Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch Xylanase B từ Aspergillus niger DSM 1957

Luận văn nghiên cứu quy trình biểu hiện, tinh sạch enzyme xylanase B tái tổ hợp từ A. niger. Báo cáo chi tiết các tính chất, hoạt độ của enzyme.

• Tác giả: Lưu Ngọc Hưng
• Người hướng dẫn: PGS. Đỗ Thị Tuyên
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase B tái tổ hợp từ chủng Aspergillus niger DSM 1957
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Xylanase tái tổ hợp từ A

Xylanase tái tổ hợp từ chủng Aspergillus niger DSM 1957 là một enzyme thủy phân quan trọng trong công nghệ sinh học hiện đại. Enzyme này được biểu hiện thông qua công nghệ tái tổ hợp DNA, cho phép sản xuất với hiệu suất cao và chất lượng ổn định. Endoxylanase B là một trong những loại xylanase chính có khả năng phân hủy xylan hiệu quả, một thành phần quan trọng của thành tế bào thực vật. Nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp từ A. niger mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghiệp xơ sợi, giấy, thực phẩm và nhiên liệu sinh học. Hệ thống biểu hiện sử dụng nấm men Pichia pastoris GS115 đã chứng minh hiệu quả cao trong sản xuất protein tái tổ hợp với lượng tiết ra vào môi trường nuôi cấy đáng kể.

1.1. Đặc điểm của Xylanase B tái tổ hợp

Xylanase B tái tổ hợp được phân loại thuộc nhóm glycoside hydrolase, có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4 trong chuỗi xylan. Enzyme này có cấu trúc protein đặc biệt cho phép tương tác hiệu quả với cơ chất. Hệ thống biểu hiện trong Pichia pastoris cho phép enzyme được tiết ra ngoài tế bào, thuận lợi cho quá trình tinh sạch và ứng dụng. Enzyme biểu hiện này có độ sạch cao và hoạt tính cụ thể tốt hơn các enzyme tự nhiên.

1.2. Vai trò của A. niger trong sản xuất enzyme

Chủng Aspergillus niger DSM 1957 là một vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase tự nhiên, nhưng khả năng tiết ra enzyme còn hạn chế. Thông qua công nghệ tái tổ hợp, gene xylanase B được chuyển vào hệ thống biểu hiện mạnh mẽ hơn như Pichia pastoris để tăng độ ổn định và hiệu suất sản xuất. Điều này cho phép sản xuất xylanase với hàm lượng protein cao, đáp ứng nhu cầu công nghiệp.

II. Biểu hiện và tinh sạch Xylanase tái tổ hợp

Quá trình biểu hiện xylanase tái tổ hợp trong Pichia pastoris GS115/pXlnB yêu cầu tối ưu hóa nhiều điều kiện nuôi cấy. Điều kiện cơ bản bao gồm nhiệt độ, pH, nồng độ chất cảm ứng methanol và thành phần môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu cho thấy thời gian biểu hiện tối ưu thường là 48-72 giờ sau cảm ứng, trong đó hoạt độ xylanase đạt mức cao nhất. Tinh sạch enzyme được thực hiện qua các phương pháp điện di protein SDS-PAGE và phương pháp xác định hoạt tính bằng khuếch tán trên đĩa thạch. Qua trình này cho phép xác định độ sạch enzyme và hàm lượng protein tái tổ hợp chính xác.

2.1. Điều kiện biểu hiện tối ưu

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng methanol cho thấy nồng độ 0,5-1,0% đạt hoạt tính enzyme cao nhất. Thời gian cảm ứng kéo dài thường cho kết quả tốt hơn, với biểu hiện tăng dần theo thời gian. pH môi trường nuôi cấy được duy trì ở khoảng 5,5-6,5 để đảm bảo biểu hiện tối ưu. Đệm phosphate là lựa chọn phù hợp cho quá trình cảm ứng biểu hiện enzyme.

2.2. Phương pháp tinh sạch và đánh giá độ sạch

Tinh sạch xylanase tái tổ hợp sử dụng kết hợp nhiều phương pháp: sắc ký lọc gel, điện di SDS-PAGE và sắc ký trao đổi ion. Xác định hàm lượng protein thực hiện theo phương pháp Bradford với đường chuẩn xylose. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch cho phép xác định hoạt tính enzyme định tính và định lượng hoạt độ enzyme bằng phương pháp DNS.

III. Tính chất của Xylanase tái tổ hợp

Tính chất hoàn hảo của xylanase tái tổ hợp từ A. niger phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường. Nhiệt độ thích hợp là khoảng 50-60°C, nơi enzyme đạt hoạt tính tối đa. Enzyme duy trì độ bền nhiệt độ tốt ở các nhiệt độ từ 40-50°C, nhưng hoạt tính giảm đáng kể ở trên 70°C. pH tối ưu của enzyme nằm trong khoảng 4,5-6,0, phù hợp với các ứng dụng công nghiệp. Enzyme có khả năng chịu đựng dung môi hữu cơ như ethanol và acetone ở nồng độ thấp. Các chất tẩy rửa có thể ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, yêu cầu cân nhắc kỹ trong các ứng dụng liên quan.

3.1. Nhiệt độ và độ bền nhiệt

Hoạt tính xylanase đạt cực đại ở 55°C trong điều kiện thí nghiệm. Độ bền nhiệt độ được đánh giá qua khả năng duy trì hoạt tính sau gia nhiệt tại các nhiệt độ khác nhau. Enzyme giữ trên 80% hoạt tính khi gia nhiệt ở 45°C trong 60 phút, nhưng giảm nhanh ở 65°C trở lên. Đặc tính này phù hợp với các ứng dụng xử lý giấy và ngành công nghiệp sợi.

3.2. pH và chất tẩy rửa ảnh hưởng

pH tối ưu của xylanase tái tổ hợp là 5,5, với hoạt tính giảm khi pH lệch khỏi khoảng này. Enzyme duy trì hoạt tính tốt ở pH 5,0-6,5. Các chất tẩy rửa như SDS, Triton X-100 ở nồng độ 0,1% gây ảnh hưởng nhỏ đến hoạt tính. Dung môi hữu cơ như ethanol 10-20% không ảnh hưởng lớn, cho phép sử dụng enzyme trong các phản ứng hỗn hợp.

IV. Ứng dụng và triển vọng của Xylanase tái tổ hợp

Xylanase tái tổ hợp từ A. niger có nhiều ứng dụng thực tiễn trong công nghiệp hiện đại. Trong ngành giấy, enzyme được sử dụng để tẩy trắng bột giấy và cải thiện tính chất sợi, giảm lượng hóa chất cần thiết. Trong công nghiệp thực phẩm, enzyme hỗ trợ xử lý bánh mỳ, bia và nước trái cây bằng cách cải thiện kết cấu và khả năng chiết xuất. Nhiên liệu sinh học là lĩnh vực đầy hứa hẹn, nơi xylanase tham gia vào quá trình chuyển hóa sinh khối thành năng lượng có thể tái tạo. Công nghệ xylanase tái tổ hợp có chi phí sản xuất thấp hơn, dễ kiểm soát chất lượng, mở ra triển vọng ứng dụng rộng rãi hơn so với enzyme tự nhiên.

4.1. Ứng dụng công nghiệp chính

Ngành sản xuất giấy là ứng dụng chính của xylanase tái tổ hợp, giúp giảm lượng hóa chất tẩy trắng và năng lượng xử lý. Công nghiệp thực phẩm sử dụng enzyme để cải thiện tính chất bánh mỳ, tăng khả năng hấp thụ nước và độ bền tươi. Xử lý nước trái cây sử dụng xylanase để cải thiện độ trong suốt và hàm lượng chất dinh dưỡng chiết xuất được.

4.2. Triển vọng phát triển tương lai

Công nghệ biorefineries sử dụng xylanase tái tổ hợp để chuyển hóa sinh khối thành nhiều sản phẩm giá trị cao. Kỹ thuật cải thiện gene có thể nâng cao hoạt tính enzyme và độ bền trong điều kiện công nghiệp khắc nghiệt hơn. Sản xuất enzyme tái tổ hợp với chi phí cạnh tranh sẽ mở rộng ứng dụng sang các ngành khác như xử lý nước thải và sản xuất hóa chất công nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan xylanase 1. Sự thủy phân xylan, vai trò của xylanase Xylan là loại hemicellulose (những polysaccharide bao gồm xyloglucan, xylan, mannan và glucomannan, và β-(1,4)-glucan[60]) phổ biến nhất trong tự nhiên và là polyme sinh học phổ biến thứ hai, đứng sau cellulose [70]. Xylan bao hàm các đơn phân là xylose (một loại đường pentose), cụ thể là các loại β-D-xylose.

Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác. Xylan hiện diện với số lượng lớn trong gỗ cứng từ thực vật hạt kín (hàm lượng tế bào 15-30% thành tế bào) và gỗ mềm từ cây hạt trần (7-10%)[69]. Xylan có thể được phân loại thành bốn nhóm chính [11]: - Arabinoxylan, arabinoxylan là thành phần quan trọng của chất xơ trong ngũ cốc. Arabinoxylan thường được phân loại thành arabinoxylan có thể chiết xuất được trong nước và arabinoxylan không thể chiết xuất được trong nước.

Trong đó, arabinoxylan có thể chiết xuất được trong nước liên kết lỏng lẻo với bề mặt thành tế bào. Ngược lại, arabinoxylan không thể chiết xuất được trong nước được giữ lại trong thành tế bào bởi các tương tác cộng hóa trị và không cộng hóa trị của arabinoxylan và protein, lignin và cellulose. - Glucuronoxylan, là chuỗi xylan có thêm nhánh trong đó axit α-D- glucoronic hoặc dẫn xuất 4-O-metyl ete của nó là nhóm thế duy nhất. - Glucuronoarabinoxylan là chuỗi xylan có nhánh gồm cả hai nhóm axit α-D- glucoronic (4-O-methyl-α-D-glucoronic) và α-l-arabinose.

- Galactoglucuronoarabinoxylan là loại xylan đặc trưng bởi sự hiện diện của gốc β-D-galactopyranosyl tận cùng bên trên chuỗi bên oligosaccharide phức tạp của xylan và thường được tìm thấy trong các cây lâu năm. Xylan là một nhân tố kháng dinh dưỡng đối với động vật một dạ dày (ví dụ người). Nó làm tăng độ nhớt của thức ăn, cản trở quá trình tiêu hóa các thành phần khác và làm giảm mức độ hấp thu dinh dưỡng. Người ta đã xử lý các thức ăn 3 cho vật nuôi bằng enzyme xylanase để thủy phân xylan, giúp cho thức ăn dễ tiêu hóa hơn [70].1 Cấu trúc xylan trong gỗ mềm (A) gỗ cứng (B) [9] Một số phương pháp sử dụng phổ biến hiện nay để thủy phân hoàn toàn xylan là dùng kiềm hoặc axit mạnh do hiệu quả thủy phân tốt và kinh tế nhưng gây chất thải ảnh hưởng tới môi trường.

Việc sử dụng enzyme để thủy phân sinh học xylan hạn chế các vấn đề về môi trường nhưng các enzyme hiện nay chưa có hoạt tính thủy phân nhanh, hiệu quả. Nhóm enzyme thủy phân xylan gồm endoxylanase (endo-1,4-β-xylanase, EC3.8), β-xylosidase (xylan-1,4-β-xylosidase, EC 3.37), α-glucuronidase (α-glucosiduronase, EC3.139), α-arabinofuranosidase (α-Larabinofuranosidase, EC 3.55) và acetylxylan esterase (EC3. Tất cả các enzyme này đều hoạt động nhằm cắt xylan thành các đường đơn phân. Trong số các enzyme này, xylanase là enzyme quan trọng nhất, liên quan trực tiếp đến việc cắt các liên kết glycoside và giải phóng các xylooligosaccharide ngắn.

Các enzyme khác nhau tham gia thủy phân xylan [48] 1. Giới thiệu endoxylanase Endoxylanase có mã số EC 3.8 (Theo IUBMB)[56] với tên hệ thống là 4- β-D-xylan xylanohydrolase. Ngoài ra enzyme có một số tên gọi khác như endo-β- 1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo- 1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β-xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β- D- xylanase [56]. Phân loại: Do đặc tính không đồng nhất và phức tạp của xylan dẫn đến các enzyme thủy phân xylan cũng rất đa dạng, phong phú, điển hình với sự đa dạng thành phần đặc trưng, trình tự sơ cấp, cấu trúc khác nhau dẫn đến việc phân loại enzyme bị hạn chế nếu chỉ dựa vào tính đặc hiệu cơ chất.

Hiện có nhiều cách phân loại xylanase trên thế giới. Wong và cộng sự (1988) phân loại xylanase trên cơ sở các đặc tính hóa lý và đề xuất hai nhóm: nhóm có khối lượng phân tử thấp (< 30 kDa) và pI cơ bản, và nhóm có khối lượng phân tử cao (> 30 kDa) và pI có tính axit [71]. Tuy nhiên, một số ngoại lệ đối với cách phân loại này đã được tìm thấy và khoảng 30% xylanase hiện tại, đặc biệt là xylanase từ nấm, không thể phân loại bằng cách này [25]. Một hệ thống phân loại mới ra đời dựa trên sự khác biệt cấu trúc cơ bản của các chất xúc tác và các nhóm enzyme trong các họ của các phân tử 5 liên quan cho phép phân loại không chỉ nhóm xylanase nói riêng, mà là nhóm enzyme glycosidease nói chung (EC 3.

Nhóm phân loại ban đầu đã nhóm các cellulase và xylanase thành 6 họ (A – F) [44], đến năm 2005 nhóm enzyme đã được phân thành 96 họ glycoside hydrolase [25]. Trong hệ thống phân loại này, xylanase thường nằm trong họ GH10 (trước đây là F) và họ GH11 (trước đây là G) [62-64]. Tuy nhiên trong họ 5, 7, 8, 10, 11 và 43 cũng chứa các miền xúc tác với endo-1,4-β. Do đó, quan điểm hiện tại cho rằng các enzyme có hoạt tính xylanase chỉ giới hạn ở các họ 10 và 11 là không hoàn toàn đúng và nên được mở rộng sang các họ 5, 7, 8 và 43 [25].

Họ GH5 (trước đây là họ A) bao gồm nhiều enzyme có hoạt tính khác nhau được chứng minh có hoạt tính trên các cơ chất khác nhau và có các hoạt tính endoglycosyl-ceramidase (EC 3.25), glucan 1,3-bglucosidase (EC 3.58), glucan endo-1,6-b-glucosidase (EC 3.75), mannan endo-1,4-b-mannosidase (EC 3.58), cellulose 1,4-b-cellobiosidase (EC 3.91), endo-1,6-b-galactanase (EC 3.-) and endo-1,4-b-xylanase (EC 3. Họ GH8 (trước đây là họ D) chủ yếu bao gồm cellulase (EC 3.4), nhưng cũng chứa chitosanase (EC 3.73) và endo-1,4-β- xylanase (EC 3. Năm 2024, họ này bao gồm 61 thành viên, trong đó có bốn xylanase. Ba trong số các xylanase đã được phân lập từ Bacillus sp.

trong khi loại thứ tư là một vi khuẩn được phân lập từ vi khuẩn Nam Cực P. Họ GH10 bao gồm endo-1,4-b-xylanase (EC 3.8), endo-1,3-β-xylanase (EC 3.32) và cellobiohydrolase (EC 3. Các enzyme chính của họ này là endo-1,4-β-xylanase, tuy nhiên, những enzyme này không hoàn toàn chỉ có hoạt tính trên xylan mà còn có thể hoạt động trên cơ chất cellulose có khối lượng phân tử thấp, đặc biệt trên arylcellobioside và một số cellooligosaccharide. Các thành viên của họ này cũng có khả năng thủy phân aryl β-glycoside của xylobiose và xylotriose ở liên kết aglyconic, thường có khối lượng phân tử cao, pI(độ đẳng điện) thấp [25].

6 Họ GH11 là một họ đơn chỉ gồm endoxylanase và chỉ hoạt động duy nhất trên các chất nền có chứa D-xylose. Giống như họ GH10, những enzyme này có thể thủy phân aryl β-glycoside của xylobiose và xylotriose ở liên kết aglyconic, nhưng ngược lại với họ này, chúng không hoạt động trên aryl cellobioside [19]. Các enzyme thuộc họ GH11 thường được đặc trưng bởi pI cao, khối lượng phân tử thấp, cơ chế xúc tác chuyển vị kép [34]. Sự khác biệt về đặc tính xúc tác là endo-xylanase của họ 10 có khả năng thủy phân các liên kết glycoside cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó.

Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế [19]. Đối với họ GH7 và họ GH43 cho đến nay mới xác định một enzyme thể hiện hoạt tính xylanase đối với mỗi họ, do đó tầm quan trọng của chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng. Họ endoglucanase I (EGI) GH7 từ T. reesei không được tạo ra trong quá trình sinh trưởng trên xylan [18]và trong khi hoạt tính của nó trên cellulose cao gấp 10 lần so với trên xylo-oligosaccharide (X3, X5) [17].

Enzyme họ GH43 có khối lượng phân tử 64 kDa và được phát hiện trong Paenibacillus polymyxa. Vì vậy, nhóm enzyme này cần có những nghiên cứu sâu hơn về chức năng và các đặc tính hóa lý. Cơ chế xúc tác của xylanase Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase. Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa qua hình 1.

a) Xylanase nhận diện và liên kết xylan bằng cách thay đổi cấu hình ở phần cánh trái (cuộn xoắn lại 3 lần); cơ chất xylan hình xoắn ốc được đặt ở vị trí đối diện với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 (a); [45] 7 Hình 1.3 Mô hình hoạt động của xylanase[45] a) Hai gốc glutamat (Glu) có vị trí hoạt động khoảng 5,5 Å. Glu 172 là chất xúc tác acid/base, Glu 78 là chất cho điện tử [45]; b) Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác (Glu 78), liên kết glycoside bị kéo căng và bẻ gãy tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị enzyme – cơ chất (b) [45]; c) Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, nó tách thànhion dương gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi ion âm gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo theo cơ chế thủy phân glycosyl, sản phẩm được giải phóng[51]; d) Enzym dịch chuyển đến vị trí tiếp theo trên cơ chất nhờ sự phân tách và phân tán các đường (xylose) [45]. Sinh tổng hợp xylanase Xylanase được tách chiết trong tự nhiên chủ yếu từ các chủng vi khuẩn, nấm như Trichoderma, Bacillus, Aspergillus, Streptomyces, Fusarium, Thermomyces … [14, 39, 71] được công bố là có khả năng sản xuất xylanase. Xylanase sinh tổng hợp từ các chủng vi sinh vật tự nhiên thường có lẫn nhiều tạp protein khác nhau.

Vì vậy đã có rất nhiều nghiên cứu về phương pháp tinh sạch xylanase tự nhiên để đạt độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi enzym cao nhất [3,6] Bảng 1.1 Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [63] Vi sinh vật Hoạt tính enzyme xylanase (IU/ml) Nấm mốc Aspergillus awamori VTT-D-75028 12,00 Aspergillus niger KKS 138 Aspergillus niger 250 Fusarium oxysporum VTT-D-80134 3,70 Phanerochate chrysosporium 15-20 Piromyces sp. strain E2 7,96 Thermomyces lanuginosus 650-780 Trichoderma reesei 960 Vi khuẩn Bacillus SSP-34 506 Bacillus circulans 400 Bacillus stearothermophilus T6 2,33 Bacillus sp. strain NCL 87-6-10 93 Bacillus circulans AB 16 19,28 Streptomyces sp. QG-11-3 96 Thermoactinomycesthalophilussub 42 Enzyme sử dụng trong công nghiệp thường kèm theo các yêu cầu với các đặc tính cụ thể như độ ổn định cao trong phạm vi nhiệt độ và pH rộng, độ đặc hiệu cơ chất cao và khả năng kháng mạnh đối với các cation kim loại và hóa chất [36, 58].

Enzyme nội sinh thường được sản xuất với số lượng thấp và cũng thiếu tất cả các đặc tính để đáp ứng nhu cầu công nghiệp [9]. Do đó, các phương pháp khác nhau đã 9 được sử dụng để cải thiện năng suất và chất lượng của các enzyme mong muốn. Những phương pháp được sử dụng rộng rãi là phương pháp dựa trên kỹ thuật di truyền, tạo các đột biến làm tăng hoạt tính enzyme hoặc sản xuất enzyme bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. Công nghệ DNA tái tổ hợp có thể sản xuất cá enzyme có hoạt tính tương đương với các enzyme tự nhiên nhưng có năng suất cao.