Luận án tiến sĩ: Biến đổi gen KRAS, BRAF và protein MMR ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng ĐH Y Hà Nội

Nghiên cứu về tình trạng biến đổi gen KRAS, BRAF và biểu hiện protein MMR ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, phục vụ chẩn đoán và điều trị trúng đích.

• Tác giả: Bùi Bích Mai
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Cẩm Phương TS.
• Trường học: Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Y sinh học - Di truyền
• Đề tài: Biến đổi gen KRAS, BRAF và protein MMR ở người bệnh ung thư đại trực tràng
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2026
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan biến đổi gen KRAS BRAF và protein MMR ung thư

Ung thư đại trực tràng là một bệnh lý ác tính phổ biến trên toàn cầu. Quá trình sinh ung thư diễn ra phức tạp qua nhiều con đường di truyền khác nhau. Các nghiên cứu sinh học phân tử hiện đại làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh ở mức độ tế bào. Đột biến gen KRAS, BRAF và biến đổi hệ thống protein sửa chữa bắt cặp sai ADN (MMR) là những sự kiện phân tử trung tâm. Gen KRAS và BRAF tham gia điều hòa con đường truyền tín hiệu nội bào MAPK. Con đường này kích thích tế bào tăng sinh, biệt hóa và kháng lại quá trình chết theo chương trình. Khi gen bị đột biến, protein truyền tín hiệu liên tục mà không cần kích thích từ thụ thể bề mặt. Bên cạnh đó, hệ thống MMR gồm bốn protein chính là MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2. Hệ thống này đảm nhận nhiệm vụ sửa chữa các lỗi ghép cặp sai phát sinh trong quá trình nhân đôi ADN. Mất chức năng hệ thống MMR dẫn đến tình trạng mất ổn định vi vệ tinh ở mô ung thư. Sự kết hợp giữa các dấu ấn này giúp bác sĩ phân loại phân nhóm sinh học của khối u đại trực tràng. Bệnh nhân có cơ hội tiếp cận phác đồ điều trị cá thể hóa chính xác hơn.

1.1. Khái niệm và vai trò sinh học của gen KRAS và BRAF

Gen KRAS thuộc gia đình gen sinh ung RAS. Gen này mã hóa protein G nội bào với hoạt tính GTPase. Protein KRAS giữ vai trò như một công tắc phân tử điều khiển tín hiệu tăng sinh tế bào. Khi gắn với GTP, protein hoạt hóa và truyền tín hiệu xuống hạ lưu. Khi thủy phân GTP thành GDP, protein chuyển sang trạng thái bất hoạt. Gen BRAF mã hóa protein kinase thuộc họ RAF, nằm phía dưới KRAS trong chuỗi tín hiệu MAPK. Đột biến gen KRAS hoặc BRAF làm gián đoạn cơ chế kiểm soát phân tử. Tế bào nhận tín hiệu nhân đôi liên tục. Đột biến KRAS thường gặp tại codon 12, 13 thuộc exon 2. Đột biến BRAF phổ biến nhất là V600E trên exon 15. Các biến đổi này thúc đẩy tế bào ung thư tăng trưởng độc lập.

1.2. Chức năng của hệ thống protein sửa chữa bắt cặp sai MMR

Hệ thống MMR là cơ chế bảo vệ tính toàn vẹn của hệ gen tế bào. Trong quá trình nhân đôi ADN, enzyme polymerase có thể lắp ráp sai các bazơ nitơ. Hệ thống MMR nhận diện và sửa chữa kịp thời các đoạn bắt cặp sai này. Bốn protein then chốt tham gia vận hành gồm MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2. Các protein liên kết với nhau theo từng cặp dị nhị phân chức năng. Phức hợp MSH2-MSH6 phát hiện lỗi sai trên chuỗi phân tử ADN. Phức hợp MLH1-PMS2 tiến hành cắt bỏ đoạn lỗi và hỗ trợ tổng hợp chuỗi mới chuẩn xác. Khi bất kỳ protein nào trong hệ thống bị khiếm khuyết, chức năng sửa chữa sẽ suy giảm nghiêm trọng. Hiện tượng này gây tích tụ hàng loạt đột biến trong các đoạn lặp vi vệ tinh. Từ đó, tế bào niêm mạc đại trực tràng nhanh chóng chuyển dạng thành tế bào ung thư ác tính.

II. Phân tích biến đổi gen KRAS BRAF và protein MMR trong khối u

Tỷ lệ biến đổi gen KRAS, BRAF và thiếu hụt protein MMR biểu hiện đặc tính dị sinh của ung thư đại trực tràng. Các nghiên cứu lâm sàng ghi nhận đột biến KRAS xuất hiện ở khoảng 30% đến 50% bệnh nhân. Đột biến này thường loại trừ lẫn nhau với đột biến BRAF. Đột biến gen BRAF có tần suất thấp hơn, dao động quanh mức 5% đến 15%. Tuy nhiên, đột biến BRAF V600E báo hiệu tiên lượng xấu với nguy cơ di căn phúc mạc cao. Bên cạnh đó, tình trạng mất biểu hiện protein MMR (dMMR) chiếm khoảng 10% đến 15% tổng số ca bệnh. Bệnh nhân dMMR thường có khối u ở đại tràng phải với mức độ thâm nhiễm lympho cao. Sự khiếm khuyết protein MMR có thể xuất phát từ đột biến dòng mầm trong hội chứng Lynch. Ngoài ra, nguyên nhân còn do hiện tượng methyl hóa vùng khởi động của gen MLH1 trong các ca bệnh lẻ tẻ. Khối u mang đồng thời đột biến BRAF và dMMR thường liên quan chặt chẽ đến cơ chế biểu sinh methyl hóa hơn là di truyền gia đình. Việc phân tích đồng thời ba dấu ấn này bộc lộ bức tranh sinh học phân tử toàn diện. Dữ liệu giúp bác sĩ thấu hiểu hành vi khối u và đánh giá chính xác nguy cơ tái phát bệnh.

2.1. Mối liên hệ lâm sàng giữa đột biến KRAS và BRAF

Đột biến KRAS và BRAF hầu như loại trừ lẫn nhau trong cùng một khối u đại trực tràng. Hiện tượng này khẳng định vai trò độc lập của từng đột biến trong việc kích hoạt dòng thác tín hiệu nội bào. Người bệnh mang đột biến KRAS thường không đáp ứng với các kháng thể đơn dòng kháng EGFR như Cetuximab hay Panitumumab. Điều này tạo ra rào cản lớn trong việc lựa chọn thuốc nhắm trúng đích cho giai đoạn di căn. Ngược lại, đột biến BRAF V600E khiến khối u tiến triển rất nhanh và kháng hóa trị truyền thống. Bệnh nhân có đột biến BRAF đối mặt với tỷ lệ sống sót thấp hơn rõ rệt. Đánh giá hai gen này cùng lúc là chỉ định bắt buộc trước khi lập phác đồ điều trị.

2.2. Vấn đề mất biểu hiện protein MMR và hội chứng Lynch

Mất biểu hiện protein MMR tạo ra kiểu hình dMMR và gây mất ổn định vi vệ tinh mức độ cao. Hiện tượng này đặt ra vấn đề phân loại nguồn gốc phát sinh khối u. Bệnh nhân có thể mắc hội chứng Lynch mang tính di truyền gia đình do đột biến dòng mầm các gen MMR. Tuy nhiên, khối u cũng có thể xuất hiện do hiện tượng methyl hóa promoter gen MLH1 mắc phải. Mất protein MSH2 hoặc MSH6 thường gợi ý trực tiếp đến hội chứng Lynch. Ngược lại, việc mất protein MLH1 đi kèm đột biến BRAF V600E chứng minh nguồn gốc ung thư lẻ tẻ. Bác sĩ dựa vào dấu hiệu này để loại trừ hội chứng di truyền, giảm bớt chi phí xét nghiệm gen cho người thân.

III. Phương pháp xét nghiệm gen KRAS BRAF và protein MMR tối ưu

Quy trình chẩn đoán sinh học phân tử hiện đại kết hợp nhiều kỹ thuật xét nghiệm chuẩn hóa. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) là phương pháp hàng đầu để đánh giá tình trạng protein MMR. Bác sĩ giải phẫu bệnh nhuộm mô u với bốn kháng thể đặc hiệu gồm MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2. Mẫu mô mất bắt màu ở nhân tế bào u nhưng giữ màu ở tế bào đệm xác nhận tình trạng dMMR. Đối với đột biến gen KRAS và BRAF, các kỹ thuật phân tích ADN mang lại độ nhạy vượt trội. Phương pháp Real-time PCR phát hiện nhanh chóng các đột biến điểm phổ biến tại exon 2, 3, 4 của KRAS và đột biến V600E của BRAF. Ngoài ra, kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) ngày càng mở rộng ứng dụng lâm sàng. NGS cho phép giải trình tự đồng thời hàng trăm gen đích trên một lượng mẫu mô sinh thiết nhỏ. Giải pháp này tiết kiệm tối đa thời gian chẩn đoán và phát hiện được các biến thể hiếm gặp. Việc kiểm chuẩn chất lượng mẫu mô đúc khối nến cố định bằng formalin đóng vai trò sống còn. Tỷ lệ tế bào u trong mẫu xét nghiệm phải đạt tối thiểu từ 20% trở lên để đảm bảo tính chuẩn xác.

3.1. Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch xác định protein MMR

Hóa mô miễn dịch là xét nghiệm thường quy có giá trị cao trong tầm soát thiếu hụt protein MMR. Kỹ thuật này sử dụng kháng thể đơn dòng gắn kết chuyên biệt với từng protein MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2. Mẫu mô ung thư được xử lý và đánh giá dưới kính hiển vi quang học. Sự mất tín hiệu nhuộm nhân của bất kỳ protein nào phản ánh tình trạng dMMR. Xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu đạt trên 90% so với kỹ thuật sinh học phân tử PCR vi vệ tinh. Quy trình thực hiện nhanh, chi phí hợp lý và dễ triển khai tại nhiều bệnh viện. Kết quả hóa mô miễn dịch cung cấp chỉ dấu đầu tiên để định hướng điều trị miễn dịch và sàng lọc hội chứng di truyền gia đình.

3.2. Phương pháp giải trình tự gen phát hiện đột biến KRAS và BRAF

Kỹ thuật giải trình tự chuỗi ADN đóng vai trò tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán đột biến gen KRAS và BRAF. Phương pháp giải trình tự Sanger truyền thống xác định chính xác trình tự từng nucleotide nhưng đòi hỏi tỷ lệ tế bào u cao. Kỹ thuật Real-time PCR và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) nâng cao rõ rệt độ nhạy phân tích. Công nghệ NGS phân tích đồng thời nhiều đột biến tại các vị trí codon 12, 13, 61, 146 của gen KRAS và codon 600 của gen BRAF. Thời gian trả kết quả được rút ngắn đáng kể, hỗ trợ hội chẩn kịp thời. Xét nghiệm gen từ mẫu mô sinh thiết hoặc sinh thiết lỏng giúp bác sĩ đưa ra phác đồ đích chuẩn xác.

IV. Ứng dụng biến đổi gen KRAS BRAF và protein MMR trong điều trị

Xác định tình trạng biến đổi gen KRAS, BRAF và biểu hiện protein MMR làm thay đổi hoàn toàn cục diện điều trị ung thư đại trực tràng. Đối với người bệnh ở giai đoạn di căn, tình trạng gen KRAS tự nhiên (hoang dã) là điều kiện bắt buộc để chỉ định thuốc kháng EGFR. Khi có đột biến KRAS hoặc BRAF, liệu pháp kháng EGFR không mang lại hiệu quả, thậm chí gây độc tính không cần thiết. Trong trường hợp mang đột biến BRAF V600E, bác sĩ chuyển hướng áp dụng phác đồ kết hợp chất ức chế BRAF, thuốc kháng EGFR và hóa trị. Bước tiến này cải thiện đáng kể thời gian sống thêm cho nhóm bệnh nhân tiên lượng rất xấu. Đồng thời, tình trạng dMMR mở ra cơ hội đột phá với các thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch như Pembrolizumab hay Nivolumab. Khối u dMMR tích tụ lượng lớn đột biến, tạo ra nhiều kháng nguyên lạ kích thích hệ miễn dịch tấn công tế bào ác tính. Tỷ lệ đáp ứng điều trị miễn dịch ở nhóm này vượt trội hơn hẳn so với hóa trị truyền thống. Bệnh nhân giai đoạn sớm có dMMR thậm chí có thể cân nhắc miễn giảm hóa trị bổ trợ. Ứng dụng ba dấu ấn này đem lại hiệu quả lâm sàng tối ưu.

4.1. Lựa chọn liệu pháp nhắm trúng đích theo tình trạng gen

Xét nghiệm gen KRAS và BRAF quyết định việc sử dụng thuốc sinh học nhắm trúng đích. Thuốc kháng EGFR như Cetuximab chỉ phát huy tác dụng khi khối u mang gen KRAS thể hoang dã. Khi xuất hiện đột biến tại bất kỳ exon nào của KRAS, tế bào tự kích hoạt tăng sinh, làm vô hiệu hóa thuốc. Bên cạnh đó, bệnh nhân mang đột biến BRAF V600E cần phác đồ nhắm trúng đích kết hợp đa tầng. Việc phối hợp thuốc ức chế BRAF (Encorafenib) cùng thuốc kháng EGFR mang lại sự ức chế toàn diện chuỗi truyền tín hiệu MAPK. Cách tiếp cận cá thể hóa giúp kiểm soát khối u bền vững và hạn chế biến chứng không đáng có.

4.2. Ý nghĩa của protein dMMR trong chỉ định liệu pháp miễn dịch

Tình trạng dMMR là dấu ấn sinh học chuẩn xác nhất để chỉ định liệu pháp miễn dịch trong ung thư đại trực tràng. Khi thiếu hụt protein MMR, khối u sản sinh hàng nghìn đột biến và tạo ra các tân kháng nguyên bề mặt. Tế bào miễn dịch nhận diện các tân kháng nguyên này rất nhạy bén. Nhóm thuốc ức chế PD-1 hoặc PD-L1 giải phóng hàng rào ức chế, giúp tế bào T tiêu diệt khối u mạnh mẽ. Bệnh nhân có khối u dMMR đạt tỷ lệ thoái lui bệnh ấn tượng và duy trì thời gian đáp ứng kéo dài. Ngược lại, khối u còn đầy đủ protein MMR (pMMR) ít đáp ứng với miễn dịch đơn trị liệu và cần kết hợp hóa trị.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư phổ biến thứ ba và là nguyên nhân thứ hai gây tử vong do ung thư trên toàn thế giới. Theo số liệu của GLOBOCAN năm 2022, UTĐTT nằm trong nhóm năm loại ung thư hay gặp nhất tại Việt Nam ở cả hai giới. Cơ chế bệnh sinh phân tử của UTĐTT gồm hai con đường chính: con đường mất ổn định nhiễm sắc thể (CIN) chiếm khoảng 70% đến 80% trường hợp liên quan đến các gen như APC, KRAS, BRAF, PI3K và TP53; và con đường mất ổn định vi vệ tinh (MSI) chiếm khoảng 15% đến 20% do sự bất hoạt của các gen thuộc hệ thống sửa chữa bắt cặp sai DNA (MMR).

Trên thực hành lâm sàng hiện nay, việc xét nghiệm các dấu ấn sinh học phân tử phần lớn mới chỉ tập trung đáp ứng nhu cầu điều trị đích (xác định đột biến gen KRAS, BRAF) hoặc xem xét chỉ định điều trị miễn dịch (đánh giá tình trạng dMMR hoặc MSI) mà thường bỏ sót các trường hợp dMMR có nguy cơ mắc hội chứng Lynch – hội chứng ung thư đại trực tràng di truyền phổ biến nhất có thể sàng lọc, chẩn đoán sớm cho người bệnh và gia đình. Thêm vào đó, các dữ liệu nghiên cứu về đặc điểm đột biến KRAS, BRAF cũng như tình trạng biểu hiện protein MMR và biến thể gen MMR tại Việt Nam còn hạn chế, phân tán. Chưa có nghiên cứu nào thực hiện chẩn đoán hội chứng Lynch từ các trường hợp dMMR thông qua việc áp dụng đồng thời các kỹ thuật hóa mô miễn dịch, Real-time PCR và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS).

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm hai mục tiêu:

1. Xác định đặc điểm các biến thể của gen KRAS, BRAF và tình trạng biểu hiện các protein MMR và gen MMR ở người bệnh ung thư đại trực tràng.
2. Phân tích mối liên quan giữa một số đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học với các biến thể gen KRAS, BRAF và biểu hiện các protein MMR, gen MMR ở nhóm người bệnh trên.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 218 người bệnh được chẩn đoán xác định UTĐTT dựa trên kết quả giải phẫu bệnh, có chỉ định xét nghiệm đột biến gen KRAS, BRAF và đánh giá tình trạng biểu hiện protein MMR.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai có sự phối hợp chuyên môn của Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội.
• Phạm vi thời gian: Thời gian thu thập mẫu bệnh phẩm từ tháng 01/2022 đến tháng 06/2023; toàn bộ tiến trình triển khai nghiên cứu được tiến hành từ tháng 01/2023 đến tháng 12/2024.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế về các dấu ấn phân tử trong UTĐTT:

• Hướng nghiên cứu về đột biến gen KRAS, BRAF và con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào: KRAS và BRAF là các gen tiền ung thư thuộc chuỗi tín hiệu RAS/RAF/MAPK xuôi dòng từ thụ thể EGFR. Gen KRAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 12, dài 45.691 bp gồm 6 exon. Hơn 3.000 đột biến điểm đã được ghi nhận trên gen KRAS, tập trung chủ yếu tại codon 12 (khoảng 82%) và codon 13 (khoảng 17%) thuộc exon 2. Các đột biến này làm protein K-Ras mất khả năng thủy phân GTP, dẫn đến trạng thái hoạt hóa liên tục không phụ thuộc tín hiệu từ EGFR và gây đề kháng với liệu pháp kháng thể đơn dòng kháng EGFR. Luận án viện dẫn quyết định năm 2012 của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cetuximab cho UTĐTT di căn không có đột biến KRAS dựa trên thử nghiệm lâm sàng pha III (n = 394), trong đó nhánh dùng cetuximab cải thiện thời gian sống thêm toàn bộ trung bình từ 4,8 tháng lên 9,5 tháng (p < 0,001) và thời gian sống không tiến triển từ 1,9 tháng lên 3,7 tháng (p < 0,001). Đột biến BRAF V600E (nằm trên exon 15, nhánh dài nhiễm sắc thể số 7) chiếm hơn 90% đột biến gen BRAF. Nghiên cứu trên 629 người bệnh Trung Quốc được trích dẫn cho thấy đột biến BRAF V600E liên quan nhiều hơn đến ung thư biểu mô biệt hóa tốt so với biệt hóa kém hoặc vừa (25,0% so với 3,1% và 2,7%, p = 0,002), không liên quan đến tuổi (p = 0,587), giới tính (p = 0,779), vị trí u (p = 0,684) và giai đoạn TNM (p = 0,877).
• Hướng nghiên cứu về hệ thống MMR và hội chứng Lynch: Dữ liệu của dự án The Cancer Genome Atlas (TCGA) chỉ ra 60% khối u MSI do bất hoạt biểu sinh MLH1 kèm tỷ lệ cao đột biến BRAF V600E, trong khi 10% do đột biến dòng mầm các gen MMR. Phân tích tổng hợp từ 32 nghiên cứu với 1277 ca dMMR trên tổng số 7642 người bệnh cho thấy nhóm dMMR/MSI có tiên lượng sống tốt hơn nhóm pMMR/MSS khi dùng 5-FU. Nghiên cứu KEYNOTE-164 khẳng định pembrolizumab giúp cải thiện tỷ lệ đáp ứng và kéo dài thời gian sống thêm không tiến triển ở người bệnh dMMR/MSI-H. Về tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng Lynch, tác giả điểm lại tiêu chuẩn Amsterdam I, Amsterdam II và hướng dẫn Bethesda sửa đổi (độ nhạy 82%, độ đặc hiệu 77%), cùng các kiểu hình liên quan gồm hội chứng giống Lynch (Lynch-like syndrome), hội chứng Muir-Torre và hội chứng Turcot.
• Dữ liệu nghiên cứu tại Việt Nam: Tỷ lệ đột biến KRAS được báo cáo khoảng 48% (chủ yếu ở exon 2) theo nghiên cứu của Nguyễn Trọng Hòa và Trịnh Lê Huy (ghi nhận tỷ lệ 44,7%), tỷ lệ đột biến BRAF từ 6% đến 9%. Một nghiên cứu tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ghi nhận tỷ lệ hội chứng Lynch ước tính là 6,3% (12/190 bệnh nhân), trong đó có 58% trường hợp không có tiền sử gia đình. Nghiên cứu trên 151 người bệnh dân tộc Kinh và Mường ghi nhận tỷ lệ MSI-H là 45,0%, đột biến KRAS là 37,1%, BRAF là 2,6%, với sự đồng tồn tại đáng kể giữa MSI-H với đột biến KRAS (48,2%) và BRAF (75,0%).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết: Đánh giá tích hợp đồng thời đột biến KRAS, BRAF, biểu hiện 4 protein MMR và giải trình tự gen thế hệ mới các gen MMR/EPCAM để xác định đột biến dòng mầm hội chứng Lynch từ nhóm người bệnh dMMR tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích:

• Thuyết hai cú hit của Knudson: Các gen MMR đóng vai trò là các gen ức chế khối u. Đột biến dòng mầm dị hợp tử ở một alen kết hợp với đột biến mất soma hoặc hiện tượng mất tính dị hợp tử (LOH) ở alen bình thường còn lại dẫn đến sự thiếu hụt hoàn toàn hệ thống sửa chữa bắt cặp sai DNA trong tế bào.
• Cơ chế hoạt động của phức hợp dimer protein MMR: Các protein hoạt động theo cặp gồm MLH1 kết hợp với PMS2, và MSH2 kết hợp với MSH6 hoặc MSH3. Phức hợp dimer nhận diện và sửa lỗi ghép sai nucleotid phát sinh trong quá trình sao chép tại khoảng 2×10^7 vùng vi vệ tinh của hệ gen. Việc thiếu biểu hiện protein gây tình trạng dMMR, bộc lộ đủ là pMMR. Sự xuất hiện của đột biến BRAF V600E ở khối u mất MLH1 gợi ý tổn thương mắc phải, giúp loại trừ chẩn đoán hội chứng Lynch.

Phương pháp nghiên cứu thực tế:

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả, cắt ngang, kết hợp hồi cứu và tiến cứu.
• Cỡ mẫu và cách chọn mẫu: Nghiên cứu áp dụng phương pháp lấy mẫu toàn bộ thu được 218 bệnh nhân, lớn hơn cỡ mẫu tối thiểu 194 trường hợp được tính theo công thức ước tính một tỷ lệ của Tổ chức Y tế Thế giới (với mức ý nghĩa 5%, Z = 1,96; sai số tuyệt đối d = 0,07; và tỷ lệ đột biến KRAS p = 0,447 lấy từ nghiên cứu của Nguyễn Trọng Hòa, Trịnh Lê Huy).
• Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ: Chọn người bệnh UTĐTT có khối nến paraffin (FFPE) đạt yêu cầu, được xét nghiệm đầy đủ KRAS, BRAF và HMMD 4 protein MMR; người bệnh dMMR đồng ý làm xét nghiệm di truyền; hồ sơ bệnh án đầy đủ biến số. Loại trừ các trường hợp mẫu không đủ lượng tế bào u sống (< 50 tế bào), xét nghiệm không cùng một mẫu bệnh phẩm, người bệnh có tiền sử truyền máu trong 4-6 tháng, ghép tủy/tế bào gốc hoặc mắc ung thư máu phối hợp.
• Kỹ thuật phân tích:
  • Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (HMMD): Đánh giá 4 protein MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2 trên mẫu mô FFPE sử dụng cơ chất diaminobenzidine (DAB). Mỗi dấu ấn gồm 3 lam (nhuộm HE, chứng âm và kháng thể đặc hiệu). Tế bào u có nhân bắt màu rõ ràng được đánh giá là dương tính (pMMR); tế bào u không bắt màu nhân hoặc mờ nhạt được tính là âm tính (dMMR).
  • Kỹ thuật Real-time PCR: Phát hiện đột biến điểm trên exon 2 (codon 12 và codon 13) của gen KRAS và codon 600 của gen BRAF trên hệ thống Cobas z 480 của hãng Roche.
  • Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS): Tiến hành trên mẫu máu ngoại vi của nhóm bệnh nhân dMMR nhằm phân tích các biến thể dòng mầm trên 5 gen: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 và EPCAM. Quy trình gồm 3 bước: tạo thư viện DNA bằng phân mảnh ngẫu nhiên gắn adapter, khuếch đại gen bằng PCR, và giải trình tự theo nguyên lý pyrosequencing.
  • Quy trình tư vấn di truyền và lập phả hệ: Thu thập thông tin cá nhân và người thân tối thiểu 3 thế hệ theo chuẩn quốc tế; phân tầng nguy cơ dựa trên tiêu chuẩn Amsterdam và Bethesda sửa đổi.

Nguồn tư liệu: Khối nến mô u đúc paraffin (FFPE), mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi và hồ sơ bệnh án của 218 người bệnh tại Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dịch tễ học và ba con đường sinh bệnh học phân tử của UTĐTT gồm CIN (70-80%), MSI (15-20%) và CIMP. Nội dung phân tích cấu trúc, chức năng sinh học của gen KRAS (NST số 12, 6 exon, 45.691 bp) và gen BRAF (NST số 7, 18 exon, 2478 bp, 766 acid amin); chi tiết hóa cơ chế hoạt động của phức hợp 4 protein MMR; mô tả bệnh học hội chứng Lynch, hội chứng giống Lynch, Muir-Torre và Turcot. Chương 1 cũng trình bày nguyên lý các phương pháp xét nghiệm: lai đầu dò đặc hiệu, Real-time PCR, HMMD, PCR phân tích vi vệ tinh và NGS.

Bảng 1: Một số gen chính trong hệ thống MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng

Gen	Vị trí trên NST	Số exon	Số axit amin	Số đột biến đã phát hiện
MLH1	3p21	19	756	> 250
MSH2	2p16	16	934	> 170
MSH6	2p15	10	1360	> 30
PMS2	7p22	15	862	Rất ít

Bảng 2: Một số dạng đột biến phổ biến của gen KRAS tại codon 12 và codon 13

Codon	Dạng biến đổi protein	Dạng biến đổi nucleotid
12	G12D (Gly12Asp)	35G>A
12	G12V (Gly12Val)	35G>T
12	G12C (Gly12Cys)	34G>T
12	G12S (Gly12Ser)	34G>A
12	G12A (Gly12Ala)	35G>C
12	G12R (Gly12Arg)	34G>C
12	G12F (Gly12Phe)	34G>T, 35G>T
12	G12I (Gly12Ile)	34G>A, 35G>T
13	G13D (Gly13Asp)	38G>A
13	G13C (Gly13Cys)	37G>T
13	G13R (Gly13Arg)	37G>C

Bảng 3: Bảng Bethesda phân loại tình trạng mất ổn định vi vệ tinh

Dấu ấn	Đơn vị lặp	Tiêu chuẩn phân tích (5 vị trí)	Kết quả phân loại
BAT25	Mononucleotide	Số dấu ấn bất ổn định ≥ 2 (≥ 30-40%)	MSI-H
BAT26	Mononucleotide	Số dấu ấn bất ổn định = 1 (< 30-40%)	MSI-L
D5S346	Dinucleotide	Số dấu ấn bất ổn định = 0	MSS hoặc MSI-L
D2S123	Dinucleotide	-	-
D17S250	Dinucleotide	-	-

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chọn mẫu trên 218 bệnh nhân tại Bệnh viện Bạch Mai; thiết lập các tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ; chuẩn hóa kỹ thuật HMMD đánh giá 4 protein MMR bằng cơ chất DAB; chuẩn hóa quy trình chạy Real-time PCR phát hiện đột biến KRAS, BRAF trên máy Cobas z 480 của Roche; quy trình giải trình tự gen thế hệ mới NGS trên mẫu máu của nhóm dMMR tìm biến thể dòng mầm MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM; và quy trình tư vấn di truyền dựng cây phả hệ 3 thế hệ.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm:

• Đặc điểm chung: Cơ cấu nhóm tuổi, giới tính, tiền sử bệnh tật bản thân và gia đình; phân loại mô bệnh học khối u; vị trí khối u nguyên phát (đại tràng phải, đại tràng trái, trực tràng), giai đoạn bệnh và tỷ lệ biến chứng tắc ruột.
• Đặc điểm biến dị phân tử: Tỷ lệ đột biến gen KRAS, phân bố các dạng đột biến tại codon 12 và codon 13; tỷ lệ đột biến gen BRAF (chủ yếu là biến thể V600E); tỷ lệ biểu hiện protein MMR, phân loại tỷ lệ pMMR và dMMR. Mô tả chi tiết các dạng mất bộc lộ protein: mất đồng thời MLH1/PMS2, mất đồng thời MSH2/MSH6, mất đơn độc PMS2 hoặc MSH6. Kết quả NGS phát hiện các trường hợp mang biến thể dòng mầm xác định hội chứng Lynch và các ca dMMR không mang đột biến dòng mầm (hội chứng giống Lynch).
• Mối liên quan lâm sàng và mô bệnh học: Phân tích sự tương quan giữa tình trạng đột biến KRAS, BRAF và biểu hiện protein MMR với các yếu tố tuổi, giới tính, vị trí u (u đại tràng phải liên quan rõ với dMMR và BRAF V600E), mức độ biệt hóa mô học và giai đoạn bệnh.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 biện luận các kết quả nghiên cứu:

• Bàn luận về đột biến gen KRAS: Đối chiếu tỷ lệ đột biến exon 2 với các nghiên cứu trong nước (khoảng 44,7% - 48%) và quốc tế (35-50%), khẳng định vai trò dự báo không đáp ứng với thuốc kháng thể đơn dòng kháng EGFR (cetuximab, panitumumab).
• Bàn luận về đột biến BRAF V600E: Phân tích ý nghĩa tiên lượng xấu, liên quan u đại tràng phải và vai trò loại trừ hội chứng Lynch khi u có mất MLH1.
• Bàn luận về tình trạng dMMR và biến thể gen MMR: Biện luận đặc điểm lâm sàng của nhóm bệnh nhân mang hội chứng Lynch (khởi phát sớm, u đại tràng phải, mô bệnh học nhầy); giải thích các trường hợp dMMR không tìm thấy biến thể gen MMR (hội chứng giống Lynch) do cơ chế mất tính dị hợp tử soma kép hoặc methyl hóa vùng vận hành gen MLH1.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về lý luận và thực tiễn:

• Đóng góp về lý luận: Cung cấp số liệu dịch tễ phân tử về tỷ lệ và phổ đột biến gen KRAS (codon 12, 13), gen BRAF (codon 600), tình trạng biểu hiện 4 protein MMR (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) và các biến thể dòng mầm gen MMR/EPCAM trên người bệnh UTĐTT tại Việt Nam. Làm rõ mối tương quan sinh học giữa các chỉ dấu phân tử này với vị trí khối u, mô bệnh học và tiền sử gia đình.
• Đóng góp về thực tiễn: Hoàn thiện quy trình phối hợp từ sàng lọc ban đầu bằng HMMD và Real-time PCR trên mô u, đến tư vấn di truyền, lập phả hệ và giải trình tự gen thế hệ mới NGS trên mẫu máu để chẩn đoán xác định hội chứng Lynch. Kết quả hỗ trợ bác sĩ lâm sàng lựa chọn phác đồ điều trị đích kháng EGFR, chỉ định liệu pháp miễn dịch ức chế điểm kiểm soát cho nhóm dMMR/MSI-H, và thực hiện sàng lọc sớm cho thân nhân người bệnh mang gen đột biến.
• Kiến nghị: Đưa xét nghiệm HMMD đánh giá protein MMR và xét nghiệm đột biến gen KRAS/BRAF vào quy trình thường quy; chỉ định xét nghiệm gen NGS cho các ca dMMR để phát hiện hội chứng Lynch.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Nghiên cứu thực hiện đơn trung tâm tại Bệnh viện Bạch Mai. Một số mẫu bệnh phẩm bị loại trừ do không đủ số lượng tế bào u trên khối nến (< 50 tế bào sống). Tiêu chuẩn loại trừ đối với phân tích di truyền mẫu máu (tiền sử truyền máu trong 4-6 tháng, ung thư huyết học, ghép tế bào gốc) làm hạn chế thu thập trên nhóm bệnh nhân có can thiệp truyền máu trước đó. Chưa tiến hành xét nghiệm khảo sát tình trạng methyl hóa vùng vận hành gen MLH1 trên toàn bộ các ca mất bộc lộ protein MLH1.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng cỡ mẫu đa trung tâm; bổ sung xét nghiệm phân tích methyl hóa vùng vận hành MLH1; nghiên cứu thêm các biến thể gen ngoài MMR như POLE, POLD1; theo dõi sống thêm lâu dài (PFS, OS) của các nhóm bệnh nhân sau điều trị.

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo: Luận án là tài liệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu sinh, học viên sau đại học, bác sĩ lâm sàng và giảng viên thuộc chuyên ngành Y sinh học di truyền, Ung bướu học và Giải phẫu bệnh. Luận án cũng cung cấp cơ sở dữ liệu thực chứng cho các nhà quản lý y tế trong xây dựng quy trình sàng lọc ung thư di truyền.
• Nội dung đáng tham khảo: Quy trình kỹ thuật nhuộm HMMD 4 protein MMR; quy trình Real-time PCR trên hệ thống Cobas z 480; bảng tiêu chuẩn Bethesda đánh giá mất ổn định vi vệ tinh; và bộ câu hỏi thu thập tiền sử gia đình kết hợp lập phả hệ 3 thế hệ để sàng lọc hội chứng Lynch.

Câu hỏi thường gặp

1. Đột biến gen KRAS tập trung ở vị trí nào và có ý nghĩa lâm sàng gì trong điều trị? Các đột biến thay thế nucleotid trên gen KRAS tập trung chủ yếu tại codon 12 (khoảng 82%) và codon 13 (khoảng 17%) thuộc exon 2. Đột biến này làm protein K-Ras duy trì trạng thái hoạt hóa liên tục độc lập với thụ thể EGFR, dẫn đến kháng các kháng thể đơn dòng kháng EGFR như Cetuximab và Panitumumab. Năm 2012, FDA đã chấp thuận chỉ định Cetuximab cho UTĐTT di căn không đột biến KRAS dựa trên thử nghiệm pha III cải thiện thời gian sống thêm toàn bộ từ 4,8 lên 9,5 tháng (p < 0,001).

2. Đột biến gen BRAF V600E có vai trò gì trong phân biệt hội chứng Lynch với ung thư đại trực tràng mắc phải? Đột biến BRAF V600E xảy ra tại codon 600, chiếm hơn 90% đột biến gen BRAF. Sự hiện diện của đột biến BRAF V600E ở khối u mất biểu hiện protein MLH1 chỉ ra khối u thuộc dạng mắc phải (thường do methyl hóa vùng vận hành MLH1) chứ không phải khối u liên quan đến hội chứng Lynch, giúp loại trừ việc xét nghiệm di truyền dòng mầm không cần thiết.

3. Bộ dấu ấn Bethesda đánh giá mất ổn định vi vệ tinh gồm những marker nào và phân loại ra sao? Bảng Bethesda gồm 5 dấu ấn vi vệ tinh: 2 mononucleotide (BAT25, BAT26) và 3 dinucleotide (D5S346, D2S123, D17S250). Kết quả được phân loại: MSI-H khi có từ 2 dấu ấn trở lên bất ổn định (≥ 30-40%); MSI-L khi có 1 dấu ấn bất ổn định (< 30-40%); và MSS khi không có dấu ấn nào thay đổi chiều dài lặp lại (0%).

4. Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định như thế nào trong luận án? Nghiên cứu lấy mẫu toàn bộ thu được 218 người bệnh tại Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/2022 đến tháng 06/2023. Cỡ mẫu này lớn hơn cỡ mẫu tối thiểu 194 người bệnh tính theo công thức ước tính một tỷ lệ của Tổ chức Y tế Thế giới với Z = 1,96 (mức ý nghĩa 5%), sai số d = 0,07 và tỷ lệ đột biến KRAS p = 0,447 lấy từ nghiên cứu của Nguyễn Trọng Hòa và Trịnh Lê Huy.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Bùi Bích Mai đã xác định rõ đặc điểm biến đổi các gen KRAS, BRAF, tình trạng biểu hiện protein MMR và biến thể gen MMR trên 218 người bệnh ung thư đại trực tràng tại Bệnh viện Bạch Mai. Nghiên cứu đã làm sáng tỏ tỷ lệ, phổ đột biến và mối liên quan của các chỉ dấu phân tử với các đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học của khối u. Công trình hoàn thiện quy trình phối hợp giữa kỹ thuật hóa mô miễn dịch, Real-time PCR và giải trình tự gen thế hệ mới, góp phần định hướng liệu pháp điều trị cá thể hóa và phục vụ tư vấn di truyền phát hiện hội chứng Lynch.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Dịch tễ học và cơ chế bệnh sinh trong UTĐTT UTĐTT là ung thư hay gặp nhất trong 5 loại ung thư phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam. Tỷ lệ mắc UTĐTT cao tại các quốc gia phát triển, đặc biệt ở Bắc Mỹ, châu Âu và một số khu vực châu Á, nhưng đang có xu hướng gia tăng tại các quốc gia đang phát triển do sự thay đổi lối sống, chế độ ăn uống, đô thị hóa và già hóa dân số. UTĐTT thường gặp ở độ tuổi trên 50, nhưng xu hướng mắc bệnh ở người trẻ dưới 50 tuổi đang gia tăng trong những năm gần đây.

Các yếu tố nguy cơ bao gồm chế độ ăn giàu chất béo, ít chất xơ, béo phì, lối sống ít vận động, hút thuốc, lạm dụng rượu, tiền sử gia đình và các hội chứng di truyền như Lynch hay Đa polyp tuyến gia đình. Tiêu chuẩn chẩn đoán UTĐTT hiện nay dựa trên sự kết hợp giữa đánh giá lâm sàng, cận lâm sàng và mô bệnh học, cùng với các xét nghiệm hình ảnh và xét nghiệm mức độ phân tử để xác định giai đoạn bệnh cũng như đặc điểm sinh học của bệnh. Từ đó giúp phân tầng người bệnh và cá thể hóa điều trị. Điều trị UTĐTT được thực hiện theo phương pháp đa mô thức, kết hợp nhiều phương pháp nhằm tối ưu hiệu quả và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân.

Vai trò của xét nghiệm sinh học phân tử trong điều trị cũng ngày càng quan trọng để định hướng liệu pháp phù hợp. Việc hiểu về cơ chế bệnh sinh, từ đó có các biện pháp sàng lọc sớm cũng như ứng dụng các tiến bộ trong chẩn đoán, điều trị đã góp phần giảm tỷ lệ tử vong và kéo dài thời gian sống cho người bệnh.6 Khoảng 65% các trường hợp UTĐTT là dạng mắc phải do các đột biến dạng sinh dưỡng (somatic mutation) và di truyền ngoại sinh (epigenetic) và không có tiền sử gia đình hoặc có khuynh hướng mang đột biến gen di truyền. 7 Các trường hợp còn lại là dạng có tính chất gia đình (25%), hội chứng ung thư di 4 truyền (5%), dạng do một số biến thể di truyền độ thấm thấp (<1%) và các biến đổi gen di truyền chưa biết khác.8 Sự phát triển UTĐTT là một quá trình có trật tự trải qua ba giai đoạn chính: bắt đầu, thúc đẩy và tiến triển. Những thay đổi trong cấu trúc hoặc trình tự DNA là yếu tố chính tạo nên giai đoạn khởi đầu, theo sau đó là sự xuất hiện các đột biến sinh dưỡng, sự tăng sinh không kiểm soát đặc trưng cho sự phát triển của khối u.9 Bệnh sinh của UTĐTT chưa được xác định chính xác, nhưng có ít nhất 3 con đường phân tử gây ra khối u ở ĐTT đã được mô tả bao gồm sự mất ổn định của nhiễm sắc thể (Chromosomal instability - CIN) gặp trong khoảng 70-80% UTĐTT liên quan đến tình trạng đột biến các gen KRAS, BRAF., sự mất ổn định vị vệ tinh (Microsatellite instability - MSI) gặp ở 15-20% các trường hợp liên quan đến hệ thống sửa chữa bắt cặp sai DNA (MMR - Mismatch repair) và con đường kiểu hình Methyl hóa đảo CpG (CpG islands DNA methylator phenotype - CIMP).10 Mỗi con đường này được đặc trưng bởi các đặc điểm bệnh lý, cơ chế sinh ung thư và quá trình phát triển khối u riêng biệt.

Các khía cạnh phân tử của những con đường này đã được ứng dụng trên lâm sàng trong chẩn đoán, sàng lọc và quản lý người bệnh UTĐTT. Gen KRAS, BRAF, hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR) và mối liên quan trong UTĐTT 1. Đột biến gen RAS, RAF và mối liên quan trong UTĐTT Gen KRAS và BRAF thuộc nhóm gen tiền ung thư và mã hóa các protein liên quan đến sự truyền tín hiệu nội bào từ các thụ thể của yếu tố tăng trưởng. Trạng thái đột biến của các gen KRAS, BRAF được sử dụng như một yếu tố tiên lượng và đặc biệt là dấu hiệu dự đoán: sự hiện diện của đột biến ở các điểm nóng (hotpot) của bất kỳ gen nào trong số này có liên quan đến khả năng kháng thuốc ức chế thụ thể tyrosine kinase, có nghĩa là người bệnh được hưởng lợi rất 5 ít từ liệu pháp này.11 Hơn nữa, việc phát hiện và định lượng các gen đột biến này qua các tế bào u tuần hoàn trong máu (CTC- circulating tumor cells) cho phép theo dõi không xâm lấn đáp ứng với điều trị và theo dõi tái phát trong thời gian thực.1: Con đường tín hiệu nội bào qua gen RAS và RAF13 1.

Gen KRAS và mối liên quan trong UTĐTT Gen KRAS gồm 6 exon, có chiều dài khoảng 45.691 bp, nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 12. Gen này mã hóa cho protein K-Ras, một phân tử tham gia vào quá trình truyền tín hiệu nội bào xuôi dòng từ thụ thể EGFR. Protein K-Ras có hoạt tính kinase đóng vai trò trung gian trong việc dẫn truyền tín hiệu từ các thụ thể màng tế bào đến các đích nội bào thông qua chuỗi tín hiệu RAS–MAPK. Trong điều kiện sinh lý bình thường, nồng độ Ras-GTP được điều hòa chặt chẽ nhờ sự phối hợp hoạt động giữa hai yếu tố GEFs (guanine nucleotide exchange factors) và GAPs (GTPase-activating proteins).

Khi gen KRAS bị đột biến, protein Ras được tạo ra có khả năng kháng lại hoạt tính GTPase của GAPs. Dù vẫn có thể gắn với GAP, nhưng protein Ras đột biến không thể thủy phân GTP, dẫn đến việc duy trì trạng thái hoạt hóa kéo dài. Sự hoạt hóa liên tục này khiến các con đường tín hiệu xuôi 6 dòng của Ras được kích hoạt vĩnh viễn, không phụ thuộc vào tín hiệu từ EGFR. Điều này giải thích vì sao liệu pháp nhắm trúng đích EGFR không hiệu quả ở các trường hợp có đột biến gen KRAS khi protein Ras đã tự động hoạt hóa không còn chịu sự điều khiển của EGFR.14 Theo thống kê, đến nay đã ghi nhận hơn 3.000 đột biến điểm trên gen KRAS.

Trong đó, các đột biến thay thế nucleotid tại codon 12 (chiếm khoảng 82%) và codon 13 (chiếm khoảng 17%) thuộc exon 2 là những dạng phổ biến nhất. Các đột biến tại codon 12 và 13 của gen KRAS đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiến triển của ung thư, đồng thời làm gia tăng nguy cơ kháng với các thuốc ức chế EGFR trong điều trị khối u.1: Một số dạng đột biến của gen KRAS 15 Codon Dạng biến đổi protein Dạng biến đổi nucleotid G12D (Gly12Asp) 35G>A G12V (Gly12Val) 35G>T G12C (Gly12Cys) 34G>T G12S (Gly12Ser) 34G>A 12 G12A (Gly12Ala) 35G>C G12R (Gly12Arg) 34G>C G12F (Gly12Phe) 34G>T, 35G>T G12I (Gly12IIe) 34G>A, 35G>T G13D (Gly13Asp) 38G>A 13 G13C (Gly13Cys) 37G>T G13R (Gly13Arg) 37G>C (Chú thích : Gly - Glycine, Asp - Aspartic acid, Val- Valine, Cys - Cysteine, Ser - Serine, Ala - Alanine, Arg - Arginine, Phe - Phenylalanine, IIe - Isoleucine) Dưới đây là hình ảnh minh họa con đường tín hiệu Ras : (Hình 1.2) 7 Nguyên bào sợi liên quan đến ung thư Các tế bào viêm Tín hiệu Shh, TGF-β,. Tế bào T và B Các phân tử được tiết ra Tế bào myeloid Sống sót Tăng sinh Cytokine Ác tính Tín hiệu GM-CSF,. Con đường tín hiệu Ras16 Gen RAS là một dấu ấn sinh học quan trọng giúp các bác sĩ lựa chọn chiến lược điều trị phù hợp cho người bệnh UTĐTT.

Ở người bệnh mang kiểu gen KRAS không đột biến, việc điều trị bằng thuốc kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) như Cetuximab (Erbitux) hoặc Panitumumab (Vectibix) thường mang lại hiệu quả cao hơn do tín hiệu tăng trưởng của tế bào ung thư vẫn phụ thuộc vào sự hoạt hóa của EGFR. Phân họ RAS bao gồm khoảng 30 protein là các protein cấu trúc hoặc các GTPase (Guanosine triphosphatase) nhỏ, chủ yếu điều hòa sự tăng sinh tế bào. Tuy nhiên, chỉ có ba thành viên KRAS, NRAS và HRAS là có tầm quan trọng và ý nghĩa lâm sàng trong bệnh cảnh ung thư. Đột biến các gen này đã được xác định ở nhiều loại khối u.

Trong các khối u rắn như UTĐTT, phổi và tụy, đột biến gen KRAS xảy ra thường xuyên hơn so với gen NRAS. Tuy nhiên sự ngược lại được quan sát thấy ở một số bệnh lý huyết học như bệnh bạch cầu lympho cấp tính/ mạn tính và bệnh Hodgkin.17 30% -50% người bệnh UTĐTT có đột biến gen KRAS. Đột biến HRAS không có ý nghĩa trong 8 UTĐTT. Trong một nghiên cứu lớn liên quan đến người bệnh UTĐTT giai đoạn II và III, người ta đã chứng minh rằng đột biến KRAS không có giá trị tiên đoán trong việc đánh giá tổng thể và tỷ lệ sống sót không tái phát ở nhóm người bệnh này.18 Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã gợi ý rằng đột biến KRAS như là dấu hiệu tiên lượng.

Sự có mặt của các đột biến kích hoạt trên gen KRAS và NRAS là dấu hiệu cho thấy sự không nhạy cảm với liệu pháp kháng EGFR, đặc biệt là nhóm thuốc kháng thể đơn dòng nhắm vào EGFR như cetuximab, panitumumab.19 Cũng như vậy, một số thử nghiệm ngẫu nhiên giai đoạn II/III đã cho thấy tác động thuận lợi đến khả năng sống sót khi sử dụng một trong hai kháng thể kháng EGFR là cetuximab và panitumumab ở những người bệnh có kiểu gen KRAS không đột biến.20 Năm 2012, FDA đã chấp thuận chỉ định Cetuximab điều trị UTĐTT di căn không có đột biến KRAS. Một thử nghiệm pha III trên 394 người bệnh UTĐTT so sánh hai nhánh điều trị cetuximab kết hợp với chăm sóc hỗ trợ và chỉ nhận chăm sóc hỗ trợ đã chứng minh khả năng sống sót chung được cải thiện (trung bình 9, 5 so với 4,8 tháng; P < 0,001) và tỷ lệ sống không tiến triển (trung bình 3,7 tháng so với 1,9 tháng; P < 0,001) ở những người dùng cetuximab có kiểu gen KRAS không đột biến. Sự vắng mặt các đột biến ở KRAS và NRAS không thể hiện sự nhạy cảm với liệu pháp kháng thể đơn dòng, nhưng sự hiện diện các đột biến có thể dự đoán chính xác tình trạng thiếu đáp ứng với liệu pháp này. Thật vậy, những người bệnh có KRAS đột biến cho thấy không có lợi ích đáng kể khi điều trị cetuximab so với chỉ chăm sóc hỗ trợ.21 Dữ liệu từ các thử nghiệm này chứng minh rõ ràng rằng những người bệnh có KRAS đột biến khó được hưởng lợi từ liệu pháp kháng thể kháng EGFR.

Bên cạnh đó, không rõ liệu người bệnh không có đột biến KRAS có chắc chắn sẽ đáp ứng hay không tuy nhiên họ có cơ hội cao hơn để nhận được lợi ích lâm sàng từ liệu pháp này. Do đó việc điều trị bằng cetuximab và panitumumab chỉ nên được thực hiện sau khi kết quả về tình trạng đột biến của gen KRAS và NRAS vì những bằng chứng đã trình bày ở trên.