ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng viêm đường hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên là vi rút hoặc vi khuẩn chủ yếu hay gặp tại các nước có kiểu hình khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều. Một số tác nhân có thể gây nên các vụ dịch lẻ tẻ hoặc thành đại dịch (dịch cúm, vi rút hợp bào hô hấp – Respiratory Sycytial Virus…) [6, 30, 51]. Tác nhân vi rút gây bệnh thường gặp là: vi rút thuộc họ Picornaviridae, Paramyxoviridae (RSV, vi rút á cúm…), Orthomyxoviridae (vi rút cúm A, B…) [1, 13, 51]. Trong đó, vi rút cúm được xem là một trong những căn nguyên quan trọng nhất gây bệnh VĐHHC [50, 59, 79].
Hiện nay có khoảng hơn 200 loại vi rút có cấu trúc kháng nguyên khác nhau gây bệnh VĐHHC. Trên thế giới, hội chứng VĐHHC xuất hiện quanh năm ở các vùng ôn đới, nhất là vào thời gian thời tiết lạnh và ẩm. Bệnh viêm đường hô hấp cấp do căn nguyên vi rút thường mang tính chất “mùa” - đó là thời gian mà số mắc trong cộng đồng tăng cao, ví dụ: dịch cúm theo mùa, RSV thường tập trung vào mùa đông tại các nước ôn đới thuộc khu vực Bắc bán cầu, á cúm là nguyên nhân chính gây VĐHHC vào mùa thu và đầu đông, trong khi cao điểm của nhiễm vi rút entero lại vào cuối hè… VĐHHC do vi rút có ảnh hưởng lớn tới sức khỏe đặc biệt đối với trẻ em và người già tại các nước đang phát triển. Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng 4.5 triệu trẻ em dưới 5 tuổi tử vong hàng năm do VĐHHC và căn nguyên vi rút chiếm 40% trong tổng số đó [86].
Tại Việt Nam, bệnh VĐHHC xảy ra quanh năm, có tỷ lệ mắc đứng đầu trong 10 bệnh truyền nhiễm cấp tính [12]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về VĐHHC do căn nguyên vi rút cũng như các tác nhân nào chủ yếu và thường gặp còn hạn chế. Đặc biệt các nghiên cứu sâu về vi rút học và các phương pháp chẩn đoán nhanh phòng thí nghiệm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên của các tác nhân vi rút gây bệnh VĐHHC hiện chưa được áp dụng rộng rãi, đó là lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu: 1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com “Tìm hiểu các căn nguyên vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của một số bệnh nhân điều trị ở bệnh viện đa khoa Việt Tiệp - Hải Phòng 2010-2012”. Với mục tiêu: 1.
Xác định các tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp của bệnh nhân điều trị tại bệnh viện đa khoa Việt Tiệp Hải Phòng bằng phương pháp RT- PCR và Luminex/xTAG RVP. Tìm hiểu đặc điểm di truyền của vi rút cúm thông qua phân tích các vi rút cúm được phân lập 3. Hoàn thiện quy trình chẩn đoán sớm nhiễm vi rút đường hô hấp trên bệnh phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật RT- PCR thông dụng (conventional RT-PCR). 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÁC VI RÚT ĐƢỜNG HÔ HẤP Các vi rút gây bệnh VĐHHC thường gặp được ghi nhận từ 5 họ là: Adenoviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae và Orthomyxoviridae.
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này của chúng tôi các vi rút thuộc 4 họ thông dụng được phân tích đó là: Bảng 1. Các vi rút gây bệnh VĐHHC STT Họ Loại vi rút 1 Orthomyxoviridae - Vi rút cúm A (H1N1, H3N2, H1pdm, H5N1) - Vi rút cúm B 2 Paramyxoviridae - Vi rút hợp bào đường hô hấp (Respiratory syncytial virus-RSV) - Vi rút human Metapneumoviridae (hMPV) - Vi rút á cúm (vi rút Parainfluenza) phân típ 1, 2, 3. 3 Picornaviridae - Vi rút Entero - Vi rút Rhino 4 Coronaviridae - Vi rút gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp tính nguy hiểm (Severe acute respiratory syndrome coronavirus - SARS-CoV) 1. Vi rút họ Orthomyxoviridae 1.1 Hình thái: Orthomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genome là ARN đơn, âm, phân đoạn.
Trước đây, các vi rút Orthomyxo và Paramyxo đều được xếp chung vào một họ là Myxoviridae do chúng có cấu trúc và khả năng lây bệnh giống nhau, nhưng về sau được tách thành 2 họ riêng là Orthomyxoviridae và Paramyxoviridae do phát hiện thấy chúng còn nhiều đặc điểm cơ bản không giống nhau [13, 51]. 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Vi rút Orthomyxoviridae gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa [51]. Trong đó vi rút cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và các động vật khác như lợn, ngựa… là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B thường gây bệnh nhẹ nhưng cũng có thể bộc phát thành dịch vào mùa đông, đặc biệt là ở trẻ em.
Vi rút cúm C chưa thấy biểu hiện gây bệnh nguy hiểm cho người. Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm [18] Virion có vỏ đa hình thái, thường có hình cầu với cấu trúc xoắn, đường kính 80-120nm nhưng đôi khi cũng thấy dạng sợi dài đến vài µm. Genome của vi rút cúm A và B được chia thành 8 phân đoạn, đơn âm với tổng khối lượng 5x106 Dalton. Trong virion có chứa enzyme ARN-polymerase phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trình phiên mã vì genome là ARN chuỗi âm.
Protein capsid kết hợp với ARN tạo nucleocapsid đối xứng xoắn. Nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: Matrix) phía ngoài màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ. Protein M2 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH trong endosome thay đổi [13]. Bề mặt vi rút có đính các gai bản chất là glycoprotein, đó là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).
Protein HA gây ngưng kết hồng cầu và có vai trò gắn vi rút vào tế bào vật chủ, protein NA có vai trò phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào để giải phóng vi rút.2 Cấu trúc phân tử Vật liệu di truyền của vi rút cúm A, B là 8 phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb. Mỗi phân đoạn mã hoá cho 1 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: 7 protein cấu trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc: NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NP đối với vi rút cúm B. Phân đoạn gen HA gồm 1.778 nucleotid mã hóa cho 562-566 axit amin, protein HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, gắn với thụ thể chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và giúp vi rút xâm nhập vào tế bào. Protein HA tồn tại dưới 2 dạng: dạng tiền thân không phân tách là HAo hoặc dạng phân tách thành HA1 và HA2 liên kết với nhau bởi cầu nối disulfua (S-S).
Sự phân tách này là điều kiện quyết định để vi rút có khả năng gây nhiễm và lây truyền của vi rút [73]. Ngoài ra, vị trí axit amin trên gen HA có vai trò gắn với thụ thể tế bào chủ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc lây truyền vi rút cúm. Vi rút cúm người gắn vào thụ cảm thể trên tế bào chủ tại cổng 2. Phân đoạn gen NA có 1413 nucleotid mã hóa cho 453 axit amin.
Protein NA có bản chất là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc giải phóng vi rút từ tế bào nhiễm và lan trải vi rút trong đường hô hấp. Các đột biến tại vị trí axit amin: 275, 295 ở NA của típ N1 hay 292 ở NA của típ N2 liên quan sự kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút (Osertamivir và Zanamivir). Sự đột biến này được cho là kết quả của quá trình cạnh tranh sinh học [19, 34, 35, 42, 44] 5 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.3 Cơ chế nhân lên Hấp phụ Nảy chồi Sau dịch mã Đóng gói Dịch mã Nhập bào Nhân Dung hợp, cởi vỏ Hình 1. Chu trình nhân lên của vi rút cúm[48] - Đầu tiên, vi rút sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất nhờ gai glycoprotein HA.
Vi rút xâm nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào. Màng tế bào bao lấy vi rút, tạo bọng (endosome) nằm bên trong tế bào chất. Quá trình dung hợp với màng endosome làm giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất và được vận chuyển vào trong nhân tế bào. - Trong nhân sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung cARN (+) nhờ enzyme ARN - polymerase phụ thuộc ARN của vi rút.
Chính các cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của vi rút. Các sợi ARN (-) được tạo thành này là một sợi hoàn chỉnh về độ dài và một phần được phiên mã tạo ra các mARN (+) ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein chức năng xảy ra ở tế bào chất. - Các protein NS1, M1 và NP được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó được vận chuyển ra tế bào chất.
Tại đây, nucleocapsid được bao bọc bởi các protein HA, NA, M2 thông qua sự tương tác với bộ máy Golgi. Hạt virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất, axit sialic ở màng sinh chất sẽ bị phân cắt bởi 6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com enzyme NA và giải phóng vi rút ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm mới. Như vậy, quá trình sao chép của vi rút cúm xảy ra trong nhân tế bào. Vi rút họ Paramyxoviridae Paramyxoviridae là họ vi rút có genome ARN (-), không phân đoạn.
Họ Paramyxoviridae gồm các vi rút quan trọng gây bệnh cho người và động vật như sởi, quai bị, á cúm (parainfluenza), hợp bào hô hấp (Respiratory Syncytial Virus- RSV), bệnh tả gà Newcastle, sốt chó (canine distemper), sốt trâu bò (rindepest) và một số bệnh đường hô hấp khác [12]. Nhưng các vi rút thường gặp gây VĐHHC là vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV), hMPV và parainfluenza (á cúm phân típ 1, 2, 3).1 Hình thái Virion thuộc loại đa hình thái, thường có hình cầu với đường kính 50- 200nm, chứa 5-7 polypeptid và một phân tử ARN đơn (-), dài, khối lượng 5- 7x106. Bao quanh nucleocapsid đối xứng xoắn là màng M có cấu tạo từ protein M không được glycosyl hoá. Phía ngoài màng M là vỏ ngoài với các gai glycoprotein bề mặt dài khoảng 8nm.
Virion bị bất hoạt bởi các dung môi hoà tan lipid, chất tẩy rửa, formaldehyde, các chất oxy hoá… Đặc điểm đặc trưng là hạt vi rút được bao bọc bởi 2 lớp vỏ lipid với các gai glycoprotein mang tính kháng nguyên [13].