LàI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm trước pháp luật.
Tác giÁ Võ Thß Đoan Trang LàI CÀM ¡N Trong quá trình nghiên cāu và hoàn thành lu¿n văn này, tôi đã nh¿n đ°āc sā quan tâm và giúp đÿ quý báu cÿa các thầy cô, b¿n bè và đßng nghiáp. Đầu tiên, tôi xin bày tá lòng biÁt ¢n chân thành và sâu sÁc đÁn PGS. Đào Viát Hà đã t¿n tình h°ớng dÁn và t¿o mßi điÃu kián tãt nhất giúp tôi hoàn thành lu¿n văn. Tôi xin trân trßng cÁm ¢n Ban lãnh đ¿o Hßc vián Khoa hßc và Công nghá - Vián Hàn lâm Khoa hßc và Công nghá Viát Nam, Ban lãnh đ¿o Vián Nghiên cāu và Āng dụng công nghá Nha Trang, Ban lãnh đ¿o Vián HÁi d°¢ng hßc Nha Trang đã t¿o mßi điÃu kián thu¿n lāi giúp tôi hoàn thành các hßc phần cÿa lu¿n văn và các thÿ tục cần thiÁt.
Tôi xin chân thành cÁm ¢n sā giúp đÿ và t¿o điÃu kián và mßi mặt cÿa quý anh chá Phòng thí nghiám và An toàn thāc ph¿m và môi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung)- Vián HÁi d°¢ng hßc Nha Trang; cÿa quý thầy cô, anh chá hßc viên cao hßc các lớp CHE21A đang công tác và hßc t¿p t¿i Vián Nghiên cāu và Āng dụng công nghá Nha Trang. Tôi cũng xin cÁm ¢n Sá Giáo dục và Đào t¿o Khánh Hòa, Ban lãnh đ¿o tr°ßng THPT Lý Tā Trßng, các anh chá em đßng nghiáp đã luôn t¿o điÃu kián trong công viác, đáng viên và trā giúp tôi để tôi dành thßi gian chuyên tâm hßc t¿p và hoàn thành lu¿n văn. Cuãi cùng, tôi xin bày tá lòng biÁt ¢n sâu sÁc đÁn gia đình, ng°ßi thân và b¿n bè đã quan tâm, đáng viên và giúp đÿ tôi trong suãt quá trình hßc t¿p và hoàn thành lu¿n văn. Tác giÁ luÃn văn Võ Thß Đoan Trang 1 MĀC LĀC MĀC LĀC.
1 DANH MĀC CÁC KÍ HIàU VÀ CHĀ VI¾T TÄT. 4 DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ. TàNG QUAN NGHIÊN CĀU .ĐàC Tâ TETRODOTOXIN .Đặc tính, cấu trúc hóa hßc .Mát sã dÁn chất cÿa Tetrodotoxin.C¢ chÁ ho¿t đáng.Tetrodotoxins trong ãc biển .MàT Sâ PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH TETRODOTOXINS.Ph°¢ng pháp thā nghiám sinh hßc .Ph°¢ng pháp sinh hóa chuát .Ph°¢ng pháp thā nghiám cÁm āng sinh hßc .Thā nghiám trên mô tÁ bào .Ph°¢ng pháp thā nghiám hấp thụ mißn dách liên kÁt với enzyme .Ph°¢ng pháp hóa hßc .Ph°¢ng pháp sÁc ký lớp máng .Ph°¢ng pháp quang phá hßng ngo¿i .Ph°¢ng pháp sÁc ký khí khãi phá .Ph°¢ng pháp sÁc ký láng hiáu năng cao .PH¯¡NG PHÁP SÀC KÝ LàNG KHâI PHà .S¢ l°āc và sÁc ký láng khãi phá .ThiÁt bá sÁc ký láng khãi phá .Cát tách và pha tĩnh.Detector khãi phá .Mát sã chÁ đá trong sÁc ký láng khãi phá .ChÁ đá khÁo sát ion chßn lßc .ChÁ đá khÁo sát ion cô l¿p và khÁo sát đa ion cô l¿p. ĐâI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU.
ĐâI T¯ĀNG NGHIÊN CĀU. Nguyên liáu, thiÁt bá. Dung môi, hóa chất. ThiÁt bá, dụng cụ phân tích.
PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU. Thu mÁu và bÁo quÁn mÁu .Xây dāng quy trình phân tích. KhÁo sát điÃu kián khãi phá xác đánh TTX. KhÁo sát điÃu kián sÁc ký láng hiáu năng cao.
KhÁo sát quy trình xā lý mÁu. Đánh giá quy trình phân tích TTXs. KhÁo sát khoÁng tuyÁn tính và xây dāng đ°ßng chu¿n. Xác đánh giới h¿n phát hián và giới h¿n đánh l°āng.
Đá chụm và đá đúng cÿa ph°¢ng pháp. K¾T QUÀ VÀ THÀO LUÂN. KHÀO SÁT ĐIÂU KIàN PHÂN TÍCH TTXs TRÊN THIÀT Bà LC- MS/MS. KhÁo sát các điÃu kián cÿa detector khãi phá.
KhÁo sát các điÃu kián cÿa há pha đáng. KhÁo sát ch°¢ng trình gradient pha đáng. KHÀO SÁT QUY TRÌNH XĀ LÝ MÀU. KhÁo sát nßng đá dung môi tách chiÁt.
KhÁo sát thể tích dung môi rāa giÁi. ĐÁNH GIÁ PH¯¡NG PHÁP PHÂN TÍCH.KhÁo sát khoÁng tuyÁn tính và l¿p đ°ßng chu¿n. Giới gi¿n phát hián và giới h¿n đánh l°āng. Đánh giá đá chụm và đá đúng cÿa ph°¢ng pháp.
PHÂN TÍCH MàT Sâ MÀU âC THĀC TÀ. 58 K¾T LUÂN VÀ KI¾N NGHÞ. 62 TÀI LIàU THAM KHÀO. 69 4 DANH MĀC CÁC KÍ HIàU VÀ CHĀ VI¾T TÄT Hiáp hái các nhà hóa AOAC Association of official analytical chemists phân tích chính thāc.
Axit ethylene diamine EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid tetraacetic Xét nghiám hấp thụ mißn ELISA Enzyme linked immunosorbent assay dách liên kÁt với enzyme Kỹ thu¿t ion hóa bằng ESI Electro spray ionization phun đián tā FLD Fluorescence detector Đầu dò huỳnh quang GC-MS Gas chromatography-Mass spectrometry SÁc ký khí ghép khãi phá IR Infrared spectroscopy Phá hßng ngo¿i HPLC High performance liquid chromatography SÁc ký láng hiáu năng cao Liquid chromatography- Mass LC-MS SÁc ký láng ghép khãi phá spectrometry LC- Liquid chromatography tandem mass SÁc ký láng khãi phá kép MS/MS spectrometry LOD Limit of detection Giới h¿n phát hián LOQ Limit of quantitation Giới h¿n đánh l°āng Ph°¢ng pháp sinh hóa MBA Mouse bioassay chuát Kỹ thu¿t khÁo sát MRM Multiple reaction monitoring đa ion cô l¿p 5 Đác tã gây tê liát á PSP Paralytic shellfish poisons đáng v¿t có vá MU Mouse unit Đ¢n vá chuát SD Standard devitation Đá lách chu¿n SPE Solid phase extraction ChiÁt pha rÁn CÁm biÁn cáng h°áng SPR Surface plasmon resonance plasmon bà mặt STX Saxitoxin Saxitoxin Kỹ thu¿t khÁo sát SRM Selected reaction monitoring ion cô l¿p TTX Tetrodotoxin Tetrodotoxin Tetrodotoxin và các dÁn TTXs Tetrodotoxin analogues chất Ph°¢ng pháp thā nghiám TCBA Tissue culture bioassay trên mô tÁ bào RSD Relative standard deviation Đá lách chu¿n t°¢ng đãi 6 DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. Cấu trúc hóa hßc TTX. Mát sã dÁn xuất cÿa TTX. Tetrodotoxin ngăn kênh v¿n chuyển natri.
MÁu ãc Nassarius papillosus và Nassarius glans gây ngá đác t¿i V¿n Ninh, Khánh Hòa ngày 11/9/2020. Phá hßng ngo¿i cÿa TTX. SÁc ký đß HPLC-FLD cÿa TTXs chu¿n và. Phá khãi phân giÁi LC-MS/MS cÿa 3 loài (A) Oliva annulata, (B) Oliva lignaria, (C) Oliva hirasei và (D) TTX.
SÁc ký đß LC-MS, mÁu chu¿n TTXs (A) và các mÁu thā F. ThiÁt bá LC-MS/MS t¿i phòng thí nghiám và An toàn thāc ph¿m và môi tr°ßng (Khu vāc miÃn Trung). SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với các thÁ phân mÁnh - 25V, -27V, -29V. SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với các thÁ phân mÁnh - 38V, - 40V, -42V.
Đß thá ch°¢ng trình gradient 1 .SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n theo ch°¢ng trình gradient 1. Đß thá ch°¢ng trình gradient 2. SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n theo ch°¢ng trình gradient 2. SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với tãc đá dòng 0,4 ml/phút.
SÁc ký đß LC-MS/MS cÿa TTXs chu¿n với tãc đá dòng 0,6 ml/phút. Đß thá Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi TTXs. Đß thá Ánh h°áng cÿa thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi TTXs. S¢ đß quy trình xā lý mÁu.
Đß thá sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá TTX. Đß thá sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá 4-epiTTX. Đß thá sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá 4,9-anhydroTTX. 55 8 DANH MĀC CÁC BÀNG BÁng 2.
Sã l°āng và khãi l°āng trung bình cÿa 2 loài ãc bùn thu á vùng biển Khánh Hòa. Nßng đá dãy các dung dách chu¿n. Thông sã điÃu kián tãi °u phân tích TTXs bằng LC-MS/MS. KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi TTX.
KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi 4- epiTTX. KÁt quÁ Ánh h°áng cÿa nßng đá acid acetic đÁn hiáu suất thu hßi 4,9-anhydroTTX. KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi TTX. KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi 4-epiTTX.
KÁt quÁ Ánh h°áng thể tích rāa giÁi đÁn hiáu suất thu hßi 4,9- anhydroTTX. Sā phụ thuác dián tích peak vào nßng đá TTXs. KÁt quÁ khÁo sát khoÁng tuyÁn tính và đ°ßng chu¿n cÿa TTXs. Đá lặp l¿i cÿa ph°¢ng pháp.
Hiáu suất thu hßi cÿa ph°¢ng pháp. KÁt quÁ phân tích 15 mÁu ãc loài N. KÁt quÁ phân tích 20 mÁu ãc loài N. 60 9 DANH MĀC CÁC PHĀ LĀC Phụ lục 1.
SÁc ký đß LC-MS/MS phân tích các mÁu ãc N. SÁc ký đß LC-MS/MS phân tích các mÁu ãc N. papillosus 70 10 Mâ ĐÀU Lý do chßn đÁ tài Đác tã sinh hßc biển ngày càng đ°āc quan tâm trên toàn thÁ giới, mát trong sã đó là Tetrodotoxins (TTXs). Tetrodotoxin là mát chất đác thần kinh m¿nh gây ra nhiÃu tr°ßng hāp ngá đác dÁn đÁn tā vong á ng°ßi nhiÃu n¢i trên thÁ giới.
Viác phát hián nhiÃu loài thÿy hÁi sÁn chāa đác tã TTXs chẳng h¿n nh° cá nóc, b¿ch tuác đãm xanh, so biển, mát sã loài cua biển, ãc biển.đã thu hút sā quan tâm cÿa giới khoa hßc và các nhà quÁn lý và an toàn thāc ph¿m biển. Do đó, ngoài các nghiên cāu và phân bã, thành phần, hàm l°āng, đác tính.cÿa đác tã này á sinh v¿t, các nhà nghiên cāu còn t¿p trung phát triển các ph°¢ng pháp phân tích xác đánh đác tã này, đặc biát là các ph°¢ng pháp thā nghiám sinh hßc và phân tích hóa hßc. à Viát Nam, tÿ 2007 đÁn nay, mßi năm đÃu ghi nh¿n các vụ ngá đác TTXs trong ãc biển xÁy ra chÿ yÁu á các cùng ven biển Thanh Hóa, Ninh Thu¿n, Khánh Hòa.Mặc dù đ°āc rất nhiÃu sā quan tâm nghiên cāu và đác tã TTXs với các ph°¢ng pháp, kỹ thu¿t phân tích khác nhau, nh°ng đÁn nay á Viát Nam ch°a có nhiÃu công bã và và phân tích đác tã này á ãc biển bằng kỹ thu¿t sÁc ký láng khãi phá kép LC-MS/MS. Đây là kỹ thu¿t hián đ¿i với đá nh¿y, đá đặc hiáu và đá chính xác rất cao giúp phát hián chính xác đác tã TTX và các đßng phân cÿa nó, đáp āng đ°āc tiêu chu¿n và sã liáu đác tã TTXs trong sinh v¿t biển so với thÁ giới.
Vì v¿y, viác thāc hián đà tài <Xây dăng quy trình phân tích đßc tã tetrodotoxins trong ãc biển ã Viát Nam bằng LC-MS/MS= là cần thiÁt, có ý nghĩa khoa hßc và thāc tißn. Māc đích nghiên cāu аa ra đ°āc quy trình xác đánh đác tã tetrodotoxins á ãc biển có đá tin c¿y và chính xác cao, phù hāp với điÃu kián trang thiÁt bá t¿i Viát Nam.