Đánh giá biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue

Luận văn thạc sĩ phân tích mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue và mối liên quan với các chỉ số lâm sàng.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Dịu
• Người hướng dẫn: Hoàng Văn Tổng
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Đánh giá mức độ biểu hiện của RNA dài không mã hóa EPB41L4A-AS1 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về lncRNA EPB41L4A AS1 và sốt Dengue

lncRNA EPB41L4A-AS1 là một RNA dài không mã hóa có vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch và quá trình viêm nhiễm. Nghiên cứu gần đây tại Đại học Quốc gia Hà Nội đã chứng minh mối liên hệ đặc biệt giữa biểu hiện EPB41L4A-AS1 và bệnh sốt xuất huyết Dengue. Virus Dengue là mối đe dọa sức khỏe công cộng ở Đông Nam Á, gây ra các biến chứng nặng nề. Việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của lncRNA EPB41L4A-AS1 trong bệnh nhân sốt Dengue mở ra hướng mới cho chẩn đoán sớm và dự đoán mức độ nặng của bệnh. Các nghiên cứu cho thấy mức độ biểu hiện của lncRNA có thể liên quan trực tiếp đến phản ứng miễn dịch của cơ thể. Điều này làm tăng tính cấp thiết của việc tìm hiểu sâu về RNA không mã hóa trong bối cảnh bệnh truyền nhiễm.

1.1. Đặc điểm của lncRNA EPB41L4A AS1

EPB41L4A-AS1 là một lncRNA với cấu trúc phức tạp, được phát hiện thông qua phương pháp real-time PCR định lượng tuyệt đối. Phân tích cấu trúc vector pJET-EPB41L4A-AS1 cho thấy đặc điểm riêng biệt của này. RNA dài không mã hóa này tham gia vào các quá trình điều hòa gen kích thích bởi interferon. Biểu hiện của nó có thể được đo lường chính xác thông qua các kỹ thuật phân tích tiên tiến.

1.2. Sốt Dengue và các biến chứng lâm sàng

Sốt xuất huyết Dengue được phân loại thành nhiều mức độ từ DF (sốt Dengue), DWS (sốt có dấu hiệu cảnh báo) đến SD (sốt nặng). Các chỉ số huyết học như giảm tiểu cầu, tăng enzym gan ALT và AST là dấu hiệu lâm sàng quan trọng. Việc phát hiện sớm mức độ biểu hiện lncRNA có thể giúp dự báo tiến triển bệnh một cách chính xác hơn.

II. Cơ chế biểu hiện của EPB41L4A AS1 ở bệnh nhân sốt Dengue

Biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1 ở bệnh nhân sốt Dengue được điều khiển bởi phản ứng miễn dịch của cơ thể đối với virus Dengue. Khi nhiễm DENV, hệ thống miễn dịch sản xuất interferon và các gen kích thích bởi interferon, từ đó ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của các lncRNA. Phân tích định lượng thông qua phương pháp RT-PCR cho thấy sự thay đổi đáng kể trong biểu hiện EPB41L4A-AS1 giữa các nhóm bệnh nhân. Đường cong ROC từ các nghiên cứu chứng minh rằng lncRNA này có khả năng phân biệt giữa sốt Dengue không nặng và nặng với độ chính xác cao. Những thay đổi trong mức độ biểu hiện này phản ánh mức độ hoạt động của hệ thống miễn dịch và quá trình viêm nhiễm trong cơ thể.

2.1. Vai trò của hệ thống miễn dịch interferon

Interferon đóng vai trò chủ chốt trong phản ứng chống virus Dengue. Gen kích thích bởi interferon (ISG) được kích hoạt mạnh mẽ, từ đó điều chỉnh biểu hiện lncRNA EPB41L4A-AS1. Sự liên quan giữa mức độ biểu hiện lncRNA và mức độ interferon được xác định thông qua các phân tích thống kê. Kháng thể lớp M (IgM) xuất hiện sớm, cho thấy phản ứng miễn dịch ban đầu mạnh mẽ, liên quan đến biểu hiện lncRNA tăng cao.

2.2. Liên quan giữa biểu hiện lncRNA và chỉ số lâm sàng

Nghiên cứu cho thấy mối liên quan đáng kể giữa mức độ biểu hiện EPB41L4A-AS1 với chỉ số huyết học như giảm tiểu cầu và chức năng gan. Enzym ALT và AST tăng cao tương ứng với biểu hiện lncRNA ở mức độ cao. Phân tích hệ số tương quan Spearman và Mann-Whitney U test xác nhận những mối liên hệ này có ý nghĩa thống kê.

III. Phương pháp xác định mức độ biểu hiện lncRNA EPB41L4A AS1

Phương pháp RT-PCR định lượng tuyệt đối là kỹ thuật chính để xác định mức độ biểu hiện của lncRNA EPB41L4A-AS1. Quá trình thực hiện bao gồm chuẩn bị cDNA từ mẫu bệnh nhân sốt Dengue, thiết lập đường chuẩn với số bản copies xác định, và phân tích khoảng định lượng chính xác. Vector pJET-EPB41L4A-AS1 được sử dụng để tạo các mẫu chuẩn, sau đó kiểm tra bằng điện di để xác minh. Real-time PCR cho phép theo dõi sự tích tụ sản phẩm PCR qua từng chu kỳ, tính toán chu kỳ ngưỡng để xác định số lượng lncRNA trong mẫu. Phân tích đường cong ROC từ dữ liệu thu được giúp đánh giá khả năng phân biệt bệnh tình.

3.1. Chuẩn bị mẫu và thiết lập đường chuẩn

Mẫu từ bệnh nhân sốt Dengue được thu thập tại bệnh viện, RNA được chiết xuất và chuyển đổi thành cDNA. Vector pJET-EPB41L4A-AS1 được nhân lên trong vi khuẩn, sau đó cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra. Đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ khác nhau, từ đó tính toán tương quan giữa chu kỳ ngưỡng và số bản copies.

3.2. Thực hiện real time PCR và phân tích kết quả

Real-time PCR được thực hiện với khoảng định lượng được xác định trước, đảm bảo tính chính xác. Kết quả định lượng tuyệt đối cho phép so sánh mức độ biểu hiện lncRNA giữa các nhóm bệnh nhân. Phân tích đường cong ROC từ kết quả PCR đánh giá giá trị chẩn đoán của EPB41L4A-AS1.

IV. Ứng dụng lâm sàng và triển vọng của lncRNA EPB41L4A AS1

lncRNA EPB41L4A-AS1 có tiềm năng trở thành sinh chỉ thị mới cho chẩn đoán sốt Dengue và dự báo mức độ nặng bệnh. Khả năng phân biệt giữa sốt Dengue không nặng (DF) và sốt Dengue nặng (SD) thông qua phân tích đường cong ROC cho thấy giá trị lâm sàng cao. Mức độ biểu hiện EPB41L4A-AS1 có thể được sử dụng kết hợp với các chỉ số huyết học và xét nghiệm chức năng gan để tạo hệ thống dự báo mức độ nặng toàn diện. Việc áp dụng real-time PCR định lượng vào thực tiễn lâm sàng tại các bệnh viện sẽ giúp bác sỹ can thiệp sớm, giảm tỷ lệ biến chứng. Nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào xác định các lncRNA khác liên quan, tìm hiểu cơ chế tương tác với virus Dengue, và phát triển test nhanh dựa trên biểu hiện lncRNA.

4.1. Giá trị chẩn đoán và dự báo của lncRNA EPB41L4A AS1

Phân tích đường cong ROC cho thấy lncRNA EPB41L4A-AS1 có diện tích dưới đường cong (AUC) cao trong việc phân biệt DF và DWS, cũng như DWS và SD. Mức độ biểu hiện này có thể hỗ trợ bác sỹ xác định nhóm bệnh nhân nguy cơ cao cần theo dõi chặt chẽ hơn. Kết hợp với các sinh chỉ thị truyền thống, EPB41L4A-AS1 cải thiện độ chính xác dự báo.

4.2. Triển vọng phát triển test chẩn đoán mới

Nghiên cứu này mở đường cho phát triển test chẩn đoán nhanh dựa trên phát hiện lncRNA. Phương pháp định lượng lncRNA có thể được đơn giản hóa để áp dụng tại các phòng khám cơ sở. Giáo dục y tế cần tập trung vào nâng cao nhận thức về vai trò của RNA không mã hóa trong bệnh truyền nhiễm. Tương lai sẽ có những công nghệ sinh phân tử mới giúp phát hiện mức độ biểu hiện lncRNA nhanh chóng, chính xác.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về sốt Dengue 1. Dịch tễ học của bệnh sốt Dengue 1. Tình hình mắc sốt Dengue trên thế giới Theo báo cáo của WHO, sốt Dengue hiện đang lưu hành ở 129 quốc gia; có 3,6 tỷ người sống trong các khu vực có nguy cơ truyền bệnh, ước tính có khoảng 390 triệu người mắc bệnh mỗi năm và 96 triệu trường hợp có triệu chứng lâm sàng.

Số ca mắc sốt Dengue đã tăng lên mạnh mẽ từ năm 1990 đến 2019, giữa ba thập kỷ đô thị hóa, khí hậu ấm lên và nhu cầu du lịch trên toàn thế giới ngày càng gia tăng [88]. Trong những năm này, tỷ lệ mắc sốt Dengue đã tăng từ 505.430 ca lên hơn 2,4 triệu ca với số ca tử vong tăng từ 28.152 người lên 36. Số ca bệnh giảm nhẹ trong giai đoạn 2020-2022 do đại dịch COVID-19. Tuy nhiên, trong năm 2023, số ca sốt Dengue đã tăng đột biến trên toàn cầu, đặc trưng bởi sự gia tăng đáng kể về số lượng, quy mô và sự xuất hiện đồng thời của nhiều đợt bùng phát, lan sang các khu vực trước đây không bị sốt Dengue ảnh hưởng, dẫn đến mức cao kỷ lục là hơn 6,5 triệu ca và hơn 7300 ca tử vong [51].

Theo báo cáo của Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh Châu Âu, kể từ đầu năm 2024, trên toàn thế giới đã có hơn 12 triệu ca mắc và hơn 8000 ca tử vong liên quan đến sốt Dengue đã được báo cáo [14]. Hiện nay, sốt Dengue lưu hành ở hầu hết các khu vực đông dân cư nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới, trong đó chủ yếu là ở khu vực Đông Nam Á, châu Mỹ và Tây Thái Bình Dương và ít phổ biến hơn ở châu Phi và Đông Địa Trung Hải. Khu vực châu Đại Dương là khu vực có tỷ lệ mắc bệnh sốt Dengue chuẩn hóa theo độ tuổi trên 100.000 dân cao nhất tiếp theo là khu vực Nam và Đông Nam Á. Sốt Dengue đã gây ra gánh nặng kinh tế và bệnh tật to lớn ở các quốc gia lưu hành bệnh, trong đó khoảng 70% gánh nặng bệnh sốt Dengue toàn cầu xảy ra ở khu vực châu Á [76].

Ở châu Á, khu vực Đông Nam Á là được coi là tâm dịch sốt Dengue toàn cầu với số ca mắc tăng 46% từ năm 2015 đến năm 2019, trong đó Indonesia, Myanmar và Thái Lan là một trong những quốc gia có tỷ lệ dịch bệnh cao nhất trên thế giới, đóng góp hơn một nửa gánh nặng sốt Dengue toàn cầu (Hình 1) [82]. Ước tính trong khu vực có khoảng 2,9 triệu ca mắc và 5906 ca tử vong sốt Dengue xảy ra mỗi năm với tỷ lệ mắc 3 chuẩn hóa theo độ tuổi là 1153,57/100.000 người, và gánh nặng kinh tế hàng năm lên tới 950 triệu đô-la Mỹ [70]. Tình hình mắc sốt Dengue ở Đông Nam Á [82] 1. Tình hình mắc sốt Dengue ở Việt Nam Việt Nam là một trong những quốc gia chịu hậu quả nặng nề của bệnh sốt Dengue.

Theo thống kê của WHO, tại Việt Nam, số ca mắc sốt Dengue đã tăng từ 105. Ước tính có khoảng hai triệu ca mắc bệnh hàng năm, mặc dù trung bình chỉ có 95.000 trường hợp được báo cáo hàng năm cho Bộ Y tế trong giai đoạn 2002 đến 2020. Tuy nhiên, số ca mắc sốt Dengue trên thực tế cao hơn do việc giám sát sốt Dengue ở Việt Nam khá thụ động, chủ yếu dựa vào các trường hợp lâm sàng do bệnh nhân đến khám bệnh báo cáo; trong khi đó, có tới 80% trường hợp bệnh nhân không có triệu chứng hoặc triệu chứng nhẹ và có thể sẽ không đi khám. Tác động kinh tế của sốt Dengue ở Việt Nam ước tính khoảng 30 đến 95 triệu đô-la Mỹ mỗi năm [13].

Ở Việt Nam, sốt Dengue được đặc trưng bởi tính thời vụ mạnh mẽ và sự thay đổi đáng kể giữa các năm và khu vực địa lý. Bệnh xuất hiện với các mức độ khác nhau ở các vùng khác nhau của đất nước và có xu hướng bùng phát mạnh mẽ và phổ biến hơn ở các tỉnh phía Nam, với tỷ lệ mắc bệnh thường cao nhất vào khoảng tháng 6 đến tháng 10 [34]. Ở miền Bắc, nơi có nhiệt độ thấp hơn so với cả nước, hầu hết các tỉnh đều có ít hoặc không có ca mắc. Tuy nhiên, dịch lưu hành theo mùa đã được quan sát thấy ở Hà Nội từ sau năm 1997 với các vụ dịch quy mô lớn theo chu kỳ 3–5 năm, trung bình mỗi năm có khoảng 8.700 ca sốt Dengue trong hơn 10 năm qua [13, 73].

Sự mở rộng lây 4 nhiễm DENV như vậy được coi là có liên quan đến điều kiện môi trường và khả năng di chuyển của con người theo sự phát triển xã hội. Trong 10 năm trở lại đây, sốt Dengue xảy ra hàng năm ở hầu hết các tỉnh thành trong nước, không còn tuân thủ theo quy luật 4 - 5 năm như trước đây [1]. Từ năm 2012 đến 2017, số ca mắc và tử vong do sốt Dengue trên cả nước thấp nhất trong năm 2014 với 3148 ca mắc, 20 ca tử vong sau đó liên tục tăng trong 5 năm gần đây. Năm 2019, dịch sốt Dengue bùng phát, gia tăng mạnh tại một số tỉnh, thành phố trên cả nước với 335.056 ca mắc sốt Dengue, trong đó có 55 ca tử vong được ghi nhận.

Năm 2022, Việt Nam ghi nhận số ca mắc tăng gấp 5 lần, số ca tử vong gấp 5.3 lần so với năm 2021. Trong khi đó, năm 2023 đã ghi nhận số ca mắc cao bất thường lên tới 172.000 trường hợp. Tuy không có phương pháp điều trị đặc hiệu cho bệnh sốt Dengue, nhưng việc phát hiện sớm và tiếp cận với dịch vụ chăm sóc y tế thích hợp sẽ làm giảm tỷ lệ tử vong xuống dưới 1%. Virus Dengue Nhiễm virus Dengue (DENV) là nguyên nhân chính gây ra bệnh sốt Dengue, các vectơ chính truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti và Aedes Albopictus [43, 73].

Phân loại virus Dengue DENV được phân loại thành 4 týp huyết thanh DENV-1, DENV-2, DENV-3 và DENV-4 dựa trên các đặc điểm di truyền và kháng nguyên với sự khác biệt về nucleotide giữa các nhóm là khoảng 30%. Mỗi nhóm huyết thanh lại được chia nhỏ hơn về mặt di truyền thành các kiểu gen (Hình 2) [30]. Các kiểu gen khác nhau thể hiện khả năng thích ứng khác nhau, đi kèm với những biến đổi di truyền và làm tăng khả năng lây lan của DENV ở các vùng địa lý khác nhau. Trong số bốn huyết thanh nhóm, DENV-1 và DENV-2 là những loại phổ biến nhất liên quan đến các đợt dịch bùng phát trước đây, trong đó DENV-2 gây ra nhiễm trùng thứ phát nghiêm trọng hơn so với các huyết thanh nhóm khác [89].

5 Hình 2: Các kiểu gen virus Dengue [30] 1. Cấu trúc của virus Dengue Virus Dengue (DENV) thuộc họ Flaviviridae, chi Flavivirus và có 4 týp huyết thanh khác nhau (DENV1-4). DENV có cấu trúc hình cầu, lớp kép lipid chứa nhiều lớp protein trên bề mặt tương đối nhẵn với vỏ bọc đối xứng, đường kính khoảng 50 nm và lõi nucleocapsid bên trong (Hình 3) [63]. Cấu trúc virion DENV [62] Cấu trúc bộ gen của DENV là một chuỗi đơn RNA (ssRNA) phân cực dương dài khoảng 11 kb, được chia thành ba phần: vùng 5′ UTR (vùng chưa được dịch mã), ORF (khung đọc mở) và vùng 3′ UTR (Hình 4) [63].

Cụ thể, vùng 5′UTR có kích thước khoảng 95–101 nucleotide, trong khi độ dài của 3′UTR có thể thay đổi giữa các kiểu huyết thanh [48]. Polyprotein được mã hóa bởi ORF đóng vai trò là khuôn mẫu để dịch mã ba protein cấu trúc là capsid (C), màng (prM/M), vỏ (E) và bảy protein phi cấu trúc (NS), NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS2K, NS4B và NS5. Glycoprotein cấu trúc E 6 chịu trách nhiệm nhận dạng tế bào và thúc đẩy sự xâm nhập, trung gian bởi quá trình hợp nhất giữa vỏ virus và màng tế bào. Trong đó, protein cấu trúc C giúp liên kết và ổn định RNA virus, protein M cấu tạo nên các kênh ion của virus, protein prM có chức năng như một lớp vỏ bảo vệ các peptide trên protein E trong khi các protein NS hỗ trợ sao chép bộ gen của virus.

Cụ thể, NS1 là kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm virus giúp sao chép RNA của virus. NS1 của DENV có khối lượng phân tử 46-50 kD, thể hiện dưới hai dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết (sNS1) quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài. NS2A tham gia sao chép và lắp ráp virus. NS2B là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ.

Vùng trung tâm của NS2B là cofactor của protein NS3. NS3 có hoạt tính serin-protease và helicase, tham gia quá trình sao chép của virus và cảm ứng quá trình chết theo chương trình trong các tế bào bị nhiễm bệnh. NS4A là protein liên kết màng gây ra sự thay đổi màng và autophagy để tăng cường sự nhân lên của virus. NS4B ngăn chặn sự dẫn truyền tín hiệu do IFN -α / β gây ra và giúp virus thoát khỏi đáp ứng miễn dịch bẩm sinh của vật chủ.

Protein NS5 cấu tạo nên enzym RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) của virus và chứa các trình tự định vị hạt nhân (NLS) [53]. Cấu trúc bộ gen với trình tự polyprotein của DENV [63] 1. Vòng đời của virus Dengue DENV có thể lây nhiễm nhiều loại tế bào, như tế bào đuôi gai, tế bào nội mô, nguyên bào sợi, đại thực bào, tế bào mast và bạch cầu đơn nhân [58]. DENV xâm nhập vào tế bào bằng con đường dung hợp (fusion).

Chu kỳ sao chép của DENV bắt đầu với sự xâm nhập vào tế bào chủ bằng sự gắn kết của virus với các thụ thể của tế bào. Sau khi lây nhiễm thành công, DENV chủ yếu tấn công và nhân lên trong các tế bào đuôi 7 gai và lây nhiễm các đại thực bào, bạch cầu đơn nhân và tế bào lympho. Sự xâm nhập vào tế bào xảy ra thông qua quá trình nhập bào qua trung gian thụ thể bằng cách sử dụng các phân tử bề mặt tế bào như thụ thể Fc, glycosaminoglycans (GAG), các phân tử liên kết với CD14 gắn kết lipopolysacarit, heparan sulfat (Hình 5). DENV xâm nhập vào tế bào thông qua các túi được phủ clathrin.

Quá trình axit hóa của endosome dẫn đến sự hợp nhất của màng tế bào vật chủ và virus, sau đó giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất. Tại đây, các vật liệu di truyền của virus được vận chuyển đến màng lưới nội chất bằng bộ máy vận chuyển khung tế bào. RNA sợi dương của DENV đóng vai trò như một mRNA gắn vào ribosome của tế bào chủ mã hoá cho một phân tử polyprotein duy nhất.