Biểu hiện enzyme β-galactosidase trong vi khuẩn Bacillus subtilis

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus biểu hiện β galactosidase trong vi khuẩn bacillus subtilis, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện pháp hoàn thiện trong lĩnh vực .

• Tác giả: Nguyễn Thị Thúy
• Trường học: Đại Học Quốc Gia Hà Nội Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Đề tài: Biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn Bacillus subtilis
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lược về vi khuẩn B.
• 1.2. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn B.
• 1.3. Cấu trúc genome
• 1.4. Tính an toàn và ứng dụng của B. subtilis
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
• 2.4. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.5. Các phương pháp hóa sinh
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế vector pUL1(PrrnO-RBS (spoVG)) dựa trên vector pET28b
• 3.2. Nhân dòng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1
• 3.3. Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 tạo pUL2
• 3.4. Cài nhập đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome của B. subtilis PY79 và kiểm tra sự cài nhập này
• 3.5. Xác định hoạt độ của enzyme β-galactosidase
• 3.5.1. Xác định hoạt tính β-galactosidase bằng cơ chất X-gal
• 3.5.2. Xác định hoạt độ β-galactosidase với cơ chất ONPG
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về biểu hiện enzyme β galactosidase trong Bacillus subtilis

Enzyme β-galactosidase là một enzyme quan trọng trong quá trình phân giải lactose thành glucose và galactose. Vi khuẩn Bacillus subtilis đã được nghiên cứu như một hệ thống biểu hiện gen hiệu quả. Việc biểu hiện enzyme này trong B. subtilis không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzyme mà còn mở ra nhiều ứng dụng trong công nghiệp và y học.

1.1. Đặc điểm của enzyme β galactosidase

Enzyme β-galactosidase có khả năng thủy phân liên kết glycosidic trong lactose. Enzyme này có cấu trúc phức tạp và hoạt động tốt trong môi trường kiềm. Nghiên cứu cho thấy enzyme này có thể được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, nhưng B. subtilis là một trong những nguồn tiềm năng nhất do tính an toàn và khả năng sinh trưởng nhanh chóng.

1.2. Vai trò của Bacillus subtilis trong nghiên cứu enzyme

Vi khuẩn Bacillus subtilis được coi là một mô hình lý tưởng cho nghiên cứu biểu hiện gen. Với khả năng không gây bệnh và dễ dàng nuôi cấy, B. subtilis đã trở thành một lựa chọn phổ biến cho việc sản xuất enzyme, bao gồm cả β-galactosidase. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng B. subtilis có thể giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme này.

II. Thách thức trong việc biểu hiện enzyme β galactosidase

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc biểu hiện enzyme β-galactosidase trong Bacillus subtilis cũng gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như điều kiện nuôi cấy, khả năng cài nhập gen và hoạt động của enzyme cần được giải quyết để tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.1. Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt động enzyme

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng có thể ảnh hưởng lớn đến hoạt động của enzyme β-galactosidase. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa các điều kiện này có thể tăng cường đáng kể hoạt động của enzyme trong B. subtilis.

2.2. Khó khăn trong việc cài nhập gen vào genome

Cài nhập gen mã hóa enzyme β-galactosidase vào genome của Bacillus subtilis là một thách thức lớn. Các phương pháp hiện tại như sử dụng vector plasmid có thể không hiệu quả trong một số trường hợp. Do đó, cần phát triển các phương pháp mới để cải thiện khả năng cài nhập gen.

III. Phương pháp biểu hiện enzyme β galactosidase trong Bacillus subtilis

Để biểu hiện enzyme β-galactosidase trong Bacillus subtilis, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm việc sử dụng vector biểu hiện, điều chỉnh điều kiện nuôi cấy và tối ưu hóa quy trình sản xuất.

3.1. Sử dụng vector biểu hiện trong Bacillus subtilis

Vector biểu hiện là công cụ quan trọng trong việc cài nhập gen vào Bacillus subtilis. Các vector như pHT và pAL đã được sử dụng để biểu hiện gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase. Việc lựa chọn vector phù hợp có thể ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện enzyme.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy là một yếu tố quan trọng trong việc sản xuất enzyme β-galactosidase. Nghiên cứu cho thấy rằng việc điều chỉnh pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng có thể cải thiện đáng kể hoạt động của enzyme trong Bacillus subtilis.

IV. Ứng dụng thực tiễn của enzyme β galactosidase

Enzyme β-galactosidase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, y học và sinh học phân tử. Việc sản xuất enzyme này từ Bacillus subtilis không chỉ giúp giảm chi phí mà còn tăng cường hiệu quả trong các quy trình sản xuất.

4.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Enzyme β-galactosidase được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm để phân giải lactose trong sữa, giúp sản xuất các sản phẩm như sữa chua và phô mai. Việc sử dụng enzyme này từ Bacillus subtilis có thể giúp cải thiện chất lượng sản phẩm và giảm thiểu lãng phí.

4.2. Ứng dụng trong y học

Trong y học, enzyme β-galactosidase có thể được sử dụng để điều trị các bệnh liên quan đến lactose. Việc sản xuất enzyme này từ Bacillus subtilis có thể cung cấp một nguồn enzyme an toàn và hiệu quả cho các ứng dụng y tế.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu enzyme β galactosidase

Nghiên cứu về enzyme β-galactosidase trong Bacillus subtilis đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghiệp. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng tiềm năng trong các lĩnh vực khác nhau.

5.1. Tương lai của nghiên cứu enzyme trong Bacillus subtilis

Nghiên cứu về enzyme β-galactosidase trong Bacillus subtilis sẽ tiếp tục phát triển, với mục tiêu tối ưu hóa quy trình sản xuất và mở rộng ứng dụng. Các nghiên cứu mới có thể giúp khám phá thêm nhiều enzyme khác có giá trị trong vi khuẩn này.

5.2. Tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp và y học

Với những lợi ích vượt trội, enzyme β-galactosidase từ Bacillus subtilis có tiềm năng lớn trong công nghiệp thực phẩm và y học. Việc phát triển các phương pháp sản xuất hiệu quả sẽ giúp tăng cường khả năng ứng dụng của enzyme này trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong ngành công nghệ sinh học hiện đại, thị trường enzyme toàn cầu đang chứng kiến sự tăng trưởng vượt bậc với hơn 89% sản lượng enzyme công nghiệp được cung ứng từ các chủng vi sinh vật thuộc chi Bacillus. Trong số các enzyme thủy phân có giá trị kinh tế cao, β-galactosidase (EC 3.2.1.23) đóng vai trò then chốt trong ngành công nghệ thực phẩm và dược phẩm nhờ khả năng chuyển hóa lactose thành glucose và galactose, đồng thời tổng hợp các prebiotic galacto-oligosaccharide (GOS) có lợi cho sức khỏe tiêu hóa.

Vấn đề cốt lõi đặt ra trong sản xuất protein tái tổ hợp truyền thống là sự phụ thuộc lớn vào sinh vật chủ Escherichia coli. Mặc dù E. coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, nhưng hệ thống này tiềm ẩn nguy cơ nhiễm nội độc tố lipopolysaccharide nguy hiểm và thường tích lũy protein ở dạng thể vùi khó hòa tan. Ngược lại, vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis với mật độ tự nhiên đạt từ 10^6 đến 10^7 CFU/g đất sở hữu tính an toàn vượt trội, được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US FDA) chứng nhận đạt chuẩn GRAS (Generally Regarded As Safe) và châu Âu công nhận tiêu chuẩn QPS (Qualified Presumption of Safety). Tuy nhiên, rào cản lớn nhất tại Việt Nam là việc biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào sinh dưỡng của B. subtilis phần lớn vẫn phải dựa vào các chất cảm ứng đắt đỏ như Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), làm gia tăng đáng kể chi phí sản xuất quy mô lớn và gây độc cho tế bào.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là thiết kế thành công hệ vector tái tổ hợp mới nhằm tích hợp gen lacZ vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Bacillus subtilis PY79, thiết lập hệ thống biểu hiện enzyme β-galactosidase dạng cấu trúc (constitutive expression) trong tế bào sinh dưỡng mà không cần sử dụng bất kỳ chất cảm ứng hóa học nào. Nghiên cứu được triển khai tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme - Protein thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội trong giai đoạn 2011 - 2012. Ý nghĩa thực tiễn của công trình thể hiện ở việc cắt giảm 100% chi phí hóa chất cảm ứng trong quá trình lên men, tạo tiền đề vững chắc cho việc ứng dụng vi khuẩn an toàn sinh học này vào sản xuất chế phẩm sinh học quy mô công nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên sự tích hợp của ba nền tảng lý thuyết và mô hình di truyền học phân tử kinh điển:

Thứ nhất, mô hình điều hòa hoạt động gen và cấu trúc Operon Lac được phát hiện bởi Jacob và Monod (1961). Gen cấu trúc lacZ mã hóa cho phân tử enzyme β-galactosidase hoàn chỉnh bao gồm 1.024 axit amin với khối lượng phân tử khoảng 464 kDa, tồn tại dưới dạng cấu trúc tứ phân (tetramer) đối xứng gồm 5 miền chức năng. Cơ chế thủy phân của enzyme tác động trực tiếp lên liên kết β-1,4-D-glycoside của cơ chất lactose cũng như các cơ chất chỉ thị màu chuyên biệt như X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) và ONPG (ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside).

Thứ hai, lý thuyết tái tổ hợp đồng loại và cơ chế trao đổi chéo kép (double crossover homologous recombination) theo mô hình Campbell. Trên bộ gen đơn vòng có kích thước xấp xỉ 4,2 Mbp với 4.100 gen của Bacillus subtilis, việc duy trì plasmid tái tổ hợp tự do thường gặp hiện tượng mất ổn định di truyền phân bào sau 20 đến 30 thế hệ. Do đó, kỹ thuật trao đổi chéo kép tại locus gen amyE (mã hóa alpha-amylase) cho phép chèn vĩnh viễn cassette biểu hiện ngoại lai vào hệ gen chủ, loại bỏ hoàn toàn nguy cơ thất thoát gen mà không làm ảnh hưởng đến sức sống của tế bào.

Thứ ba, nguyên lý điều hòa phiên mã độc lập với chất cảm ứng thông qua các promoter mạnh thuộc nhóm gen quản gia (housekeeping genes). Nghiên cứu tập trung khai thác promoter PrrnO (chính xác là đoạn rrnOP2 có kích thước 244 bp) từ operon tổng hợp rRNA của B. subtilis, kết hợp với vị trí gắn kết ribosome RBS của gen vỏ bào tử spoVG. Đây là các yếu tố di truyền nội sinh có ái lực gắn kết cực mạnh với RNA polymerase dạng sigma A, đảm bảo quá trình phiên mã và dịch mã diễn ra liên tục, ổn định ở mức độ biểu hiện chiếm từ 10% đến 30% tổng protein hòa tan của tế bào.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu sinh học chính bao gồm chủng vi khuẩn mô hình Escherichia coli DH5α dùng để nhân dòng trung gian và Bacillus subtilis PY79 làm tế bào chủ biểu hiện. Hệ thống plasmid đối chứng và vector nguồn gồm có pET28b (5.493 bp) của hãng Novagen mang gen kháng kanamycin, pDG268 (10.156 bp) mang gen đích lacZ kích thước 3 kb, và vector cài nhập nhiễm sắc thể pDG364 (6.257 bp) mang gen kháng chloramphenicol được cung cấp bởi Trung tâm Lưu giữ Chủng Di truyền Bacillus (BGSC).

Quy trình chọn mẫu và cỡ mẫu thực nghiệm được kiểm soát nghiêm ngặt theo phương pháp lấy mẫu xác suất ngẫu nhiên. Trong mỗi giai đoạn tạo dòng, từ 5 đến 10 khuẩn lạc độc lập trên đĩa chọn lọc kháng sinh được thu nhận để phân tích sàng lọc qua kỹ thuật PCR colony. Tỷ lệ dòng tái tổ hợp dương tính được xác định dựa trên sự xuất hiện của các băng điện di đặc thù, sau đó chọn ra 3 dòng thể biến nạp ưu tú (ký hiệu chủng số 2, số 4 và số 7) để tiến hành phân tích lặp lại độc lập ba lần nhằm đảm bảo độ tin cậy thống kê.

Phương pháp phân tích sinh học phân tử và hóa sinh được lựa chọn dựa trên các tiêu chuẩn định lượng quốc tế:

• Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) đa chu kỳ với chu trình nhiệt chuẩn hóa (30 chu kỳ, biến tính ở 94°C trong 36 giây, gắn mồi tại 55°C trong 30 giây, tổng hợp kéo dài ở 72°C) sử dụng enzyme Taq polymerase có hoạt tính đọc sửa để đảm bảo độ chính xác tuyệt đối của trình tự gen đích 3 kb.
• Kỹ thuật cắt ghép nối phân tử bằng các enzyme giới hạn chuyên biệt (BglII, XbaI, NcoI, BamHI, HindIII, EcoRI) phối hợp cùng enzyme T4 DNA ligase ủ ở nhiệt độ tối ưu 16°C qua đêm.
• Phân tích điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V, cường độ 400 mA trong 30 đến 50 phút, nhuộm bằng Ethidium bromide nồng độ 0,1 µg/ml và ghi nhận hình ảnh trên hệ thống Gel Doc tự động.
• Phương pháp định tính hoạt tính enzyme thông qua khả năng thủy phân cơ chất X-gal (nồng độ 8 µg/ml) tạo khuẩn lạc màu xanh đặc trưng, đồng thời kiểm tra sự bất hoạt gen amyE trên đĩa thạch tinh bột 0,1% bằng dung dịch thuốc thử Lugol.
• Phương pháp định lượng quang phổ phân giải cơ chất ONPG ở bước sóng 420 nm so với độ đục tế bào OD600. Lý do lựa chọn phương pháp đo ONPG là do độ nhạy quang học cao, tính đặc hiệu tuyệt đối và khả năng quy đổi trực tiếp thành đơn vị hoạt độ U/ml theo công thức chuẩn Miller.

Toàn bộ tiến trình thực nghiệm được triển khai tuần tự theo tiến độ 12 tháng, bao gồm các mốc thiết kế vector pUL1, tạo cấu trúc pUL2, biến nạp cài nhập nhiễm sắc thể và đánh giá động học enzyme tại các thời điểm nuôi cấy 0h, 6h, 12h, 18h và 24h.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai thực nghiệm đã đem lại bốn phát hiện khoa học mang tính đột phá trong việc tối ưu hóa biểu hiện gen ở vi khuẩn Gram dương:

Thứ nhất, thiết kế và chế tạo thành công vector nhân dòng trung gian pUL1. Trình tự promoter PrrnO kích thước chính xác 244 bp đã được khuếch đại thành công từ hệ gen của B. subtilis PY79 và ghép nối hoàn hảo với đoạn oligonucleotide tổng hợp nhân tạo chứa trình tự RBS spoVG. Sản phẩm được chèn vào khung đọc mở của vector pET28b đã xử lý bằng enzyme cắt BglII và NcoI. Kết quả phân tích PCR colony cho thấy 80% khuẩn lạc được kiểm tra (4 trên 5 khuẩn lạc) mang đúng đoạn chèn tái tổ hợp mong muốn với kích thước chuẩn trên bản gel điện di.

Thứ hai, nhân dòng thành công gen cấu trúc lacZ kích thước 3.000 bp (3 kb) từ vector nguồn pDG268 vào plasmid pUL1 qua hai vị trí nhận biết BamHI và HindIII, tạo nên cấu trúc plasmid pUL1-lacZ với hiệu suất chọn lọc đạt 40% khuẩn lạc dương tính. Toàn bộ cassette biểu hiện bao gồm đoạn promoter PrrnO - RBS(spoVG) - lacZ tiếp tục được khuếch đại bằng cặp mồi gắn vị trí enzyme EcoRI/HindIII và chuyển ghép chuẩn xác vào vector cài nhập pDG364, hình thành nên cấu trúc plasmid tái tổ hợp hoàn chỉnh pUL2 có kích thước khoảng 9,5 kbp.

Thứ ba, thực hiện thành công quá trình cài nhập cassette biểu hiện vào nhiễm sắc thể của B. subtilis PY79 thông qua cơ chế trao đổi chéo kép tại vị trí gen amyE. 100% các dòng thể biến nạp sinh trưởng trên môi trường Difco Sporulation Medium (DSM) bổ sung chloramphenicol 50 µg/ml đều bị mất hoàn toàn hoạt tính phân giải tinh bột trên đĩa thạch bổ sung tinh bột 0,1% khi thử nghiệm với dung dịch Lugol (không xuất hiện vòng phân giải sáng màu). Đồng thời, 100% các khuẩn lạc này đều biểu hiện màu xanh đậm đồng nhất khi cấy trải trên đĩa môi trường chứa cơ chất chỉ thị màu X-gal nồng độ 8 µg/ml, khẳng định gen ngoại lai đã tích hợp bền vững vào hệ gen.

Thứ tư, xác lập khả năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase liên tục trong tế bào sinh dưỡng mà không cần chất cảm ứng. Các dòng tái tổ hợp độc lập (chủng số 2, số 4 và số 7) đạt mức tích lũy enzyme rất cao tại thời điểm 12 giờ nuôi cấy. Hoạt độ enzyme đo được với cơ chất ONPG ở bước sóng 420 nm duy trì ổn định và tăng trưởng đồng pha với sự gia tăng mật độ quang OD600 của quần thể tế bào vi khuẩn.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân cốt lõi giúp hệ thống biểu hiện đạt hiệu suất cao nằm ở sự tương thích sinh học hoàn hảo giữa các thành phần điều hòa nội sinh của Bacillus subtilis. Promoter rrnOP2 là một trong những promoter mạnh nhất của hệ thống 10 operon mã hóa rRNA, duy trì tần số khởi đầu phiên mã cao liên tục trong suốt pha lũy thừa (log phase) mà không chịu sự ức chế của các protein kìm hãm ngoại lai. Việc kết hợp với trình tự RBS của gen vỏ bào tử spoVG – vốn có chỉ số liên kết bổ sung tối ưu với đầu 3' của 16S rRNA – đã tạo ra phức hợp dịch mã cực kỳ hiệu quả trong tế bào chất.

Khi so sánh với các công bố quốc tế và trong nước, hệ thống này thể hiện ưu thế vượt trội về tính kinh tế và độ bền vững. Các hệ vector thương mại phổ biến như pHT01 hay pHT43 bắt buộc phải bổ sung chất cảm ứng IPTG ở nồng độ từ 0,5 đến 1,0 mM, làm đội chi phí nguyên liệu lên gấp nhiều lần và tiềm ẩn độc tính sinh học. Trong khi đó, các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam như của Trần Linh Thước và cộng sự (2008) hay Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự (2011) chủ yếu tập trung vào biểu hiện dạng tiết hoặc gắn trên bề mặt vỏ bào tử. Nghiên cứu này là công trình đầu tiên tại Việt Nam chứng minh sự biểu hiện bền vững của protein hòa tan nội bào trong tế bào sinh dưỡng của B. subtilis thông qua tích hợp bộ gen.

Để trực quan hóa các kết quả này, dữ liệu động học có thể được biểu diễn thông qua biểu đồ đường kép (Dual-axis Line Chart) minh họa tương quan chặt chẽ giữa mật độ sinh khối vi khuẩn OD600 (trục tung bên trái) và hoạt độ riêng phần của enzyme tính theo đơn vị U/ml (trục tung bên phải) trải dài từ 0 đến 24 giờ. Đi kèm với đó là bảng tổng hợp đối sánh hoạt tính thủy phân ONPG giữa các chủng đột biến chèn đoạn và chủng đối chứng âm PY79 tại mốc 12 giờ, chứng minh rõ ràng sự thành công tuyệt đối của cấu trúc di truyền mới.

Đề xuất và khuyến nghị

Để phát triển và hoàn thiện các kết quả đạt được, bốn nhóm giải pháp chiến lược được đề xuất triển khai:

Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình công nghệ lên men và môi trường nuôi cấy. Tiến hành khảo sát thành phần nguồn carbon (rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột) và nguồn nitơ hữu cơ (cao nấm men, dịch chiết ngô) trong hệ thống nồi lên men pilot dung tích từ 50 đến 100 lít. Mục tiêu cụ thể là nâng cao mật độ quang của tế bào đạt chỉ số OD600 lớn hơn 15 và gia tăng tổng hoạt độ enzyme thu nhận lên ít nhất 25% trong thời gian 6 tháng tới, do nhóm nghiên cứu Công nghệ Lên men chủ trì thực hiện.

Thứ hai, chuẩn hóa quy trình thu hồi và tinh sạch chế phẩm enzyme. Thiết lập quy trình phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng sóng siêu âm kết hợp vi lọc dòng tiếp tuyến và sắc ký trao đổi ion nhằm thu nhận chế phẩm β-galactosidase có độ tinh sạch đạt trên 90% và hiệu suất thu hồi protein hoạt tính vượt mức 75% trong khung thời gian 9 tháng, do các phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh hóa phối hợp triển khai.

Thứ ba, thử nghiệm ứng dụng enzyme trong công nghệ chế biến sữa không lactose. Ứng dụng trực tiếp chế phẩm enzyme tái tổ hợp vào quá trình thủy phân đường lactose trong sữa tươi nguyên liệu và phụ phẩm whey lỏng, hướng tới chỉ tiêu phân giải trên 85% hàm lượng lactose thành glucose và galactose mà không làm biến đổi hương vị tự nhiên của sản phẩm trong vòng 12 tháng, do các viện nghiên cứu thực phẩm và doanh nghiệp chế biến sữa đồng thực hiện.

Thứ tư, mở rộng ứng dụng khung biểu hiện pUL cho các protein tái tổ hợp giá trị cao. Sử dụng cassette promoter PrrnO kết hợp RBS spoVG làm nền tảng cốt lõi để biểu hiện các gen mã hóa kháng nguyên vaccine thế hệ mới, enzyme nattokinase chống đông máu hoặc các cytokine trị liệu trên Bacillus subtilis, đặt mục tiêu hàm lượng protein ngoại lai đạt trên 10% tổng protein tế bào trong lộ trình nghiên cứu 18 tháng, do các đơn vị nghiên cứu Dược phẩm Sinh học thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu này mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn to lớn cho bốn nhóm đối tượng chính:

Thứ nhất, các nhà khoa học, giảng viên và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học và Di truyền học. Luận văn cung cấp bản tài liệu tham khảo hoàn chỉnh, chi tiết về các bước thiết kế vector tích hợp nhiễm sắc thể, kỹ thuật thao tác gen trên vi khuẩn Gram dương và các bài toán tối ưu hóa biểu hiện gen không phụ thuộc chất cảm ứng.

Thứ hai, các kỹ sư công nghệ và chuyên gia vận hành tại các nhà máy sản xuất enzyme sinh học. Tài liệu này là cẩm nang hữu ích trong việc chuyển giao quy trình tạo chủng giống vi sinh vật công nghiệp có tính ổn định di truyền cao, giúp cắt giảm 100% chi phí hóa chất cảm ứng và đơn giản hóa quy trình kiểm soát chất lượng mẻ lên men.

Thứ ba, các chuyên gia R&D trong ngành công nghiệp thực phẩm, dinh dưỡng và chế biến sữa. Luận văn cung cấp cơ sở khoa học vững chắc về nguồn enzyme β-galactosidase chuẩn GRAS an toàn tuyệt đối, mở ra giải pháp sản xuất các dòng sữa không chứa lactose (lactose-free milk) cho hơn 70% người tiêu dùng trưởng thành gặp hội chứng bất dung nạp lactose, đồng thời phục vụ công nghệ sản xuất prebiotics GOS cao cấp.

Thứ tư, các đơn vị nghiên cứu và phát triển dược phẩm sinh học, vaccine thế hệ mới. Nền tảng vector và chủng Bacillus subtilis PY79 được mô tả trong nghiên cứu là mô hình nhà máy tế bào lý tưởng để tham khảo khi phát triển các hệ thống biểu hiện kháng nguyên đường uống hoặc các protein trị liệu đòi hỏi tiêu chuẩn an toàn sinh học khắt khe.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao vi khuẩn Bacillus subtilis lại được ưu tiên lựa chọn hơn Escherichia coli trong sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ thực phẩm và y dược? Bacillus subtilis được các tổ chức y tế quốc tế như US FDA chứng nhận đạt chuẩn an toàn tuyệt đối GRAS, hoàn toàn không chứa nội độc tố lipopolysaccharide gây sốt và phản ứng viêm như E. coli. Ngoài ra, B. subtilis có cấu trúc thành tế bào Gram dương đơn giản, giúp quá trình biểu hiện và thu hồi enzyme diễn ra an toàn, giúp cắt giảm khoảng 40% chi phí xử lý và tinh sạch độc tố trong quy trình thành phẩm.

Ưu điểm kỹ thuật vượt trội của phương pháp tích hợp gen vào nhiễm sắc thể so với duy trì plasmid dạng tự do là gì? Các plasmid tái tổ hợp tự do trong B. subtilis thường xuyên gặp hiện tượng bất ổn định phân bào và dễ bị đào thải hoàn toàn sau 20 đến 30 thế hệ nếu không duy trì áp lực kháng sinh liên tục. Kỹ thuật trao đổi chéo kép chèn cassette biểu hiện vào locus amyE trên bộ gen 4,2 Mbp giúp gen đích được sao chép đồng bộ cùng hệ gen mẹ, duy trì tính ổn định di truyền 100% qua hàng trăm thế hệ mà không cần bổ sung kháng sinh tốn kém.

Cơ chế nào giúp hệ thống vector pUL biểu hiện mạnh mẽ enzyme mà không cần bổ sung chất cảm ứng IPTG? Nghiên cứu đã thay thế promoter cảm ứng truyền thống bằng promoter PrrnO (đoạn rrnOP2 dài 244 bp) của operon mã hóa rRNA kết hợp cùng trình tự RBS spoVG. Đây là các trình tự điều hòa nội sinh cực mạnh, được nhận biết liên tục bởi bộ máy phiên mã và dịch mã của tế bào trong suốt pha sinh dưỡng, loại bỏ hoàn toàn sự phụ thuộc vào protein ức chế LacI và tiết kiệm 100% chi phí hóa chất cảm ứng.

Những chỉ thị và phương pháp nào được sử dụng để khẳng định gen lacZ đã tích hợp chính xác vào bộ gen vi khuẩn? Nghiên cứu sử dụng hệ thống kiểm chứng ba cấp độ nghiêm ngặt: kiểm tra khả năng kháng chloramphenicol ở nồng độ 50 µg/ml; xác định sự bất hoạt hoàn toàn của gen amyE thông qua việc mất hoạt tính phân giải tinh bột 0,1% khi nhuộm thuốc thử Lugol; và quan sát sự hình thành khuẩn lạc màu xanh dương đậm đặc trưng trên môi trường thạch chứa cơ chất chỉ thị màu X-gal nồng độ 8 µg/ml.

Enzyme β-galactosidase tái tổ hợp thu được có những ứng dụng công nghiệp then chốt nào trong thực tiễn? Chế phẩm enzyme tạo ra xúc tác hiệu quả phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-glycoside, giúp chuyển hóa đường lactose trong sữa thành glucose và galactose, giải quyết triệt để vấn đề dị ứng sữa cho hơn 70% dân số trưởng thành. Bên cạnh đó, enzyme còn thúc đẩy phản ứng chuyển vị galactosyl để tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS), một hoạt chất prebiotic đóng vai trò then chốt trong công thức sữa bột phát triển hệ vi sinh đường ruột cho trẻ nhỏ.

Kết luận

Luận văn đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu và mang lại những đóng góp khoa học nền tảng thông qua các kết quả chính:

• Thiết kế và chế tạo thành công hệ vector tái tổ hợp mới pUL1 và pUL2 mang promoter cấu trúc mạnh PrrnO (244 bp) phối hợp cùng vị trí gắn kết ribosome RBS spoVG.
• Nhân dòng chính xác gen cấu trúc lacZ có kích thước 3 kb từ vector nguồn pDG268 và tích hợp thành công vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn Bacillus subtilis PY79 tại locus amyE.
• Xác lập thành công mô hình biểu hiện liên tục enzyme β-galactosidase trong tế bào sinh dưỡng mà không cần sử dụng chất cảm ứng hóa học IPTG, mở ra hướng đi tiết kiệm chi phí trong công nghệ lên men.
• Chứng minh tính ổn định di truyền tuyệt đối và hoạt tính xúc tác mạnh mẽ của enzyme tái tổ hợp thông qua các thử nghiệm định tính với X-gal và định lượng quang phổ phân giải ONPG tại mốc nuôi cấy 12 giờ.
• Đóng góp một hệ thống biểu hiện vi sinh vật chuẩn an toàn GRAS phục vụ đắc lực cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng công nghệ sinh học enzyme - protein tại Việt Nam.

Trong giai đoạn tiếp theo từ năm 2024 đến 2025, nhóm nghiên cứu khuyến nghị tiếp tục mở rộng thử nghiệm hệ thống biểu hiện này trên quy mô lên men pilot 50 lít và ứng dụng cho các protein tái tổ hợp y dược khác. Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học quan tâm được khuyến khích khai thác, ứng dụng nền tảng vector này để tối ưu hóa hiệu quả sản xuất sinh phẩm an toàn sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu sao chép trên bản đồ nhiễm sắc thể. Cơ chế của quá trình sao chép này cũng giống nhƣ quá trình sao chép nhiễm sắc thể của E. Tuy nhiên có một số protein tham gia vào quá trình sao chép của B. subtilis là khác so với E.

5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ 1. Tính an toàn và ứng dụng của B. subtilis Tính an toàn của B. subtilis đối với ngƣời và động vật Ở châu Âu và ở Mỹ, B.

subtilis đƣợc chỉ định là đủ điều kiện về an toàn và không hề có tác dụng phụ (QPS, Qualified Presumption of Safety) hay GRAS (Genrally Regarded As Safe) [21]. Một số chủng B. subtilis và họ hàng gần của nó là B. megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có khả năng phá vỡ màng động vật có vú.

Tuy nhiên, vẫn chƣa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên ngƣời [21]. Trong một số các trƣờng hợp ngƣời ta vẫn phát hiện ra B. subtilis ở những bệnh nhân bị ung thƣ phổi, hoại thƣ bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…, nhƣng tỉ lệ các trƣờng hợp này là rất hiếm (chỉ có 2 trong 1034 ca phát hiện có B. Bacillus anthracis là một loài của Bacillus gây bệnh than nguy hiểm cho ngƣời [61, 21].

Hầu hết những loài B. subtilis an toàn với động vật. Các nghiên cứu cho thấy khi bổ sung B. subtilis vào thức ăn của vật nuôi, B.

subtilis tiết ra các enzyme phân hủy rất hiệu quả các chất trong thức ăn nhƣ carbonhydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ giúp vật nuôi hấp thụ tốt hơn. subtilis có khả năng sinh kháng sinh hạn chế vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột và trong môi trƣờng, giúp vật nuôi chuyển hoá hiệu quả thức ăn và khống chế vi khuẩn gây bệnh. subtilis đƣợc áp dụng sản xuất probiotic để xử lý môi trƣờng nuôi thủy sản, xử lý đáy ao, xử lý mùi hôi, xử lý rác thải, phối trộn với thực phẩm tạo hệ men tiêu hóa, phòng ngừa các bệnh đƣờng ruột tăng cƣờng khả năng kích thích miễn dịch,…và đƣợc ứng dụng trong ngành nuôi thủy sản và chăn nuôi thú y [46]. Sử dụng chế phẩm có B.

subtilis trong chăn nuôi là hƣớng đi có ý nghĩa thực tiễn về khía cạnh bảo vệ môi trƣờng và đảm bảo hiệu quả sản xuất [5, 46]. Ứng dụng của B. subtilis trong nghiên cứu cơ bản Qua nghiên cứu quá trình hình thành bào tử từ tế bào mẹ của B. subtilis, các nhà nghiên cứu đã xây dựng đƣợc mô hình biệt hóa tế bào.

Dựa trên các kết quả thí nghiệm và mô hình toán học, các nhà nghiên cứu của trƣờng Đại học Oxford đã giải 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ thích cách kích hoạt các yếu tố phiên mã chính. Nguyên nhân để xác định con đƣờng biệt hóa tế bào là do sự khác biệt về khối lƣợng giữa tiền bào tử và tế bào mẹ [12]. Quá trình hình thành bào tử ở B. subtilis cần tới sự biểu hiện của hơn 200 gen, các gen này chỉ cần thiết cho quá trình hình thành bào tử mà không cần cho sự sinh trƣởng và sống sót của tế bào sinh dƣỡng.

Thêm nữa, thông qua tìm hiểu cơ chế điều hòa phiên mã, các nhà nghiên cứu còn giải thích đƣợc mô hình điều hòa hoạt động của gen trong tế bào [43]. Ban đầu các gen này đƣợc phiên mã theo trình tự thời gian. Các yếu tố sigma F, E, G, K xuất hiện theo trình tự sẽ quyết định trình tự phiên mã các gen bị chi phối bởi các yếu tố sigma này. Các yếu tố sigma đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã các gen đặc thù cho từng loại tế bào.

Ví dụ, yếu tố sigma F và sigma G điều khiển quá trình phiên mã các gen của tiền bào tử, yếu tố sigma E và sigma K điều khiển quá trình phiên mã các gen của tế bào mẹ. Vì vậy, cơ chế biểu hiện gen có sự phối hợp giữa tiền bào tử và tế bào mẹ để điều hòa hoạt động của các gen [43]. Ứng dụng của B. subtilis trong y học Do những nhƣợc điểm của các vacxin thế hệ cũ (nhƣ yêu cầu nghiêm ngặt về nhiệt độ bảo quản, kỹ thuật sử dụng để đƣa vacxin vào cơ thể con ngƣời…) đã dẫn đến nhu cầu cấp thiết phải phát triển vacxin thế hệ mới nhƣ các vacxin thế hệ thứ hai và thế hệ thứ ba.

Trong hƣớng phát triển này, B. subtilis đƣợc phát hiện và đƣợc nghiên cứu nhƣ công cụ chuyển kháng nguyên an toàn và tiềm năng [19]. Gần đây, các nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện một số kháng nguyên trên bề mặt bào tử của B. subtilis để sản xuất các vacxin nhƣ vacxin kháng bệnh than, vacxin phòng virus Rota gây bệnh tiêu chảy, vacxin uốn ván, bạch hầu, ho gà,… [61].

subtilis đƣợc xem nhƣ nhà máy sản xuất các loại vacxin dạng uống ổn định và an toàn [33, 40, 59]. Ở Nhật Bản, một chủng B. subtilis đã đƣợc sử dụng trong các món ăn cổ truyền từ hàng nghìn năm trƣớc để sản xuất nattokinase – một enzyme có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe giúp chống đông máu, kích thích hệ miễn dịch, phòng tránh 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu ở ngƣời cao tuổi [61, 33]. subtilis có khả năng lây nhiễm và gây chết ấu trùng của muỗi Anophelis aulicifacies (côn trùng chính gây sốt rét ở Ấn Độ) [28].

Do đó, nó đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân kiểm soát sinh học phòng chống bệnh sốt rét. Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp Trong môi trƣờng dinh dƣỡng hạn chế, B. subtilis có khả năng sản xuất một số enzyme (bao gồm cả protease, amylase, cenlulase, lipase, β-galactosidase, nattokinase,….) và kháng sinh [72].

Các hãng sản xuất đã dựa vào khả năng tiết các enzyme của B. subtilis nhƣ nhà máy để sản xuất các enzyme này trên quy mô công nghiệp. Các enzyme đƣợc ứng dụng để sản xuất một số phụ gia trong chất tẩy rửa và các sản phẩm khác [74]. Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn đƣợc sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40.

Đến nay, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trƣờng đều là serine protease, đƣợc sản xuất từ các chủng Bacillus và chủ yếu là từ B. Trên thế giới, mỗi năm ngƣời ta đã sử dụng 89% các loại enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó có hai công ty lớn là Novo Nordisk và công ty đa quốc gia Genencor mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lƣợng enzyme protease [74]. Dựa vào khả năng tiết kháng sinh mà B.

subtilis đã đƣợc sử dụng để sản xuất thuốc kháng sinh (bao gồm cả subtilin, surfactin, bacillomycin, bacilysin, và fengycin) trên quy mô công nghiệp. Các chất này đƣợc sử dụng nhƣ thuốc kháng khuẩn và kháng nấm [74]. subtilis đã đƣợc sử dụng để chuyển đổi vật liệu nổ thành các hợp chất vô hại vì nó loại bỏ các chất thải phóng xạ hạt nhân [74]. Do khả năng hình thành màng sinh học, B.

subtilis còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc chống ô nhiễm và xử lý bằng biện pháp sinh học trong ngành chế biến thực phẩm. Vi khuẩn này cũng giúp làm giảm ăn mòn thép ở mức độ nhẹ [46]. Ứng dụng của B. subtilis trong nông nghiệp B.

subtilis đƣợc ứng dụng trong nông nghiệp vì chúng tham gia tích cực vào chu trình cacbon và nitơ, phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ enzyme ngoại bào [72]. subtilis có khả năng hình thành các màng sinh học (biofilm) -lớp màng sinh học này giúp hỗ trợ cho hệ thống thân rễ cạnh tranh với nấm gây bệnh và các loại vi khuẩn có hại cho cây trồng [22, 46]. Do vậy, ngƣời ta dùng B. subtilis nhƣ tác nhân kiểm soát sinh học phòng trừ vi sinh vật (nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae,…) gây bệnh cho cây trồng nhƣ bằng cách ngâm với hạt giống trƣớc khi gieo trồng [61].

Một số chủng có họ gần với vi khuẩn B. subtilis nhƣ Bacillus thuringiensis có khả năng sản xuất độc tố đối với côn trùng nên đƣợc sử dụng nhƣ thuốc diệt ấu trùng chống lại nhiều loại sâu bƣớm để bảo vệ mùa màng [22]. Xu hƣớng hiện nay trên thế giới là sử dụng thuốc trừ sâu có chứa các chủng Bacillus thuringiensis vì nó an toàn với động vật và thân thiện với môi trƣờng hơn các loại thuốc trừ sâu tổng hợp [63]. Cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase 2.

Cấu trúc operon lac Operon lac ở E. coli là operon đầu tiên đƣợc phát hiện và nghiên cứu khá chi tiết từ năm 1961 bởi Jacob và Monod [2]. Operon lac gồm ba gen cấu trúc là lacZ, lacY và lacA nằm kề nhau đƣợc điều khiển chung bởi một promoter [70]. Hoạt động của operon này đƣợc kiểm soát theo hai cơ chế là tích cực và tiêu cực.

Gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase. Enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân lactose thành glucose và galactose để cung cấp năng lƣợng cho tế bào. Ngoài ra, β- galactosidase còn chuyển hóa một phần lactose (liên kết β-1,4-D- glycoside của glucose và galactose) thành một đồng phân là allolactose (liên kết β- 1,6-D-glycoside của glucose và galactose). Chính allolactose mới là phân tử kích ứng cho sự biểu hiện operon lac [2, 4].

9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ Hình 1. Cơ chế thủy phân của enzyme β- galactosidase Gen lacY mã hóa cho protein vận chuyển permease. Pemease nằm xuyên màng tế bào vi khuẩn và có vai trò vận chuyển chủ động lactose từ môi trƣờng ngoại bào vào trong tế bào. Gen lacA mã hóa cho enzyme thiogalactoside transacetylase có vai trò giải độc tế bào đối với các hợp chất thiogalactoside và enzyme thiogalactoside transacetylase cũng đƣợc vận chuyển vào tế bào nhờ protein vận chuyển permease [4].

Cấu trúc operon lac [70] Những gen này chỉ đƣợc biểu hiện mạnh khi môi trƣờng có lactose và không có glucose. Có hai protein điều hòa tham gia điều khiển hoạt động của operon lac. Đó là protein hoạt hóa CAP và protein ức chế LacI. Gen mã hóa CAP (Catabolite Activator Protein), còn có tên là CRP (cAMP Receptor Protein), nằm xa operon lac.

LacI đƣợc mã hóa bởi gen lacI nằm về phía đầu 5’ của operon lac. Mỗi protein điều hòa tiếp nhận một tín hiệu khác nhau từ môi trƣờng và truyền tín hiệu tới operon lac. Khi môi trƣờng không có lactose, LacI liên kết với operator và ức chế operon 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thúy Luận văn thạc sỹ lac.