Luận văn thạc sĩ cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao 14

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Đặng Thị Kim Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Axit phytic và phytate
• 1.2. Enzyme phân giải phytate (phytase)
• 1.3. Phân loại enzyme phytase
• 1.4. Nguồn phytase
• 1.5. Ứng dụng của phytase
• 1.5.1. Trong chăn nuôi
• 1.5.2. Trong công nghệ thực phẩm
• 1.5.3. Trong công nghiệp giấy
• 1.5.4. Trong cải tạo đất
• 1.5.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate
• 1.6. Các nghiên cứu tách dòng biểu hiện phytase trên thế giới
• 1.7. Các nghiên cứu về enzyme phytase ở Việt Nam
• 1.8. Cấu trúc protein liên quan đến khả năng hồi tính của phytase từ A. niger
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vi sinh vật
• 2.2. Môi trường nuôi cấy
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp Mega-PCR
• 2.3.2. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction
• 2.3.3. Ghép nối plasmid
• 2.3.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E. coli bằng sốc nhiệt
• 2.3.5. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep
• 2.3.6. Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến nạp xung điện
• 2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastoris
• 2.3.8. Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris
• 2.3.9. Phương pháp điện di protein SDS - PAGE
• 2.3.10. Xác định hoạt tính phytase
• 2.3.11. Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200
• 2.3.12. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
• 3.1. Cải biến trình tự gen mã hóa phytase
• 3.1.1. Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt
• 3.1.2. Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCR
• 3.1.3. Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểm
• 3.2. Chuyển gen phyA vào tế bào nấm men Pichia pastoris
• 3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp xung điện
• 3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris
• 3.2.3. Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp
• 3.3. Thu hồi và tinh sạch enzyme phytase tái tổ hợp
• 3.4. Xác định các đặc tính của enzyme phytase tái tổ hợp sau khi cải biến gen
• 3.4.1. Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp
• 3.4.2. Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp
• 3.4.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp
• 3.4.4. Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về enzyme phytase từ Aspergillus niger

Enzyme phytase là một loại enzyme quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng ở động vật. Đặc biệt, enzyme này có khả năng phân giải axit phytic, một dạng phospho dự trữ chủ yếu trong thực vật. Nguồn gốc của enzyme phytase chủ yếu từ nấm mốc Aspergillus niger, loài nấm được biết đến với khả năng sản xuất enzyme này với hiệu suất cao. Việc cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ Aspergillus niger nhằm tăng cường tính bền nhiệt của enzyme là một trong những nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực sinh học thực nghiệm.

1.1. Đặc điểm của enzyme phytase và vai trò trong dinh dưỡng

Enzyme phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành các gốc phospho đơn vô cơ, giúp tăng cường khả năng hấp thu phospho và các khoáng chất khác trong thức ăn chăn nuôi. Điều này không chỉ cải thiện hiệu suất tiêu hóa mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường do lượng phospho thải ra ngoài.

1.2. Nguồn gốc và ứng dụng của enzyme phytase trong nông nghiệp

Enzyme phytase từ Aspergillus niger được ứng dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi và công nghệ thực phẩm. Việc bổ sung enzyme này vào thức ăn chăn nuôi giúp cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng, đồng thời giảm thiểu ô nhiễm phospho trong môi trường.

II. Vấn đề và thách thức trong việc cải biến gen enzyme phytase

Mặc dù enzyme phytase từ Aspergillus niger có nhiều ưu điểm, nhưng nó cũng gặp phải một số thách thức lớn, đặc biệt là về độ bền nhiệt. Trong quá trình chế biến thức ăn chăn nuôi, enzyme này thường bị biến tính do nhiệt độ cao, dẫn đến giảm hiệu quả hoạt động. Do đó, việc cải biến gen để tăng cường tính bền nhiệt của enzyme là rất cần thiết.

2.1. Những hạn chế của enzyme phytase tự nhiên

Enzyme phytase tự nhiên từ Aspergillus niger có nhược điểm là kém bền nhiệt, dễ bị bất hoạt khi tiếp xúc với nhiệt độ cao trong quá trình chế biến thức ăn. Điều này làm giảm hiệu quả sử dụng enzyme trong thực tiễn.

2.2. Tác động của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme

Nhiệt độ cao trong quá trình chế biến thức ăn có thể làm giảm hoạt tính của enzyme phytase, dẫn đến việc giảm khả năng phân giải axit phytic. Việc cải biến gen nhằm tăng cường khả năng hồi tính của enzyme sau khi bị biến tính là một giải pháp khả thi.

III. Phương pháp cải biến gen enzyme phytase hiệu quả

Để cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ Aspergillus niger, các phương pháp hiện đại như Mega-PCR và ghép nối plasmid được áp dụng. Những phương pháp này giúp tạo ra các biến thể enzyme với tính chất cải tiến, đặc biệt là về độ bền nhiệt.

3.1. Phương pháp Mega PCR trong cải biến gen

Mega-PCR là một kỹ thuật mạnh mẽ cho phép tạo ra các đoạn DNA lớn với độ chính xác cao. Kỹ thuật này được sử dụng để tạo ra các đột biến điểm trong gen mã hóa enzyme phytase, nhằm tăng cường tính bền nhiệt của enzyme.

3.2. Ghép nối plasmid và biến nạp vào tế bào

Sau khi tạo ra các biến thể gen, chúng được ghép nối vào plasmid và biến nạp vào tế bào nấm men Pichia pastoris. Phương pháp này giúp sản xuất enzyme phytase tái tổ hợp với các đặc tính cải tiến.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng enzyme phytase tái tổ hợp

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng enzyme phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger có khả năng hồi tính tốt hơn so với enzyme tự nhiên. Kết quả này mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong ngành chăn nuôi và công nghệ thực phẩm.

4.1. Đánh giá hoạt tính của enzyme phytase tái tổ hợp

Các thí nghiệm cho thấy enzyme phytase tái tổ hợp có hoạt tính cao hơn, đặc biệt là trong điều kiện nhiệt độ cao. Điều này chứng tỏ rằng việc cải biến gen đã thành công trong việc tăng cường tính bền nhiệt của enzyme.

4.2. Ứng dụng thực tiễn trong chăn nuôi

Enzyme phytase tái tổ hợp có thể được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi, giúp cải thiện khả năng hấp thu dinh dưỡng và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Điều này không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của enzyme phytase

Việc cải biến gen enzyme phytase từ Aspergillus niger không chỉ giúp tăng cường tính bền nhiệt mà còn mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng. Tương lai của enzyme phytase trong ngành nông nghiệp và thực phẩm hứa hẹn sẽ rất tươi sáng.

5.1. Tương lai của enzyme phytase trong nông nghiệp

Với những cải tiến trong công nghệ sinh học, enzyme phytase có thể được phát triển để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong ngành nông nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi và sản xuất thực phẩm.

5.2. Nghiên cứu và phát triển enzyme mới

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các enzyme phytase mới với tính năng vượt trội, nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng và bảo vệ môi trường trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) chiếm khoảng 65–80% lượng phospho trong các loại ngũ cốc, hạt họ đậu và họ cải, đóng vai trò dự trữ phospho và liên kết với các nguyên tố khoáng như Ca, Mg, Fe, Zn. Tuy nhiên, axit phytic có tính kháng tiêu hóa do liên kết với protein và enzyme trong dịch tiêu hóa động vật, làm giảm khả năng hấp thu khoáng và dinh dưỡng. Enzyme phytase có khả năng thủy phân axit phytic thành phospho vô cơ và các dẫn xuất myo-inositol đơn giản, giúp tăng khả năng hấp thu phospho và khoáng chất, cải thiện tiêu hóa và giảm lượng phospho thải ra môi trường, góp phần bảo vệ môi trường.

Phytase thương phẩm chủ yếu được sản xuất từ gen của nấm mốc Aspergillus niger, có ưu điểm hoạt động tốt ở pH thấp phù hợp với môi trường dạ dày động vật, nhưng nhược điểm là kém bền nhiệt. Trong quá trình ép viên thức ăn chăn nuôi, nhiệt độ gia nhiệt thường đạt 70–80°C, đòi hỏi enzyme phải có tính bền nhiệt cao. Nghiên cứu cải biến gen mã hóa phytase nhằm tăng khả năng hồi tính sau biến tính nhiệt là hướng đi quan trọng để nâng cao hiệu quả ứng dụng enzyme trong chăn nuôi.

Luận văn tập trung cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ A. niger nhằm tăng khả năng hồi tính của enzyme sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao, đồng thời duy trì các đặc tính hoạt tính và pH hoạt động. Nghiên cứu thực hiện trên gen phyA của chủng A. niger CNTP 5131, với mục tiêu tạo enzyme phytase tái tổ hợp bền nhiệt, phù hợp cho sản xuất công nghiệp và ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và chức năng của axit phytic và phytate: Axit phytic là dạng phospho dự trữ chính trong thực vật, liên kết với các khoáng chất và protein, gây ảnh hưởng tiêu cực đến hấp thu dinh dưỡng ở động vật.

• Phân loại enzyme phytase: Phytase được phân thành ba dạng chính theo vị trí nhóm phosphate bị thủy phân đầu tiên (3-phytase, 4-phytase, 5-phytase) và bốn nhóm theo cấu trúc protein (β-Propellar, Protein tyrosine, Purple Phosphatase Acid, Histidine Acid Phosphatase). Phytase từ A. niger thuộc nhóm Histidine Acid Phosphatase, hoạt động tốt ở pH thấp.

• Cấu trúc protein liên quan đến tính bền nhiệt và khả năng hồi tính của phytase: Các liên kết hydro và tương tác ion trong cấu trúc không gian của phytase từ A. fumigatus giúp enzyme có khả năng hồi tính sau biến tính nhiệt, trong khi phytase từ A. niger thiếu các liên kết này nên kém bền nhiệt. Việc thay thế 4 axit amin trong vùng cấu trúc quan trọng có thể cải thiện tính bền nhiệt và hồi tính của enzyme.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Gen mã hóa phytase (phyA) được tách dòng từ chủng nấm mốc Aspergillus niger CNTP 5131, một chủng có tính bền nhiệt tương đối cao trong số các chủng A. niger được khảo sát.

• Phương pháp cải biến gen: Sử dụng kỹ thuật Mega-PCR để tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin (A58E, P65S, Q191R, T271R) trong gen phyA nhằm tăng tính bền nhiệt và khả năng hồi tính của enzyme.

• Vector và hệ thống biểu hiện: Gen phyA cải biến được ghép nối vào vector pPICZαA và chuyển vào tế bào nấm men Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp xung điện để biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp.

• Phân tích và xác định hoạt tính enzyme: Hoạt tính phytase được xác định theo phương pháp thủy phân Na-phytate và đo lượng phospho vô cơ giải phóng bằng phản ứng màu, với đơn vị hoạt tính phytase (IU) tương ứng với lượng enzyme giải phóng 1 μmol phospho trong 1 phút.

• Phân tích cấu trúc protein: Sử dụng SDS-PAGE để xác định trọng lượng phân tử enzyme tái tổ hợp, đồng thời so sánh trình tự gen và xác nhận đột biến bằng phần mềm Bioedit.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2015 tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm, với các bước chính gồm tách dòng gen, tạo đột biến điểm, chuyển gen vào Pichia pastoris, biểu hiện và phân tích enzyme.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân tích đặc tính gen phyA của các chủng A. niger: Trong 12 gen phyA khảo sát, tất cả đều có vị trí axit amin bảo thủ liên quan đến tính bền nhiệt (A58, P65, Q191, T271), dự đoán enzyme phytase từ các chủng này có tính bền nhiệt không cao. Chủng CNTP 5131 (P12) có tính bền nhiệt cao hơn các chủng khác, phù hợp làm nguồn gen cải biến.

2. Tạo đột biến điểm thành công 4 axit amin trong gen phyA-P12: Sử dụng Mega-PCR, 4 đột biến điểm A58E, P65S, Q191R, T271R đã được tạo thành công trong gen phyA-P12, không phát hiện đột biến không mong muốn khác. Trình tự gen cải biến được xác nhận bằng giải trình tự và phần mềm Bioedit.

3. Chuyển gen cải biến vào Pichia pastoris và biểu hiện enzyme: Vector pPICZαA mang gen phyA cải biến được chuyển thành công vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp xung điện. Các thể biến nạp phát triển trên môi trường chứa zeocin và mang gen phyA được xác nhận bằng PCR.

4. Hoạt tính phytase tái tổ hợp: Các thể biến nạp mang gen cải biến biểu hiện enzyme phytase có hoạt tính cao hơn so với chủng gốc. Hoạt tính phytase của thể biến nạp cải biến đạt khoảng 35,95 IU/ml, trong khi chủng Pichia pastoris gốc không mang gen có hoạt tính gần như bằng 0.

Thảo luận kết quả

• Việc thay thế 4 axit amin trong vùng cấu trúc quan trọng của phytase từ A. niger đã cải thiện đáng kể tính bền nhiệt và khả năng hồi tính của enzyme sau biến tính nhiệt, phù hợp với yêu cầu công nghệ ép viên thức ăn chăn nuôi ở nhiệt độ 70–80°C.

• Kết quả phù hợp với các nghiên cứu quốc tế cho thấy các liên kết hydro và tương tác ion trong cấu trúc không gian enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt tính sau biến tính nhiệt.

• Sử dụng hệ thống biểu hiện Pichia pastoris giúp enzyme tái tổ hợp có cấu trúc và hoạt tính gần với enzyme tự nhiên, đồng thời dễ dàng tinh sạch và sản xuất quy mô lớn.

• Dữ liệu hoạt tính enzyme có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hoạt tính phytase giữa chủng gốc và chủng cải biến, cũng như bảng so sánh trình tự gen và vị trí đột biến.

• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển enzyme phytase bền nhiệt, giảm chi phí sản xuất và tăng hiệu quả sử dụng trong ngành chăn nuôi và công nghiệp thức ăn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng enzyme phytase cải biến trong sản xuất thức ăn chăn nuôi: Khuyến nghị các nhà sản xuất thức ăn bổ sung enzyme phytase tái tổ hợp bền nhiệt để tăng hiệu quả hấp thu phospho, giảm chi phí và ô nhiễm môi trường. Thời gian triển khai trong 1-2 năm, chủ thể là các doanh nghiệp sản xuất thức ăn.

2. Phát triển quy trình sản xuất enzyme phytase tái tổ hợp quy mô công nghiệp: Đề xuất đầu tư công nghệ lên men và tinh sạch enzyme trên hệ thống Pichia pastoris, đảm bảo chất lượng và ổn định sản phẩm. Thời gian 2-3 năm, chủ thể là viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

3. Nghiên cứu tiếp tục cải biến gen để nâng cao tính bền nhiệt và hoạt tính enzyme: Khuyến khích các nhóm nghiên cứu sinh học phân tử tiếp tục tối ưu hóa trình tự gen và cấu trúc protein để tạo enzyme có đặc tính ưu việt hơn. Thời gian nghiên cứu 3-5 năm, chủ thể là các trường đại học và viện nghiên cứu.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ cho các đơn vị sản xuất trong nước: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật biểu hiện và tinh sạch enzyme phytase tái tổ hợp, giúp nâng cao năng lực sản xuất trong nước, giảm phụ thuộc nhập khẩu. Thời gian 1-2 năm, chủ thể là viện nghiên cứu và các trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu sinh học phân tử và công nghệ enzyme: Luận văn cung cấp phương pháp cải biến gen và biểu hiện enzyme phytase bền nhiệt, hỗ trợ nghiên cứu phát triển enzyme công nghiệp.

2. Doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: Thông tin về enzyme phytase tái tổ hợp bền nhiệt giúp cải thiện chất lượng sản phẩm, giảm chi phí và ô nhiễm môi trường.

3. Viện nghiên cứu và trường đại học chuyên ngành sinh học, công nghệ sinh học: Tài liệu tham khảo về kỹ thuật Mega-PCR, biểu hiện protein trên Pichia pastoris và phân tích hoạt tính enzyme.

4. Cơ quan quản lý và phát triển công nghệ sinh học: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển enzyme công nghiệp trong nước, thúc đẩy sản xuất enzyme giá thành thấp, chất lượng cao.

Câu hỏi thường gặp

1. Phytase là gì và vai trò của nó trong chăn nuôi?
   Phytase là enzyme thủy phân axit phytic thành phospho vô cơ, giúp tăng khả năng hấp thu phospho và khoáng chất trong thức ăn chăn nuôi, giảm chi phí và ô nhiễm môi trường.

2. Tại sao cần cải biến gen phytase từ Aspergillus niger?
   Phytase từ A. niger có hoạt tính tốt nhưng kém bền nhiệt, không đáp ứng được yêu cầu gia nhiệt trong sản xuất thức ăn. Cải biến gen giúp tăng tính bền nhiệt và khả năng hồi tính của enzyme.

3. Phương pháp Mega-PCR có ưu điểm gì trong cải biến gen?
   Mega-PCR cho phép tạo đột biến điểm chính xác, nhanh chóng và hiệu quả, giúp thay thế các axit amin cụ thể trong gen để cải thiện tính chất enzyme.

4. Tại sao chọn Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện enzyme?
   Pichia pastoris là tế bào nhân thực, có khả năng biểu hiện protein có cấu trúc và hoạt tính gần với enzyme tự nhiên, dễ dàng thao tác và sản xuất quy mô lớn.

5. Hoạt tính phytase được xác định như thế nào?
   Hoạt tính phytase được đo bằng lượng phospho vô cơ giải phóng từ Na-phytate trong điều kiện chuẩn, sử dụng phản ứng màu và đo quang phổ ở bước sóng 700 nm.

Kết luận

• Đã thành công trong việc tạo đột biến điểm 4 axit amin trong gen phyA của A. niger CNTP 5131 nhằm tăng tính bền nhiệt và khả năng hồi tính của enzyme phytase.
• Gen cải biến được chuyển thành công vào tế bào Pichia pastoris X33 và biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp có hoạt tính cao hơn so với chủng gốc.
• Enzyme phytase tái tổ hợp cải biến đáp ứng yêu cầu công nghệ ép viên thức ăn chăn nuôi ở nhiệt độ cao, góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng phospho và bảo vệ môi trường.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển enzyme phytase bền nhiệt, phù hợp sản xuất công nghiệp và ứng dụng trong ngành chăn nuôi tại Việt Nam.
• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu cải biến gen và phát triển quy trình sản xuất enzyme quy mô công nghiệp, đồng thời chuyển giao công nghệ cho các đơn vị sản xuất trong nước.

Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai ứng dụng enzyme phytase cải biến trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, đồng thời mở rộng nghiên cứu cải tiến enzyme để nâng cao hiệu quả kinh tế và môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng phospho dự trữ chủ yếu của thực vật. Axit phytic có thể chiếm 65 – 80% lƣợng phospho trong các loại ngũ cốc, hạt các cây họ đậu và họ cải. Ngoài chức năng dự trữ phospho, axit phytic còn liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khoáng nhƣ Ca, Mg, Fe, Zn. Axit phytic có tính chất kháng tiêu hóa do khả năng liên kết với các protein, enzyme trong dịch tiêu hóa của động vật.

Enzyme phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phospho- hydrolase) có vai trò quan trọng trong chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành những gốc phospho đơn vô cơ và các dẫn xuất đơn giản của myo-inositol. Do vậy, khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase không chỉ có tác dụng làm tăng khả năng hấp thu phospho, các nguyên tố khoáng mà còn cải thiện khả năng tiêu hóa các hợp chất khác, đồng thời làm giảm lƣợng phospho thải ra ngoài, góp phần bảo vệ môi trƣờng. Phytase thƣơng phẩm hiện nay đƣợc sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ nấm mốc Aspergillus niger.

niger có một số ƣu điểm nhƣ hoạt động ở pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với phytate cao, và bền với tác động của pepsin. niger có nhƣợc điểm là kém bền nhiệt. Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thƣờng đƣợc gia nhiệt tới 70-80°C để diệt Salmonella. Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt.

Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thƣờng đƣợc cải biến theo hƣớng thay đổi cấu trúc nội tại. Một số nghiên cứu cấu trúc của phytase bền nhiệt từ A. fumigatus cho thấy liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme. niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả năng hồi tính.

Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn hồi” nhiệt của enzyme. Một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi. Với phytase, đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus đƣợc tách dòng và nghiên K21-Sinh học thực nghiệm 1 Đặng Thị Kim Anh TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ cứu. Trong số đó, phytase từ A.

niger đƣợc tách dòng và biểu hiện trên Pichia pastoris. Giống nhƣ các phytase tự nhiên khác từ A. niger, enzyme thu nhận đƣợc chƣa đảm bảo đƣợc tính bền nhiệt nhƣ mong muốn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao” nhằm cải thiện đặc tính công nghệ của enzyme tái tổ hợp.

Để đạt đƣợc mục tiêu trên, gen mã hóa phytase từ nấm mốc A. niger đƣợc biến đổi bằng Mega-PCR tạo 4 axit amin mới thay thế cho 4 axit amin trong cấu trúc protein nhằm tăng độ bền vững đồng thời duy trì các đặc tính cơ bản về hoạt tính và pH hoạt động của enzyme. K21-Sinh học thực nghiệm 2 Đặng Thị Kim Anh TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1. Axit phytic và phytate Axit phytic lần đầu tiên đƣợc Hartig tìm thấy năm 1855 ở dạng hạt nhỏ trong hạt giống của một số loài thực vật và có kích thƣớc tƣơng đƣơng hạt tinh bột khoai tây.

Khi kiểm tra bằng phƣơng pháp thử iod, Hartig nhận thấy các hạt này không phải là tinh bột và chứa chất dinh dƣỡng dự trữ cho sự nảy mầm của hạt [27, 28]. Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy hạt phytic và khẳng định thành phần hóa học chính của nó là carbon, phospho và các ion kim loại và không phải protein hay lipid. Chúng có tên là „phytin‟ do nguồn gốc từ thực vật và không đƣợc phát hiện thấy ở thịt hay trong các sản phẩm từ sữa. Winterstein, Schulze và Posternak đã chỉ ra rằng thủy phân phytin bằng axit sẽ giải phóng axit phosphoric và inositol [66].

Năm 1914, Anderson đã mô tả cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 – hexakis dihydrogen phosphate, đƣợc gọi là axit phytic [7] (Hình1. Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakisdihydrogen phosphate (axit phytic). Phytate là muối của axit phytic là dạng dự trữ phospho và khoáng chất chủ yếu của thực vật đặc biệt ở ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt có dầu. Chúng chiếm khoảng 75% tổng lƣợng phospho của hạt và thấp hơn ở các bộ phận khác của cây nhƣ rễ, củ, chồi, với hàm lƣợng chỉ khoảng 0.

Trong quá trình nảy mầm của hạt, phytate bị thủy phân tạo phospho vô cơ cùng với khoáng chất nhƣ canxi, magiê là những chất cảm ứng cho quá trình nảy mầm và phát triển của cây con. Điều này giải thích cho vai trò quan trọng của phytate trong quá trình chuyển hóa của thực vật. K21-Sinh học thực nghiệm 3 Đặng Thị Kim Anh TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Với động vật, axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dƣỡng rất mạnh nhờ khả năng liên kết chặt chẽ với các phân tử protein và các nguyên tố kim loại nhƣ Ca2+, Mg2+, Zn2+. Những liên kết này tạo phức hợp không hòa tan trong đƣờng tiêu hóa, dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ khoáng của động vật [17, 47].

Trong số các kim loại, kẽm là nguyên tố vi lƣợng mà hoạt tính sinh học của nó bị ảnh hƣởng lớn nhất bởi axit phytic. Axit phytic bổ sung vào thức ăn có thể làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và giảm trọng lƣợng của chuột [48]. Axit phytic còn tƣơng tác với protein trong dải pH rộng để tạo thành phức hợp phytate-protein. Liên kết giữa protein thực vật với axit phytic làm giảm độ hòa tan, giảm khả năng bị phân cắt của protein và do vậy làm giảm giá trị dinh dƣỡng của chúng.

Hơn nữa, ngoài liên kết với muối khoáng, protein, axit phytic còn tƣơng tác với các enzyme tiêu hoá nhƣ trypsin, pepsin, α-amylase và β-galactosidase, làm giảm hoạt tính của những enzyme này [20, 32, 55]. Enzyme phân giải phytate (phytase) Phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phosphohydrolase) xúc tác phản ứng thủy phân myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate (phytate) thành những gốc phosphate đơn vô cơ và những dẫn xuất đơn giản hơn của myo-inositol phosphate. Ở một số loài nấm, phytase có thể giải phóng myo-inositol tự do. Phân loại enzyme phytase Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại phytase thành ba dạng bao gồm [75]: Dạng 1: EC 3.8 Tên đề xuất: 3-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-3-phosphohydrolase Tên khác: phytase, phytate-1-phosphatase, phytate-3-phosphatase, phytate-6-phosphatase Dạng 2: EC 3.26 Tên đề xuất: 4-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-4-phosphohydrolase K21-Sinh học thực nghiệm 4 Đặng Thị Kim Anh TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ Tên khác: phytase, 6-phytase, phytate-6-phosphatase Dạng 3: EC 3.72 Tên đề xuất: 5-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate-5-phosphohydrolase Tên khác: phytase; phytate-5-phosphatase Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase tấn công.

Enzyme 3-phytase (EC 3.8) tấn công vào nhóm phosphate ở vị trí thứ 3 và 4-phytase (EC 3.26) tấn công đầu tiên vào nhóm phosphate số 4; đây là hai dạng phytase điển hình của vi sinh vật. Enzyme 5-phytase (EC 3.72) tấn công đầu tiên vào nhóm phosphate số 5; đây là dạng điển hình cho phytase từ thực vật. Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase: β-Propellar Phytase (BPPhy), Protein tyrosine phytase (PTPhy), Purple Phosphatase Acid (PAPhy) và Histidine Acid Phosphatase (HAPhy) [67]. Theo tính năng và cấu trúc, ngƣời ta còn chia phytase ra 4 nhóm nhƣ sau: (1) β- Propellar Phytase (BPPhy): hoạt động ở pH kiềm và cần ion Ca2+ cho khả năng xúc tác và bền nhiệt, sản phẩm cuối cùng là myo-inositol triphosphate (IP3); (2) Protein tyrosine phytase (PTPhy): hoạt động ở pH axit, chứa nhóm xúc tác cysteine, sản phẩm cuối cùng là inositol 2-monophosphate; (3) Purple Phosphatase Acid (PAPhy): chứa axit amin có gắn kim loại Fe2+ và Fe3+, Zn2+, Mg2+ hoặc Mn2+ ở trung tâm hoạt động, cơ chế xúc tác của enzyme này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ; (4) Histidine Acid Phosphatase (HAPhy): hoạt động ở pH thấp, chứa trình tự axit amin bảo thủ: RH[GN]xRx[PAS] ở đầu N và HD ở đầu C (Hình 1.

Các nhóm này khác nhau về cấu trúc phân và cơ chế xúc tác cho phép chúng sử dụng axit phytic làm K21-Sinh học thực nghiệm 5 Đặng Thị Kim Anh TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Luận văn thạc sĩ nguồn cơ chất trong các môi trƣờng khác nhau. Trong đó, phytase của Aspergillus niger và Aspergillus fumigatus thuộc nhóm Histidine Acid Phosphatase đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất. Nguồn phytase Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy từ vi sinh vật, thực vật và động vật. Phytase từ vi sinh vật Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thƣờng thấy nhất ở nấm mốc, đặc biệt ở các loài thuộc chi Aspergillus.

Shieh và Ware (1968) đã phân lập và tuyển chọn từ đất hơn 2000 chủng vi sinh vật để sản xuất phytase. Hầu hết các chủng sản sinh phytase nội bào, chỉ có 30 chủng sinh phytase ngoại bào và chúng đều là nấm sợi, trong đó 28 chủng thuộc chi Aspergillus, 1 chủng thuộc chi Penicillum và 1 chủng thuộc Mucor. Trong 28 chủng của chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc về loài A. Những nhóm nghiên cứu khác nhƣ Howson và Davis (1983), Volfova và cs (1994) đã khẳng định rằng A.

niger là loài có khả năng sản sinh phytase ngoại bào tốt nhất [31, 65]. Một số phytase từ một số nấm men khác đã đƣợc phát hiện nhƣ: Pichia anomala [64], Saccharomyces cerevisiae [59]. Phytase cũng đã đƣợc tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp., Bacillus subtilis, Klebsiella sp. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về chi Bacillus và Enterobacter còn phytase từ E.

coli lại là enzyme nội bào. Năm 2005, Cheng và CS đã mô tả cấu trúc phytase dạng β ở loài ƣa lạnh Shewanella oneidensis MR-1 nó có 30% peptide tƣơng đồng với trình tự phytase của Bacillus sp. Đặc biệt, với khả năng hoạt động ở nhiệt độ thấp phytase này có tiềm năng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, khi nhiệt độ thƣờng thấp hơn 30°C [12]. Phytase từ thực vật Phytase đƣợc tìm thấy rộng rãi trong giới thực vật.

Phytase từ phấn hoa lily hoạt động ở pH tối ƣu 8,0 và nhiệt độ tối ƣu 55 C [34].