Nghiên cứu về tác động của việc nhai trầu đối với quá trình hấp thụ khói thuốc có chứa acrolein

Tài liệu nghiên cứu Luận văn the effect of betel quid chewing on the absorption of cigarette smoke containing acrolein, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Nguyễn Thị Mai Chi
• Người hướng dẫn: Prof. Tsung - Yun Liu
• Trường học: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
• Chuyên ngành: Environmental Science and Management
• Đề tài: Ảnh Hưởng Của Việc Nhai Trầu Đến Hấp Thụ Khói Thuốc Chứa Acrolein
• Loại tài liệu: bachelor thesis
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thai Nguyen

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• ABSTRACT
• LIST OF TABLES
• LIST OF ABBREVIATIONS
• 1. PART I - INTRODUCTION
• 1.1. Background and rationale
• 1.2. Research’s Objectives
• 1.3. Research question and hypotheses
• 1.4. Limitations
• 2. PART II - LITERATURE REVIEW
• 2.1. Physical and Chemical Properties of Acrolein
• 2.2. Source of Acrolein
• 2.3. Acrolein Metabolite
• 2.4. Toxicity of Acolein
• 2.5. Environmental standard of Acrolein
• 2.6. Acrolein effects on human beings
• 2.7. Acrolein effects on animals
• 2.8. Acrolein effects on organisms in the environment
• 2.9. The trends and health risks of chewing betel quid and smoking cigarette in Taiwan
• 2.10. Liquid chromatography / Tandem mass spectrometry (LC / MS / MS) and operational mechanism
• 3. PART III - MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Time and Location
• 3.2. Adjust the dilution of the urine (Creatinine)
• 3.3. Preparing and loading samples to measure levels 3-HPMA
• 3.4. Listed of chemical compounds used in this study
• 3.5. Listed of Equipment used in this study
• 4. PART IV - RESULT AND DISCUSSION
• 4.1. Some characteristics of cigarette smokers in Kaohsiung
• 4.2. The identifying of sample chromatogram obtained with standard substance upon LC-MS / MS analysis
• 4.3. Effects of smoking cigarette and chewing betel quid to levels of 3-HPMA
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Nhai trầu và hấp thụ khói thuốc chứa acrolein

Nghiên cứu này tập trung vào ảnh hưởng của việc nhai trầu đến hấp thụ khói thuốc chứa acrolein, một chất độc hại có trong khói thuốc lá. Acrolein là một aldehyde không bão hòa, có tính phản ứng cao và gây kích ứng đường hô hấp. Nghiên cứu chỉ ra rằng việc nhai trầu làm tăng độ kiềm trong khoang miệng, từ đó có thể tăng cường hấp thụ acrolein khi hút thuốc. Điều này được chứng minh qua việc đo lường nồng độ 3-HPMA, một chất chuyển hóa của acrolein, trong nước tiểu của những người hút thuốc có và không nhai trầu.

1.1. Cơ chế hấp thụ acrolein

Acrolein trong khói thuốc lá có thể được hấp thụ qua niêm mạc miệng và đường hô hấp. Việc nhai trầu làm tăng độ pH trong nước bọt, tạo điều kiện thuận lợi cho hấp thụ acrolein do pKa của acrolein khoảng 9.6. Nghiên cứu sử dụng LC-MS/MS để đo lường 3-HPMA trong nước tiểu, cho thấy nồng độ chất này cao hơn đáng kể ở nhóm vừa hút thuốc vừa nhai trầu so với nhóm chỉ hút thuốc.

1.2. Tác động của nhai trầu đến sức khỏe

Nhai trầu không chỉ làm tăng hấp thụ acrolein mà còn liên quan đến nhiều nguy cơ sức khỏe khác, đặc biệt là ung thư khoang miệng. Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc hiểu rõ tác hại của nhai trầu và khói thuốc chứa acrolein đối với sức khỏe con người, đặc biệt là ở những khu vực có tỷ lệ nhai trầu và hút thuốc cao như Đài Loan.

II. Acrolein và tác động đến sức khỏe

Acrolein là một hóa chất độc hại có trong khói thuốc lá, khí thải công nghiệp và thực phẩm chế biến ở nhiệt độ cao. Nó gây ra nhiều tác động tiêu cực đến sức khỏe, bao gồm kích ứng đường hô hấp, tổn thương tế bào và tăng nguy cơ ung thư. Nghiên cứu này sử dụng 3-HPMA như một chất chỉ thị sinh học để đánh giá mức độ phơi nhiễm acrolein, cho thấy sự gia tăng đáng kể ở những người vừa hút thuốc vừa nhai trầu.

2.1. Tác động của acrolein đến cơ thể

Acrolein có khả năng phản ứng cao với các phân tử sinh học, gây tổn thương DNA và protein. Nó cũng là nguyên nhân gây ra viêm đường hô hấp và tổn thương phổi ở những người hút thuốc lá lâu năm. Nghiên cứu này nhấn mạnh rằng acrolein không chỉ có trong khói thuốc mà còn được tìm thấy trong môi trường sống, làm tăng nguy cơ phơi nhiễm cho con người.

2.2. Phương pháp đo lường acrolein

Nghiên cứu sử dụng LC-MS/MS và HPLC để đo lường 3-HPMA, một chất chuyển hóa ổn định của acrolein trong nước tiểu. Phương pháp này cho phép đánh giá chính xác mức độ phơi nhiễm acrolein mà không cần xâm lấn, mang lại giá trị thực tiễn cao trong việc giám sát sức khỏe cộng đồng.

III. Nghiên cứu y học và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp bằng chứng khoa học về ảnh hưởng của nhai trầu đến hấp thụ khói thuốc chứa acrolein mà còn mở ra hướng tiếp cận mới trong việc đánh giá nguy cơ sức khỏe liên quan đến thuốc lá và trầu cau. Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong các chương trình giáo dục sức khỏe và chính sách phòng chống thuốc lá tại các khu vực có tỷ lệ nhai trầu cao.

3.1. Giá trị của nghiên cứu

Nghiên cứu này đóng góp quan trọng vào việc hiểu rõ tác động của acrolein và nhai trầu đến sức khỏe con người. Việc sử dụng 3-HPMA như một chất chỉ thị sinh học giúp đơn giản hóa quá trình đánh giá phơi nhiễm acrolein, từ đó hỗ trợ các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để thiết kế các chương trình can thiệp sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là ở những khu vực có tỷ lệ nhai trầu và hút thuốc cao. Ngoài ra, phương pháp đo lường 3-HPMA bằng LC-MS/MS có thể được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu y học và môi trường.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp cử nhân ngành Khoa học và Quản lý Môi trường của tác giả Nguyễn Thị Mai Chi (Khoa Quốc tế, Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên) thực hiện đề tài "The Effect of Betel Quid Chewing on the Absorption of Cigarette Smoke Containing Acrolein" (Ảnh hưởng của việc nhai trầu đến sự hấp thụ khói thuốc lá chứa acrolein). Nghiên cứu được triển khai dưới sự hướng dẫn chuyên môn của Giáo sư Tsung-Yun Liu (Viện Khoa học Sức khỏe Môi trường và Nghề nghiệp, Đại học Quốc lập Dương Minh, Đài Loan) và Tiến sĩ Đỗ Thị Ngọc Oanh (Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên).

Bối cảnh thực tiễn của đề tài xuất phát từ vấn đề ô nhiễm hóa chất độc hại và các thói quen ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe cộng đồng. Acrolein ($CH_2=CHCHO$, CAS 107-02-8) là một aldehyde không bão hòa ($\alpha,\beta$-unsaturated aldehyde), có độc tính cao, dễ bay hơi và phản ứng rất mạnh, được liệt kê trong danh mục hóa chất độc hại bởi Cơ quan Đăng ký Chất độc và Bệnh tật Hoa Kỳ (ATSDR), Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) và Bộ An ninh Nội địa Hoa Kỳ (DHS). Acrolein phát sinh tự nhiên trong quá trình đốt cháy các hợp chất hữu cơ, xuất hiện ở nồng độ từ 3 đến 220 $\mu\text{g}$/điếu trong luồng khói chính và 56 đến 118 $\mu\text{g}$/điếu trong luồng khói phụ của thuốc lá, nồng độ tối đa trong khói thuốc có thể lên tới 90 ppm (so với 0,08 ppm trong không khí môi trường xung quanh).

Tại Đài Loan, sau khi thị trường thuốc lá mở cửa vào năm 1987, lượng tiêu thụ trầu cau bình quân đầu người đã tăng gấp 5 lần trong vòng 15 năm (từ 1,4 kg/người năm 1981 lên 7,0 kg/người năm 1996), kéo theo tỷ lệ tử vong do ung thư khoang miệng tăng gấp 4 lần. Các khảo sát y tế cộng đồng trước đây thường coi hút thuốc lá và nhai trầu là hai vấn đề tách biệt, dù thực tế có tới gần 93% người nhai trầu tại Đài Loan đồng thời là người hút thuốc lá. Về mặt sinh hóa, việc nhai trầu làm tăng mạnh độ kiềm của nước bọt trong khoang miệng, đẩy độ pH từ mức trung tính/kiềm nhẹ thông thường (pH $\approx 7,0$) lên mức kiềm cao từ pH 9 đến 11. Độ kiềm này tạo điều kiện thuận lợi cho việc gia tăng hấp thu acrolein (vốn có hằng số phân ly axit $pK_a \approx 9,6$) vào cơ thể người khi hút thuốc; tuy nhiên, cơ chế tương tác và bằng chứng định lượng cụ thể chưa từng được ghi nhận đầy đủ trong các y văn trước đó.

Do acrolein trong cơ thể nhanh chóng liên hợp với glutathione (GSH) và chuyển hóa thành axit 3-hydroxypropyl mercapturic (3-HPMA) đào thải qua nước tiểu một cách bền vững (có thể lưu trữ nhiều tháng ở $-80^\circ\text{C}$), 3-HPMA được chọn làm chất đánh dấu sinh học (biomarker) không xâm lấn để định lượng mức độ hấp thụ acrolein.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Mô tả các đặc điểm nhân khẩu học (giới tính, độ tuổi) của nhóm đối tượng hút thuốc lá và nhai trầu tại thành phố Cao Hùng, Đài Loan.
2. So sánh mức độ nồng độ chất chuyển hóa 3-HPMA trong nước tiểu giữa nhóm người hút thuốc lá có kèm nhai trầu và nhóm người chỉ hút thuốc lá không nhai trầu để kiểm chứng giả thuyết về sự tăng cường hấp thu acrolein.

Câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu

• Câu hỏi nghiên cứu: Nồng độ định lượng của acrolein (thông qua hàm lượng chất chuyển hóa 3-HPMA trong nước tiểu) có sự khác biệt giữa người hút thuốc lá có nhai trầu và người hút thuốc lá không nhai trầu hay không?
• Giả thuyết vô hiệu ($H_0$): Không có sự khác biệt về nồng độ 3-HPMA trong nước tiểu giữa nhóm người hút thuốc lá có nhai trầu và nhóm người hút thuốc lá không nhai trầu.
• Giả thuyết đối ($H_A$): Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về nồng độ 3-HPMA trong nước tiểu giữa nhóm người hút thuốc lá có nhai trầu và nhóm người hút thuốc lá không nhai trầu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: 200 mẫu nước tiểu thu thập từ các tình nguyện viên khỏe mạnh đến khám tại bệnh viện ở thành phố Cao Hùng, miền Nam Đài Loan. Tiêu chí lựa chọn đối tượng gồm: hút từ 10 điếu thuốc/ngày trở lên, duy trì thói quen từ 1 năm trở lên; không có tiền sử nghiện rượu, không lạm dụng chất gây nghiện, không mắc ung thư và không mang thai. Nhóm nhai trầu phải duy trì thói quen nhai từ 8 miếng trầu/ngày trở lên trong thời gian tối thiểu 1 năm.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu và thực nghiệm phân tích được tiến hành trong thời gian 4 tháng, từ tháng 3/2017 đến tháng 7/2017 tại Viện Khoa học Sức khỏe Môi trường và Nghề nghiệp thuộc Đại học Quốc lập Dương Minh (Đài Bắc, Đài Loan).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và độc tính của Acrolein

Acrolein ($C_3H_4O$, khối lượng phân tử 56,064 g/mol) là chất lỏng không màu đến vàng nhạt, điểm sôi 53 °C, điểm nóng chảy $-88$ °C, tỷ trọng 0,839 g/mL, tan tốt trong nước (>10%). Hợp chất có ba nguồn phát sinh chính: ngoại sinh (đốt cháy nhiên liệu hóa thạch, sinh khối, rác thải nhựa và khói thuốc lá), chế độ ăn uống (dầu mỡ thực vật và động vật bị đun quá nhiệt $>180$ °C trong các bếp ăn công nghiệp) và nội sinh (chuyển hóa polyamine bởi amine oxidase, thoái hóa threonine bởi enzyme myeloperoxidase của bạch cầu trung tính, peroxy hóa lipid màng tế bào PUFA, hoặc chuyển hóa từ thuốc điều trị ung thư cyclophosphamide).

Chỉ tiêu / Ngưỡng tiếp xúc	Giá trị nồng độ	Thời gian tiếp xúc	Tác động sinh học / Tiêu chuẩn
Ngưỡng khứu giác phát hiện	$0,07\text{ mg/m}^3$ ($0,25\text{ ppm}$)	Ngay lập tức	Nhận biết mùi hắc, ngột ngạt
Ngưỡng kích thích thị giác	$0,6\text{ mg/m}^3$	30 phút	Tăng tần suất chớp mắt
Ngưỡng hô hấp cấp tính	$0,7\text{ mg/m}^3$	40 phút	Giảm nhịp thở
Kích thích màng nhầy và mắt	$1,0\text{ mg/m}^3$	5 phút	Chảy nước mắt, kích ứng đường hô hấp
Tổn thương niêm mạc nghiêm trọng	$2,3\text{ mg/m}^3$	Ngắn hạn	Phù nề khí quản, phế quản, khó thở
Tiêu chuẩn nước ngầm (EPA)	$5\text{ }\mu\text{g/L}$ (ppb)	Quy chuẩn	Giới hạn định lượng thực tế (PQL)
Tiêu chuẩn nước mặt nước ngọt (EPA)	$6,1\text{ }\mu\text{g/L}$ (ppb)	Quy chuẩn	Bảo vệ sức khỏe con người
Tiêu chuẩn nước mặn (EPA)	$9\text{ }\mu\text{g/L}$ (ppb)	Quy chuẩn	Bảo vệ sức khỏe con người
Tiêu chuẩn xử lý đất (EPA)	$0,5\text{ mg/kg}$	Quy chuẩn	Hít phải ($0,5\text{ mg}$), nuốt/qua da ($39\text{ mg}$)

Quy trình chuẩn bị mẫu và kỹ thuật phân tích

Để đánh giá chính xác nồng độ 3-HPMA và loại trừ sự sai lệch do mức độ cô đặc hoặc pha loãng của nước tiểu, mẫu được phân tích nồng độ Creatinine để hiệu chỉnh:

1. Phân tích Creatinine: Nước tiểu rã đông được pha loãng 200 lần bằng nước khử ion và phân tích trực tiếp trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò tử ngoại UV. Đường chuẩn Creatinine được xác lập theo phương trình tuyến tính $y = 0,0615x$ (với $y$ là diện tích pic và $x$ là nồng độ creatinine).
2. Chiết xuất pha rắn (SPE) làm giàu 3-HPMA: Sử dụng cột chiết Isolute ENV+ (Biotage). Cột được hoạt hóa tuần tự bằng 6 mL methanol, 6 mL nước khử ion và 6 mL axit formic 0,1% trong nước. Nạp 2 mL mẫu nước tiểu đã thêm 200 ng chất chuẩn nội đồng vị $[d_3]\text{-3-HPMA}$ (N-Acetyl-$d_3$-S-(3-hydroxypropyl)cysteine), hòa cùng 2 mL dung dịch đệm ammonium formate 50 mM và 40 $\mu\text{L}$ axit formic đậm đặc. Rửa cột hai lần với 3 mL axit formic 0,1%, tiếp theo là 1,5 mL hỗn hợp methanol 10% / axit formic 0,1% 90% (pH 2,5). Làm khô cột bằng khí nitơ ($N_2$) và rửa giải bằng 3 lần 2,5 mL dung dịch methanol chứa 2% axit formic. Dịch rửa giải được làm bay hơi khô bằng thiết bị cô quay chân không và hòa tan lại trong 1 mL axit formic 0,1%.
3. Thiết bị và thông số LC-MS/MS: Hệ thống sắc ký lỏng Agilent 1100 series (bơm 4 kênh G1311A, bộ khử khí chân không G1322A, bộ lấy mẫu tự động G1313A) kết hợp đầu dò khối phổ ba tứ cực Finnigan TSQ Quantum Discovery MAX (Thermo Electron) nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) chế độ ion âm. Cột phân tích Thermo Hypersil GOLD aQ C18 ($2,1\text{ mm} \times 150\text{ mm}$, kích thước hạt $3\text{ }\mu\text{m}$).
   • Pha động gồm: (A) nước + 0,1% axit formic và (B) acetonitrile + 0,1% axit formic với chương trình gradient: 0 phút (0% B), 6 phút (95% B), 6,5 phút (0% B), 12 phút (0% B).
   • Chế độ giám sát đa phản ứng (MRM): 3-HPMA được theo dõi ở các bước chuyển ion $m/z\text{ }220,1 \rightarrow 91$ (thế va chạm 5V) và $m/z\text{ }220,1 \rightarrow 89$ (thế va chạm 15V). Chuẩn nội $[d_3]\text{-3-HPMA}$ theo dõi ở $m/z\text{ }223 \rightarrow 91$ (5V) và $m/z\text{ }223 \rightarrow 89$ (15V). Nhiệt độ khí ESI 325 °C, lưu lượng khí 8 L/phút, áp suất phun 40 psi, nhiệt độ khí bao (sheath gas) 250 °C, thế mao quản 4000V, thế đầu phun 3700V. Đường chuẩn 3-HPMA được xây dựng với công thức $y = 0,021x$.

Phương pháp phân tích thống kê

Dữ liệu sinh học không tuân theo phân phối chuẩn, do đó tác giả sử dụng kiểm định phi tham số Wilcoxon rank-sum test trên phần mềm IBM SPSS Statistics phiên bản 20.0 để so sánh sự khác biệt nồng độ 3-HPMA giữa các nhóm với mức ý nghĩa thống kê được chọn là $p < 0,01$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Giới thiệu (PART I - INTRODUCTION)

Chương mở đầu tập trung làm rõ tính cấp thiết của nghiên cứu, nêu bật độc tính của acrolein, thực trạng lạm dụng thuốc lá và trầu cau tại Đài Loan, cũng như cơ sở sinh hóa học về việc kiềm hóa nước bọt khoang miệng khi nhai trầu (pH từ 9 đến 11) dẫn tới tăng cường hấp thu acrolein ($pK_a \approx 9,6$). Tác giả xác định rõ việc lựa chọn 3-HPMA làm chất chỉ thị sinh học ổn định trong nước tiểu, đặt ra mục tiêu nghiên cứu, câu hỏi khoa học và hệ thống giả thuyết thống kê ($H_0, H_A$).

Phần II: Tổng quan tài liệu (PART II - LITERATURE REVIEW)

Chương tổng quan cung cấp cơ sở dữ liệu toàn diện về acrolein gồm: các tính chất hóa lý cơ bản; các nguồn phát thải (ngoại sinh từ công nghiệp, đốt sinh khối, khói thuốc lá; nội sinh từ quá trình oxy hóa sinh học; và từ chế biến thực phẩm nhiệt độ cao); con đường liên hợp với GSH tạo thành 3-HPMA; các tiêu chuẩn bảo vệ môi trường của EPA; các ảnh hưởng độc tính cấp và mạn tính trên cơ thể người (kích ứng niêm mạc, tổn thương DNA, stress oxy hóa, suy giảm chức năng ty thể), trên động vật thí nghiệm và sinh vật thủy sinh. Đồng thời, chương này phân tích sâu xu hướng dịch tễ học và rủi ro sức khỏe của thói quen nhai trầu kết hợp hút thuốc lá tại Đài Loan (dẫn chứng từ khảo sát NHIS 2001 và số liệu Tobacco Control 2005), cũng như nguyên lý vận hành chi tiết của hệ thống LC-MS/MS ba tứ cực.

Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (PART III - MATERIALS AND METHODS)

Chương này mô tả chi tiết địa điểm và thời gian thực hiện nghiên cứu (4 tháng tại Viện Khoa học Sức khỏe Môi trường và Nghề nghiệp thuộc Đại học Quốc lập Dương Minh); các tiêu chuẩn tuyển chọn và bảo quản 200 mẫu nước tiểu thu thập tại bệnh viện Cao Hùng; danh mục hóa chất chuẩn độ tinh khiết phân tích (methanol LC-MS grade, acetonitrile LC-MS grade, formic acid 98%, muối chuẩn 3-HPMA và $[d_3]\text{-3-HPMA}$ từ Toronto Research Chemicals); hệ thống trang thiết bị thí nghiệm; các bước chiết SPE trên cột Isolute ENV+; phương pháp phân tích creatinine hiệu chỉnh độ pha loãng nước tiểu; việc xây dựng đường chuẩn và phương pháp xử lý số liệu phi tham số Wilcoxon rank-sum test trên phần mềm IBM SPSS Statistics 20.

Phần IV: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (PART IV - RESULT AND DISCUSSION)

Chương kết quả và thảo luận trình bày ba nội dung trọng tâm:

• Phân tích nhân khẩu học: Trong 200 đối tượng khảo sát có 181 nam giới (90,5%) và 19 nữ giới (9,5%). Tỷ lệ hút thuốc lá có nhai trầu chiếm 53% ($n=106$), tỷ lệ hút thuốc không nhai trầu chiếm 47% ($n=94$). Ở nam giới, thói quen hút thuốc và nhai trầu tập trung chủ yếu ở độ tuổi 30–59 (chiếm 87,2% nhóm nam nhai trầu). Ở nữ giới, độ tuổi tập trung trẻ hơn, từ 20–49 tuổi (chiếm 91,7% nhóm nữ nhai trầu).
• Kiểm chứng sắc ký đồ LC-MS/MS: Sắc ký đồ của mẫu nước tiểu thực tế và chuẩn nội $[d_3]\text{-3-HPMA}$ đều xuất hiện pic đơn sắc nét tại cùng thời gian lưu (retention time) xấp xỉ 5,3 phút, xác nhận độ đặc hiệu và độ tin cậy của quy trình phân tích.
• Định lượng và so sánh nồng độ 3-HPMA: Nồng độ 3-HPMA chưa hiệu chỉnh ở nhóm vừa hút thuốc vừa nhai trầu đạt trung bình 3555 ng/mL ($\text{SD} = 5125$), cao hơn gấp 3,45 lần so với nhóm chỉ hút thuốc (1030 ng/mL, $\text{SD} = 1521$). Sau khi hiệu chỉnh theo nồng độ creatinine, nhóm vừa hút thuốc vừa nhai trầu có nồng độ 3-HPMA/creatinine đạt 1,97 ng/$\mu\text{g}$, cao hơn có ý nghĩa thống kê ($p < 0,01$, p-value = 0,000) so với nhóm chỉ hút thuốc lá.

Phần V: Kết luận và định hướng (PART V - CONCLUSION AND DIRECTION)

Tác giả đúc kết lại các phát hiện chính của nghiên cứu: xác nhận thói quen nhai trầu làm kiềm hóa nước bọt và thúc đẩy sự hấp thu acrolein từ khói thuốc lá vào cơ thể; phân hóa đặc điểm nhân khẩu học theo giới tính và độ tuổi tại Cao Hùng; đồng thời đưa ra các cảnh báo y tế công cộng về nguy cơ ung thư khoang miệng đối với các nhóm đối tượng này.

---

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm chính

Nghiên cứu đã thu thập và phân tích thực nghiệm trên 200 đối tượng tại Cao Hùng, đem lại các dữ liệu định lượng cụ thể:

Nhóm đối tượng nghiên cứu	Số mẫu ($n$)	Nồng độ 3-HPMA trung bình (ng/mL)	Nồng độ Creatinine trung bình ($\mu\text{g/mL}$)	3-HPMA/Creatinine hiệu chỉnh (ng/$\mu\text{g}$ hoặc ng/g)	Ý nghĩa thống kê ($p$-value)
Hút thuốc lá CÓ nhai trầu	106	$3555 \pm 5125$	$1674 \pm 1179$	1,97	$p < 0,01$ ($p = 0,000$)
Hút thuốc lá KHÔNG nhai trầu	94	$1030 \pm 1521$	$683 \pm 631$	1,10 (hoặc 1,06 / 1,91)	Đối chứng
Chỉ nhai trầu (nghiên cứu Viện IEOHS)	12	1992	-	0,40	-
Bệnh nhân ung thư khoang miệng	-	-	-	1,43 (hoặc 1,54)	Mốc so sánh nguy cơ

So sánh nồng độ 3-HPMA/Creatinine hiệu chỉnh giữa các nhóm:
- Nhóm hút thuốc + nhai trầu (n=106): 1,97 ng/µg
- Nhóm chỉ hút thuốc (n=94):         1,10 ng/µg
- Bệnh nhân ung thư khoang miệng:    1,43 ng/µg
- Nhóm chỉ nhai trầu (n=12):         0,40 ng/µg

Khi phân tích phân vị, mức phân vị thứ 75 (75th percentile) về nồng độ 3-HPMA/creatinine của nhóm người vừa hút thuốc vừa nhai trầu đạt tới 2,13 ng/$\mu\text{g}$, vượt xa mức trung bình của bệnh nhân ung thư khoang miệng (1,43 ng/$\mu\text{g}$). Điều này chỉ ra rằng có tới 75% số người vừa hút thuốc vừa nhai trầu trong mẫu khảo sát nằm ở ngưỡng có rủi ro sinh học rất cao đối với ung thư khoang miệng.

Kiến nghị và đóng góp của tác giả

• Đóng góp học thuật: Đề tài là nghiên cứu đầu tiên cung cấp bằng chứng thực nghiệm sinh hóa trực tiếp chứng minh giả thuyết: thói quen nhai trầu làm tăng độ kiềm trong khoang miệng (pH 9–11), từ đó thúc đẩy sự hấp thu acrolein có trong khói thuốc lá vào cơ thể thông qua chỉ thị sinh học 3-HPMA trong nước tiểu.
• Kiến nghị y tế công cộng: Cơ quan Quản lý Y tế Cao Hùng và các tổ chức y tế cần tích hợp chương trình tuyên truyền tác hại kết hợp giữa hút thuốc và nhai trầu thay vì xem xét tách rời. Cần tập trung truyền thông cảnh báo nguy cơ ung thư khoang miệng nhắm trực tiếp vào nhóm nam giới từ 30 đến 59 tuổi và nhóm nữ giới từ 20 đến 49 tuổi có thói quen kết hợp này.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Tác giả tự nhìn nhận dung lượng mẫu khảo sát của đề tài còn ở mức hạn chế ($n=200$), dẫn tới độ bao quát và độ tin cậy đại diện cho toàn bộ quần thể chưa đạt mức tối đa. Ngoài ra, việc thu thập mẫu tập trung tại khu vực bệnh viện ở thành phố Cao Hùng nên chưa bao hàm hết các nhóm dân cư ở các vùng miền khác nhau của Đài Loan.
• Hướng nghiên cứu mở rộng: Mở rộng quy mô cỡ mẫu lớn hơn ở nhiều địa phương; nghiên cứu sâu hơn về mối quan hệ động học giữa số lượng miếng trầu nhai, số lượng điếu thuốc hút mỗi ngày với tốc độ hấp thu và bài tiết acrolein theo thời gian; đánh giá tác động kết hợp của acrolein và các hợp chất kiềm/arecoline trong trầu cau lên các tổn thương tiền ung thư niêm mạc miệng.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo dành cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các ngành Khoa học Môi trường, Quản lý Môi trường, Độc chất học Môi trường, Y tế Công cộng, Dịch tễ học và Hóa học Phân tích.
• Cán bộ nghiên cứu phân tích sắc ký: Khóa luận cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về việc ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn SPE (cột Isolute ENV+) kết hợp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS chế độ ion âm ESI, chuyển khối MRM) để định lượng vết chất chuyển hóa mercapturic acid trong nền mẫu sinh học phức tạp (nước tiểu người).
• Nhà hoạch định chính sách y tế và môi trường: Cung cấp số liệu dịch tễ học và bằng chứng khoa học phục vụ công tác xây dựng chính sách phòng chống tác hại thuốc lá và kiểm soát tục nhai trầu.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại chọn 3-HPMA trong nước tiểu thay vì trực tiếp đo nồng độ Acrolein?

Acrolein ($CH_2=CHCHO$) là một phân tử nhỏ có tính phản ứng cực kỳ mạnh, dễ bay hơi và tồn tại rất ngắn trong cơ thể trước khi liên hợp với glutathione (GSH). Việc định lượng trực tiếp acrolein đòi hỏi các kỹ thuật dẫn xuất hóa phức tạp hoặc phân tích miễn dịch khó khăn. Ngược lại, axit 3-hydroxypropyl mercapturic (3-HPMA) là chất chuyển hóa đặc hiệu chính của acrolein được đào thải qua nước tiểu, có cấu trúc hóa học rất bền vững (giữ nguyên nồng độ trong nhiều tháng khi bảo quản ở $-80^\circ\text{C}$), cho phép lấy mẫu không xâm lấn và phản ánh chính xác lượng acrolein cơ thể đã hấp thụ.

2. Cơ chế nào giải thích việc nhai trầu làm tăng khả năng hấp thu Acrolein từ khói thuốc lá?

Nước bọt của người bình thường có tính kiềm nhẹ với độ pH khoảng 7,0. Khi nhai trầu cau, vôi tôi và các thành phần trong miếng trầu làm kiềm hóa mạnh khoang miệng, khiến độ pH của nước bọt tăng lên mức từ 9 đến 11. Hợp chất acrolein trong khói thuốc lá có hằng số phân ly axit $pK_a \approx 9,6$. Môi trường kiềm hóa mạnh này tạo điều kiện tối ưu để acrolein hòa tan, thẩm thấu và hấp thu nhanh chóng qua niêm mạc miệng vào tuần hoàn máu trước khi chuyển hóa và đào thải qua thận.

3. Tiêu chuẩn lựa chọn tình nguyện viên tham gia nghiên cứu gồm những gì?

Các tình nguyện viên tham gia nghiên cứu tại Cao Hùng phải đạt các tiêu chí bắt buộc: hút $\ge 10$ điếu thuốc/ngày, duy trì thói quen $\ge 1$ năm; không có tiền sử nghiện rượu, không sử dụng chất gây nghiện, không được chẩn đoán mắc bệnh ung thư và không mang thai. Đối với nhóm hút thuốc có nhai trầu, đối tượng phải có thêm thói quen nhai $\ge 8$ miếng trầu/ngày và duy trì liên tục $\ge 1$ năm tính đến thời điểm lấy mẫu.

4. Kết quả định lượng nồng độ 3-HPMA giữa hai nhóm đối tượng có sự chênh lệch ra sao?

Phân tích LC-MS/MS cho thấy nồng độ 3-HPMA trung bình ở nhóm hút thuốc lá có nhai trầu ($n=106$) là 3555 ng/mL, trong khi nhóm hút thuốc không nhai trầu ($n=94$) chỉ là 1030 ng/mL. Sau khi chuẩn hóa theo nồng độ creatinine trong nước tiểu, nhóm nhai trầu kết hợp hút thuốc đạt 1,97 ng/$\mu\text{g}$ creatinine, cao hơn đáng kể so với nhóm chỉ hút thuốc lá với mức ý nghĩa thống kê cao ($p < 0,01$, $p = 0,000$).

5. Tác giả đã sử dụng thiết bị và thông số khối phổ nào để định lượng 3-HPMA?

Tác giả sử dụng hệ thống sắc ký lỏng Agilent 1100 series kết hợp đầu dò khối phổ ba tứ cực Finnigan TSQ Quantum Discovery MAX (Thermo Electron) sử dụng nguồn ion hóa phun điện tử ion âm (negative ESI), cột tách Thermo Hypersil GOLD aQ C18 ($2,1 \times 150\text{ mm}$, $3\text{ }\mu\text{m}$). 3-HPMA được định lượng qua chế độ MRM với các bước chuyển ion $m/z\text{ }220,1 \rightarrow 91$ (5V) và $m/z\text{ }220,1 \rightarrow 89$ (15V), kết hợp đối chiếu với chuẩn nội đánh dấu đồng vị $[d_3]\text{-3-HPMA}$ ở các bước chuyển $m/z\text{ }223 \rightarrow 91$ (5V) và $m/z\text{ }223 \rightarrow 89$ (15V).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Mai Chi đã chứng minh thành công mối liên hệ sinh hóa thực nghiệm giữa thói quen nhai trầu và sự gia tăng hấp thu acrolein từ khói thuốc lá vào cơ thể người thông qua chỉ thị sinh học 3-HPMA trong nước tiểu ($p < 0,01$). Nghiên cứu chỉ ra rằng môi trường kiềm hóa mạnh của nước bọt do nhai trầu tạo điều kiện thuận lợi cho acrolein hấp thu, dẫn tới nồng độ chất chuyển hóa độc hại ở nhóm kết hợp hai thói quen này vượt qua ngưỡng của bệnh nhân ung thư khoang miệng. Các phát hiện cung cấp luận cứ khoa học quan trọng cho việc định hình các chương trình truyền thông can thiệp y tế công cộng có mục tiêu tại Đài Loan và các quốc gia có tập quán tương đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY NGUYEN THI MAI CHI TOPIC TITLE: THE EFFECT OF BETEL QUID CHEWING ON THE ABSORPTION OF CIGARETTE SMOKE CONTAINING ACROLEIN BARCHELOR THESIS Study Mode: Full-time Major: Environmental Science and Management Faculty: International Programs Office Batch: 2013 - 2017 Thai Nguyen, 20/11/2017 n DOCUMENTATION PAGE WITH ABSTRACT Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Degree Program Bachelor of Environmental Science and Management Student name Nguyen Thi Mai Chi Student ID DTN1353070121 Thesis Title THE EFFECT OF BETEL QUID CHEWING ON THE ABSORPTION OF CIGARETTE SMOKE CONTAINING ACROLEIN Supervisors Prof. Tsung - Yun Liu Dr. Do Thi Ngoc Oanh Abstract: Acrolein, a highly reactive, unsaturated aldehyde and respiratory irritant, is formed during combustion (e., cigarette smoke), high-temperature cooking of foods, and in vivo as a product of oxidative stress and polyamine metabolism. 3-Hydroxypropyl mercapturic acid (3-HPMA) is the main metabolite of acrolein in urine.

Previous studies demonstrated that betel quid can enhance the alkalinity of oral cavity, and might enhance the additional absorption of acrolein(pKa is about 9. However, this has not been shown in literature. This study is designed to describe some characteristics of cigarette smokers in Kaohsiung and test the hypothesis that chewing betel quid will facilitate the absorption of acrolein while smoking cigarette by comparing the level of urinary 3-HPMA in cigarette-smokers with and without betel quid chewing. Urine samples were obtained from healthy volunteers in Kaohsiung, which is located in the southern part of Taiwan.

Urinary 3-HPMA and creatinine were analyzed by LC-MS/MS and HPLC with UV detector, respectively. The results showed that the level of 3-HPMA in cigarette-smokers who chewing betel quid (1.97 ng/ g creatinine) was significant higher (p<0.01) than i n cigarette-smokers without chewing betel quid (1. People in Kaohsiung smoking cigarette and chewing betel quid concentrate in males from 30 to 59-year-old and females from 20 to 49-year-old. This study concluded that the higher level of urinary 3-HPMA in cigarette-smoker who chewing betel quid might be related to the high alkalinity in oral saliva, which facilitate the absorption of cigarette smoke containing acrolein.

Keywords: Acrolein; 3-Hydroxypropyl mercapturic acid (3-HPMA); LC- MS/MS; Toxicity; Cigarette smoke; Betel quid. Number of pages: Date of 20/09/2017 Submission: n ACKNOWLEDGEMENT First and foremost, I would like to express my deepest gratitude and special thanks to School Leadership and teachers at International Training and Development Center - Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry those imparted for me the knowledge as well as facilitating learning and help me during the learning process in university. I would like to express my deepest appreciation to my supervisor: Professor. Tsung - Yun Liu of National Yang Ming University Institude of Environtmental and Occupational Health Science - who offered me a warm welcome, guided me wholeheartedly and gave me the best suggestions, explanations, conditions, for complete this study.

In addition, I would like to thank Dr. Do Thi Ngoc Oanh of Department of Agronomy- Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry, for her supervision, encouragement, advice, and guidance in writing this thesis. I gratefully acknowledge Mr. Chih - Hung Hu, Mr.

Han - Xing Zou for his help and provided me with the knowledge to use the equipment and guide me during the practice. I wish to thank all the professor National Yang Ming University Institude of Environtmental and Occupational Health Science for their warm welcome and their interesting seminars. My sincere thanks also go to all my classmates – K45 AEP for along with me and helping me finish the study. n Special thanks to Mr Ngo Tuan Hung, Dao Thanh Huyen, Ngan Thi Thu Uyen, Do Van Binh, Kieu Manh Tuan and Taiwanese brothers and sisters in Institute of Environmental & Occupational Health Sciences, all the people who helped me when I stayed in National Yang Ming Univesity, Taiwan.

It was a beautiful time and I really appreciate it. Finally, I would like to thank my family, to my grandparents for their love and supporting me. Many thanks! Nguyễn Thị Mai Chi n TABLE OF CONTENTS LIST OF TABLES. ix LIST OF ABBREVIATIONS.

Background and rationale. Research question and hypotheses. 4 PART II - LITERATURE REVIEW. Physical and Chemical Properties of Acrolein.

Source of Acrolein. Toxicity of Acolein. Environmental standard of Acrolein. Acrolein effects on human beings.

Acrolein effects on animals. Acrolein effects on organisms in the environment. The trends and health risks of chewing betel quid and smoking cigarette in Taiwan. Liquid chromatography / Tandem mass spectrometry (LC / MS / MS) and operational mechanism.

17 PART III - MATERIALS AND METHODS. Time and Location. Adjust the dilution of the urine (Creatinine). Preparing and loading samples to measure levels 3-HPMA.

Listed of chemical compounds used in this study. Listed of Equipment used in this study. 26 PART IV - RESULT AND DISCUSSION. Some characteristics of cigarette smokers in Kaohsiung.

The identifying of sample chromatogram obtained with standard substance upon LC-MS / MS analysis. Effects of smoking cigarette and chewing betel quid to levels of 3-HPMA. 49 n LIST OF FIGURES Figure 3.1: Standard curve of 3-HPMA .2: The chromatograms of 3-HPMA levels in urine .1: The characteristics of cigarette smokers with-and without chewing betel quid of Kaohsiung population .2: The characteristics of using cigarette by gender of Kaohsiung population .3: Compare the percentage of gender between cigarette smokers with- and without chewing betel quid. Chromatograms of standard substance [d3]3-HPMA and 3-HPMA obtained in urine .5: Percentile of 3-HPMA levels in urine of cigarette smokers with - and without chewing betel quid.

37 viii n LIST OF TABLES Table 2. Physical and Chemical Properties of Acrolein .2: Thresholds for the acute effects of acrolein in human beings.1: The characteristics of using cigarette and betel quid by age of Kaohsiung population. 3-HPMA levels of cigarette smokers with –and without chewing betel quid .Effects of smoking cigarette with chewing betel quid on the risk of oral cancer. 35 ix n LIST OF ABBREVIATIONS 1.

ATSDR - Agency for Toxic Substances and Disease Registry 2. EPA - Environmental Protection Agency 3. DHS - Department of Homeland Security 4. 3-HPMA - 3-Hydroxypropyl mercapturic acid 5.

HPLC - High-performance liquid chromatography 6. LC/MS/MS - Liquid chromatography/mass spectrometry tandem mass spectrometer 7. GSH - Glutathione-associated cells 8. (d3)-3-HPMA - N-Acetyl-d3-S-(3-hydroxypropyl) cysteine, standard substance x n PART I - INTRODUCTION 1.

Background and rationale According to Toxicological Profile for Acrolein given by Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR), Department of Homeland Security (DHS) and Environmental Protection Agency (EPA), Acrolein (CAS 107-02-8) was listed as a high toxicity chemical with recommendations on levels of exposure in the environment, food, and water (Toxicological Profile for Acrolein, 2007). In 1839, Berzelius named acrolein, the thermal degradation product of glycerin was characterized as an aldehyde, acrolein is a contraction of ‘acrid’ (referring to its pungent smell) and ‘oleum’ (oil or oil-like consistency) (Berzelius, 1839). In recent years for the industries, acrolein is used as an initial material for acrylate polymers and in the production of acrylic acid, plastics, and technical chemicals. In agriculture, it is known as the herbicide (Stevens & Maier, 2008; Toxicological Profile for Acrolein, 2007).

Environmentally, acrolein exists naturally in food and is formed during the burning of organic matter. Therefore, acrolein is found in all types of smoke including cigarette smoke, in exhaust gases from internal combustion engines, and in superheated cooking oil where there is serious human toxicity (Beauchamp et al. In vivo, acrolein is a metabolite of the anti - cancer drug cyclophosphamide and has been found to be formed from threonine by myeloperoxidase neutrophils at inflammatory sites (Beauchamp et al. Acrolein is a small molecule that is extremely reactive and volatile.

Normally, acrolein is not significant quantity until reaching the smoke phase (Alwis et al. It is estimated to be from 0.08 ppm in ambient air, however, detected at a maximum of 90 ppm in cigarette smoke (Beauchamp et al. Acrolein is a component of cigarette smoke which is known to accumulate in the respiratory system after acute nasal exposure (Tully et al. Long - term cigarette smoking results in significant systemic accumulation of acrolein in humans (Carmella et al.

After the cigarette market opened in Taiwan in 1987, the per capita consumption of betel quid, which has increased by fivefold in 15 years, from 1.4 kg in 1981 to 7. For those 15 years, oral cancer mortality increased fourfold in this country (Wen et al. The doubts began to pose about the relationship of betel quid and cigarette in Taiwan where public health professionals and health professionals have long considered betel to chew and smoke are two separate problems. Betel quid chewing will increase the alkalinity of the saliva, the pH can reach 9 to 11, while healthy saliva is slightly alkaline at a pH 7.

This alkalinity will facilitates the absorption of acrolein with pKa approximately 9.6 (Kaye, 1973); however, this has not been documented in literature. Previous studies have confirmed analysis a potential surrogate marker for acrolein quantification is 3-hydroxypropyl mercapturic acid (3-HPMA) which is a specific and stable metabolite of acrolein in urine (Zheng et al. In contrast to acrolein, 3-HPMA is notably stable in urine, it remains stable for months if stored in −80°C freezer (Moghe et al. Therefore, in this experiment, 3-HPMA, a 2 n typical metabolite of acrolein, was chosen as the analytical object.

3-HPMA data has become increasingly popular as a biomarker to maintain human health because the noninvasive nature of measuring urinary 3-HPMA allows long-term monitoring of cigarette smoke containing acrolein. Investigation on the absorption of acrolein in urine has been performed by liquid chromatography/ Tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) of reverse - phase high-performance liquid chromatography (HPLC). This is the basic techique in conducing “The Effect of Betel Quid Chewing on The Absorption of Cigarette Smoke Containing Acrolein” 1. Research’s Objectives The aim of this study was to compare the level of urinary 3-HPMA in cigarette smokers with – and without chewing betel quid and describe some characteristics of cigarette smokers in Kaohsiung.

Research question and hypotheses 1. Research question: - Does the quantitation of acrolein, in term of urinary 3-HPMA, different between cigarette smokers with – and without chewing betel quid? 2. Hypothesis: - HO (Null Hypothesis): The quantitation of acrolein,in term of urinary 3- HPMA, does not different between cigarette smokers with – and without chewing betel quid. - HA (Alternative Hypothesis): The quantitation of acrolein,in term of urinary 3 n 3-HPMA, different between cigarette smokers with – and without chewing betel quid.

Limitations In this survey, due to the low number of samples, the reliability was not high. 4 n PART II - LITERATURE REVIEW 2. Physical and Chemical Properties of Acrolein Table 2. Physical and Chemical Properties of Acrolein Appearance Colorless to yellow liquid.

Colorless gas in smoke. Boiling point 53 °C (127 °F; 326 K) CAS Registry Number 107-02-8 Chemical Name Acrolein Chemical Formula CH2=CHCHO or C3H4O Acraldehyde, Acrylaldehyde, Acrylic aldehyde, Allyl Common Synonyms aldehyde, Ethylene aldehyde, 2-Propenal Density 0.839 g/mL Molecular Weight 56.064 g/mol Melting point −88 °C (−126 °F; 185 K) pH 6.0 Solubility in water Appreciable (> 10%) Structural Formula Specific Gravity 0. Trade names include aqualin, aqualine, biocide, magnacide, magnacide B, and Slimicide (Ghilarducci & Tjeerdema, 1995). At room temperature, Acrolein is a clear, colorless to straw - colored liquid with a pungent, suffocating odor (ACGIH, 1991).

Most people began to smell acrolein in the air at a concentration of 0.25 parts acrolein per million parts air (ppm). It burns and burns easily in the air and highly flammable and burns to produce toxic gases (peroxides, and oxides of carbon) (ATSDR, 2007). Acrolein is volatile, producing toxic concentrations at room temperature. It changes into steam faster than water at normal temperature.

The change of acrolein from liquid to steam becomes faster as the temperature rises.