.) phục vụ cho lĩnh vực khoa học y dược đồng thời góp phần mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn thực vật Việt Nam. Chúng tôi quyết định tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và định danh các hợp chất tự nhiên từ cao ethyl acetate của hạt me (Tamarindus indica L.  Mục tiêu luận văn: Nghiên cứu phân lập và định danh một số hợp chất từ các cao phân đoạn của hạt me Tamarindus indica (L.), thuộc họ Đậu Fabaceae.

Từ đó làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu sau này.  Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu  Cách tiếp cận Tham khảo tài liệu.  Phương pháp nghiên cứu ix Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: Trích ngâm dầm trong dung môi MeOH. Cô lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký điều chế.

Phương pháp nghiên cứu phân tích tổng hợp: Phân tích và tổng hợp các dữ liệu phổ nghiệm như phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C, DEPT, COS , HMBC, HSQC và khối phổ để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết phân lập lập được. x CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Tamarindus indica (L.1 Mô tả thực vật Cây me, tên khoa học Tamarind indica (L.) hay còn gọi là Tamarindus được nhà khoa học Linn phát hiện vào năm 1753 [1], thuộc họ Đậu (Fabaceae) lớn thứ ba trong các họ thực vật có hoa sau họ Phong lan và họ Cúc [2].) là loài duy nhất trong chi Tamarindus [3, 4]. Mô tả thực vật : Tamarindus indica (L.) là loại cây thân gỗ, có thể cao tới 20 mét, lá cây thường xanh trong những khu vực không có mùa khô và thường có nhiều nhánh với các nhánh lan rộng, rủ xuống ở hai đầu. Rễ cây tạo ra một rễ cọc sâu xuống lòng đất và một hệ thống rễ con chằng chịt xung quanh, nhưng rễ cọc quá sâu có thể làm cho việc cản trở mạch nước ngằm hoặc có thể bị nén chặt lại gây tắt mạch nước ngầm, hệ thống gốc rộng lớn của nó cũng đóng góp cho khả năng chịu hạn hán và gió.

Gỗ của thân cây me bao gồm lớp gỗ lõi cứng, màu đỏ sẫm, và lớp dác gỗ mềm có màu ánh vàng. Lá của nó có dạng lá kép lông chim, bao gồm từ 10 đến 40 lá nhỏ. Hoa tạo thành dạng cành hoa (cụm hoa với trục kéo dài và nhiều cuống nhỏ chứa một hoa, giống như ở cây đậu lupin). Quả là loại quả đậu màu nâu, bên trong chứa cùi thịt và nhiều hạt có vỏ cứng.

Mỗi quả chứa 1-12 hạt dẹt, bóng, có dạng bầu dục, mỗi hạt 3-10 x 1,3 cm và tâm của mỗi mặt phẳng của hạt được đánh dấu với một vết lõm trung tâm lớn. Quả chín khoảng 10 tháng sau khi ra hoa và có thể là thời kỳ ra hoa tiếp theo. Hạt có thể có đường rạch đôi để tăng cường khả năng nảy mầm [2, 3, 5].1: Nhụy hoa ( bên trái ) và Lá ( bên phải) của cây me Hình 1.2: Thân cây Tamarindus indica (L.3: Quả me chín 1.2 Phân bố Họ Đậu (Fabaceae) là một họ thực vật lớn với khoảng 500 chi và 2000 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ở ôn đới. Tại Việt Nam, họ Đậu có 90 chi và khoảng 450 loài.

Theo Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam, họ Đậu rất phong phú về dạng sống: cây gỗ, cây bụi, thân thảo, dây leo, dây leo thân thảo. Cây me (Tamarindus indica (L.)) được tìm ra đầu tiên ở Mexico (Châu Mỹ) năm 1615 [5]. Vùng phân bố của Tamarindus indica (L.) trải dài từ Châu Phi đến phía Nam và Đông Nam Á đây là một sự phân bố tuyệt vời, điều này giúp cho bây giờ ta có thể dễ dàng nghiên cứu về loài Tamarindus indica (L. 2 Cây me Tamarindus indica (L.) chiếm khoảng 1/3 diện tích rừng ở Madagascar [7] thuộc địa phận Châu Phi và được phân bố rộng rãi ở các khu vực như: phía nam Ấn Độ, Philippines, phía Bắc Malaysia, các đảo Caribbean bao gồm Jamaica, Cuba, Antilles Greater and Lesser, Cộng hòa Dominican và một số vùng lận cận ở Châu Á và Đông Nam Á.

indica thích nghi rất tốt với điều kiện khí hậu bán khô hạn [8]. Thời tiết khô là yếu tố rất quan trọng trong thời kỳ phát triển của quả me chính vì vậy ở Puerto Rico và Madagascar cây me được trồng đại trà, sản xuất hàng năm, hệ sinh thái ở vùng này rất thích hợp để trồng Tamarindus indica (L. Ở nước ta, cây me có thể mọc hoang hay trồng phân bố ở khắp cả nước, được trồng làm bóng mát và cây ăn quả, dọc theo các con đường , trong sân vườn và công viên.3 Những nghiên cứu về dược học Quả me thường được sử dụng như một phương thuốc sức khỏe trên khắp Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ. Sản phẩm me, lá, quả và hạt giống đã được sử dụng rộng rãi trong y học Ấn Độ và y học cổ truyền Châu Phi.

Trong đông y quả me có vị chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng.1 Kinh nghiệm sử dụng trong dân gian Vỏ cây me có vị chát, có tác dụng làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu hóa (kiết lỵ, tiêu chảy,.) và nấu nước để ngậm chữa viêm lợi, viêm nha chu [9]. Lá me có tác dụng giải độc, chữa rôm sảy, mẩn ngứa, thường được dùng để nấu nước tắm cho trẻ em đề phòng bệnh ngoài da vào mùa hè [10]. Thịt me, lá và hoa được kết hợp với nhau trong nhiều bài thuốc đông y để đắp vào các khớp bị đau. Quả me cũng được biết như một loại thuốc chữa bệnh thiếu máu (hàm lượng sắt 2,8%) và có tác dụng hỗ trợ cơ chế đông máu (hàm lượng calcium 7% kết hợp với vitamin K) [11, 12].

Ở Ấn Độ, cây me được dùng để điều trị một số bệnh liên quan đến dạ dày hay đường tiêu hóa nói chung và trong hoạt động bảo vệ tim mạch. Ở miền bắc Nigeria, vỏ 3 thân cây me tươi và lá tươi được sử dụng để điều trị các rối loạn dạ dày, đau cơ thể, sốt vàng da và là loại thuốc bổ máu [13]. Ở Philipine, lá me được dùng trong một số loại trà thuốc để giảm sốt rét.2 Hoạt tính sinh học a) Nghiên cứu trong nƣớc Hạt me là sản phụ phẩm trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ me, việc tận dụng nguồn phụ phẩm làm giảm bớt được lượng rác thải ra môi trường. Kết quá nghiên cứu của Bùi Ngọc Tân (2016) thực hiện xác định thành phần hóa học của Tamarind Seed Polysaccharide bằng phương pháp sắc kí thẩm thấu gel, phương pháp phổ IR, NMR, MS, tán xạ ánh sáng và tán xạ tia X góc nhỏ đã cho được kết quả cấu trúc của Tamarind Seed Polysaccharide trong hạt me là một galactoxyloglucan.

Song, điều chế được dẫn xuất của Tamarind Seed Polysaccharide với khả năng ly giải được máu đông, khả năng chống đông tụ máu và hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định [14]. Nhìn chung, trong nước chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần và hoạt tính sinh học của cây Tamarind indica (L. Song trên thế giới, hiện đã có một số nghiên cứu hoạt tính sinh học về cây T. b) Nghiên cứu ngoài nƣớc  Hoạt tính kháng khuẩn Muthu, Shankar Esaki, Vaghasiya và cộng sự (2005), đã nghiên cứu chiết xuất methanol từ lá của loài T.

indica rằng có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại Burkholderia pseudomallei [15], Klebsiella pneumoniae [15, 16]. Hoạt tính được so sánh với chất chuẩn là thuốc Amikacin và Piperacillin [17, 18]. Escalona-Arranz và cộng sự (2010), đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất từ vỏ, thân và lá với dung môi nước và dung môi hữu cơ (acetone và ethanol). Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cô đặc được đánh giá bằng cách xác định đường kính vùng ức chế chống lại vi khuẩn gram âm và gram dương và nấm bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy [19], chất kháng sinh so sánh là Ampicilin, Streptomycin, Amphotericin B và mẫu trắng [20, 21].

Kết quả: nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn được chiết xuất từ thực vật không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ nhưng bị giảm ở pH kiềm, sự hiện diện của tannin, saponin, sesquiterpen, alkaloid và phlobat vitamin có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với Salmonella paratyphoid, Bacillus subtilis, Salmonella typhiand Staphylococcus aureus [22, 23]. 4  Hoạt tính chống oxy hóa Takanori Tsuda và cộng sự (1994) đã định danh được các hợp chất tự nhiên như 2-hydroxy-3’,4’-dihydroxyacetophenone; metyl 3,4-dihydroxybenzoate; 3,4- dihydroxyphenylacetat và epicatechin. Đây là những chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Bên cạnh đó, chất chống oxy hóa ưa lipid (linoleic acid) cũng được phân lập và định danh từ hạt me, thử nghiệm hoạt tính theo mô hình thử với acid thiobarbituric [24].

Theo như Yean-Yean Soong , Philip J. Barlow và cộng sự (2004) đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và tổng hàm lượng phenolic của các phần ăn được với hạt me. Các thử nghiệm cation và FRAP của ABTS đã được sử dụng để xác định hoạt tính chống oxy hóa, thử nghiệm FCR được sử dụng để đo tổng hàm lượng phenolic [25].