Luận văn: Biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú

Nghiên cứu về biến đổi số lượng ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú. Khám phá tiềm năng của ADN ti thể như một dấu ấn sinh học trong chẩn đoán bệnh.

• Tác giả: Nguyễn Hồng Nhung
• Người hướng dẫn: PGS. Trịnh Hồng Thái
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. ADN ti thể là gì và vai trò trong chẩn đoán ung thư vú

ADN ti thể (mtADN) là vật chất di truyền có trong ti thể, một cơ quan quan trọng của tế bào có chức năng sản xuất năng lượng. Khác với ADN nhân (nADN), ADN ti thể được di truyền chủ yếu qua đường mẹ và tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào. Đặc biệt, ADN ti thể chứa những đặc điểm sinh học quan trọng có thể phản ánh tình trạng bệnh lý của cơ thể. Trong bối cảnh chẩn đoán ung thư vú, việc nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể đã mở ra một hướng đi mới và rất hứa hẹn. Các nhà nghiên cứu phát hiện rằng bệnh nhân ung thư vú thường có sự thay đổi đáng kể trong mức độ ADN ti thể so với mô bình thường, điều này có thể được sử dụng như một dấu ấn sinh học hỗ trợ chẩn đoán sớm và đánh giá tiên lượng bệnh.

1.1. Cấu trúc và chức năng của ADN ti thể

ADN ti thể là một phân tử DNA vòng tròn chứa khoảng 16.569 cặp bazơ với 37 gen. Những gen này mã hóa cho các protein cần thiết cho quá trình sản xuất năng lượng ATP. ADN ti thể cũng chứa các vùng điều hòa quan trọng ảnh hưởng đến biểu hiện gen. Sự bất thường trong cấu trúc ADN ti thể hoặc số lượng bản sao có thể dẫn đến suy giảm chức năng năng lượng, làm tăng nguy cơ phát triển các bệnh ung thư.

1.2. Vai trò của ADN ti thể trong tế bào ung thư

Các tế bào ung thư có nhu cầu năng lượng cực lớn để duy trì sự phân chia nhanh chóng. ADN ti thể đóng vai trò then chốt trong việc điều hòa quá trình apoptosis (cơ chế tự sát tế bào). Khi ADN ti thể bất thường, tế bào ung thư có thể tránh thoát được cơ chế chết tự nhiên này, từ đó tạo điều kiện cho sự phát triển và lan rộng của ung thư vú.

II. Phương pháp nghiên cứu biến đổi ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú

Để phát hiện và đo lường biến đổi ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú, các nhà khoa học sử dụng nhiều kỹ thuật hiện đại. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ mạnh mẽ cho phép nhân đôi các đoạn ADN ti thể cụ thể từ mẫu mô, giúp xác định chính xác số lượng bản sao. Phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) cung cấp thông tin chi tiết về thành phần hóa học của ADN ti thể. Kết hợp với điện di gel polyacrylamide, các nhà nghiên cứu có thể phân tách và phân tích các phân tử ADN theo kích thước. Ngoài ra, kỹ thuật định lượng theo thời gian thực (qPCR) giúp đo lường chính xác tỷ số giữa số lượng ADN ti thể và gen tham chiếu như ACTB, từ đó phát hiện những biến đổi tinh tế có liên quan đến ung thư vú.

2.1. Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phát hiện ADN ti thể

PCR là phương pháp sao chép ADN ti thể hàng triệu lần từ một mẫu mô nhỏ. Quy trình gồm ba bước lặp lại: biến tính (94°C), gắn mồi (50-65°C) và tổng hợp (72°C). Bằng cách sử dụng các mồi (primer) đặc hiệu nhắm vào các vùng ADN ti thể, kỹ thuật này cho phép phát hiện các đoạn ADN có liên quan đến sự thay đổi bệnh lý trong ung thư vú.

2.2. Phân tích định lượng tỷ số mt ACTB

Tỷ số mt/ACTB biểu thị mức độ ADN ti thể so với gen tham chiếu ACTB trên ADN nhân. Tỷ số này cho phép so sánh mức độ ADN ti thể giữa các mẫu khác nhau một cách khách quan. Kết quả cho thấy bệnh nhân ung thư vú thường có tỷ số mt/ACTB cao hơn so với bệnh nhân u xơ vú, đây có thể là một dấu ấn sinh học quan trọng.

III. Biến đổi ADN ti thể như dấu ấn chẩn đoán ung thư vú

Các nghiên cứu gần đây cho thấy biến đổi số lượng ADN ti thể có thể được sử dụng làm dấu ấn sinh học để phân biệt giữa mô ung thư vú và mô bình thường. Những bệnh nhân có ung thư vú thường biểu hiện mức độ ADN ti thể cao hơn trong tế bào ung thư so với tế bào xơ vú lành tính. Sự khác biệt này có thể liên quan đến nhu cầu năng lượng tăng cao của các tế bào ung thư và sự thích ứng của chúng với điều kiện thiếu oxy trong khối u. Ngoài ra, biến đổi ADN ti thể cũng có mối liên hệ với các đặc điểm bệnh lý của ung thư như giai đoạn, độ mô học và độc lập với các yếu tố khác. Điều này cho thấy ADN ti thể có tiềm năng trở thành một chỉ số chẩn đoán độc lập và có giá trị tiên lượng cao trong ung thư vú, hỗ trợ các bác sĩ trong việc phát hiện sớm và đánh giá tính chất ác tính của u.

3.1. Sự khác biệt ADN ti thể giữa mô ung thư và mô bình thường

Các mẫu mô ung thư vú cho thấy mức độ ADN ti thể cao đáng kể so với mô xơ vú bình thường và mô u xơ (fibroadenoma). ADN ti thể tăng cao này phản ánh nhu cầu về sản xuất năng lượng của các tế bào ung thư phát triển nhanh chóng. Sự phân biệt rõ ràng này giúp tạo ra một tiêu chí khách quan cho chẩn đoán ung thư vú và giảm thiểu sai số trong quá trình đánh giá mô bệnh phẩm.

3.2. Mối liên hệ ADN ti thể với đặc điểm bệnh học

Nghiên cứu cho thấy mức độ ADN ti thể có tương quan với giai đoạn TNM (Tumor, Node, Metastasis) và độ mô học (Bloom-Richardson grade) của ung thư vú. Bệnh nhân có ADN ti thể cao hơn thường có khả năng tiên lượng xấu hơn, phản ánh tính ác tính cao của u. Điều này cho thấy ADN ti thể có thể được sử dụng như một chỉ marker độc lập để dự đoán diễn tiến bệnh.

IV. Tương lai và ứng dụng lâm sàng của ADN ti thể trong chẩn đoán ung thư vú

Khám phá về ADN ti thể mở ra những triển vọng mới trong chẩn đoán và điều trị ung thư vú. Trong tương lai, ADN ti thể có thể được đưa vào các xét nghiệm lâm sàng thường quy để hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư vú, đặc biệt là ở những bệnh nhân có nguy cơ cao. Kết hợp ADN ti thể với các dấu ấn sinh học khác như các gen ung thư (BRCA1, BRCA2) hoặc các protein (HER2, ER, PR) có thể nâng cao độ chính xác của chẩn đoán. Ngoài ra, ADN ti thể cũng có tiềm năng trong việc dự đoán đáp ứng với liệu pháp và giám sát tái phát bệnh. Việc phát triển các kỹ thuật định lượng ADN ti thể đơn giản, nhanh chóng và chi phí thấp sẽ giúp phổ biến rộng rãi ứng dụng này trong các phòng khám lâm sàng, đặc biệt là ở các quốc gia đang phát triển. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu lâm sàng quy mô lớn để xác nhận và tiêu chuẩn hóa việc sử dụng ADN ti thể như một công cụ chẩn đoán chính thức trong ung thư vú.

4.1. Tích hợp ADN ti thể với các dấu ấn sinh học khác

ADN ti thể không nên được sử dụng đơn lẻ mà cần được kết hợp với các dấu ấn sinh học khác như gen BRCA1/2, HER2, hormone receptor. Sự kết hợp này tạo ra một hồ sơ sinh học toàn diện giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác hơn. Phương pháp phân tích đa tham số sẽ cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của chẩn đoán ung thư vú.

4.2. Phát triển công nghệ định lượng ADN ti thể trong lâm sàng

Để tạo điều kiện cho việc ứng dụng rộng rãi ADN ti thể trong chẩn đoán ung thư vú, cần phát triển các kỹ thuật đơn giản hóa, nhanh chóng và chi phí thấp. Các phương pháp như digital PCR hoặc next-generation sequencing có tiềm năng cung cấp thông tin chi tiết về biến đổi ADN ti thể trong thời gian ngắn. Việc chuẩn hóa quy trình và thiết lập giá trị cắt sẽ giúp ADN ti thể trở thành một công cụ lâm sàng tin cậy.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu, AGA và AGG không mã hóa cho arginine mà là bộ 3 kết thúc [20]. Chức năng chính của ti thể Năng lượng và quá trình trao đổi chất Chức năng quan trọng nhất và đặc trƣng nhất của ti thể là sản xuất adenosine triphosphate (ATP) thông qua quá trình phosphoryl oxy hóa, đƣợc thực hiện bởi một loạt các phức hợp protein, đƣợc gọi chung là chuỗi hô hấp, đƣợc mã hóa bởi cả nADN và mtADN. Chuỗi hô hấp hoàn chỉnh chứa ít nhất 87 polypeptide, 13 trong số đó là mã hóa bởi mtADN. Do đó, phần lớn các tiểu phần của chuỗi hô hấp mã hóa trong nhân và đƣợc đƣa vào ti thể sau khi đƣợc dịch mã trong nhân và đƣa ra bàotƣơng.

Phosphoryl oxy hóa là một quá trình sinh hóa độc đáo đƣợc tạo ra từ sự phối hợp chặt chẽ của các protein sản phẩm từ hai bộ gen riêng biệt (nhân và ti thể). Tuy nhiên, quá trình này không phải là cách duy nhất để tạo ra năng lƣợng cho tế bào. Đƣờng phân cũng có thể tạo ra ATP và cung cấp cơ chế thay thế khi quá trình phosphoryl oxy hóa trở nên kém hiệu quả do chuỗi hô hấp có khiếm khuyết. Khi các electron đƣợc vận chuyển thông qua chuỗi hô hấp trong quá trình hô hấp của ti thể, một số electron có thể trốn khỏi hoặc rò rỉ từ các phức hợp vận chuyển electron và phản ứng với oxy phân tử hình thành các gốc superoxide (O*2-).

Dòng chảy electron này xảy ra chủ yếu tại khu phức hợp I và III [27]. Do vậy một đột biến mtADN nhất định có thể gây ra sự thay đổi các thành phần vận chuyển điện tử và tạo ra các gốc superoxide, sau đó chuyển đổi thành các dạng gốc oxy hóa tự do (ROS). Các đột biến mtADN và sự gia tăng quá trình oxy hóa đã đƣợc quan sát thấy trong các loại tế bào ung thƣ khác nhau ở nhiều nghiên cứu độc lập [9]. Tuy nhiên, liên hệ trực tiếp giữa đột biến mtADN và sự gia tăng hình thành ROS trong các tế bào ung thƣ vẫn chƣa đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm.

Ti thể đóng vai trò điều tiết các cơ chế trung gian quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate, axid amin và axid béo. Chu trình acid tricarboxylic trong chất nền của ti thể là một ví dụ điển hình của một con đƣờng sinh hóa đòi hỏi nhiều cơ chế trung gian quan trọng [13]. Một phần chính của chu trình urê cũng xảy ra trong ti thể, nơi xảy ra quá trình xử lý các axid amin trung gian có chứa nitơ. Axit béo đƣợc chia nhỏ thành các đơn vị hai carbon bởi một loạt các β-oxy hóa và tiếp 5 tục xử lý để acetyl CoA trong chất nền của ti thể.

Nhƣ vậy, chức năng chính của ti thể là tạo 6 ATP qua quá trình phosphoryl oxy hóa không phải là thiết yếu, ti thể lại không thể thiếu để các tế bào nhân chuẩn tham gia vào các quá trình trao đổi chất quan trọng khác, điều này giải thích tại sao trong một số tế bào có mất đoạn mtADN, lƣợng ti thể vẫn đƣợc duy trì mà không có các đoạn mtADN mã hóa các protein trong chuỗi hô hấp [12]. Apoptosis và sự tồn tại của tế bào Ti thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis, một quá trình sinh học cơ bản của các tế bào chết theo chƣơng trình có kiểm soát. Một số nDNA mã hóa protein tham gia quá trình apoptosis bao gồm cytochrome c, yếu tố cảm ứng apoptosis (AIF), endonuclease G, và Smac/DIABLO đƣợc dự trữ trong ti thể. Khi những yếu tố protein này đƣợc giải phóng khỏi ti thể, chúng sẽ tạo ra một loạt phản ứng các sinh hóa để kích hoạt những tín hiệu của thác apoptois.

Đặc điểm nổi bật của sự khơi mào apoptosis là sự hoạt hóa caspase (một họ proteaza) bởi cytochrome c và apaf-1 với sự có mặt của ATP hoặc dATP [17]. Quá trình chuyển AIF từ ti thể tới nhân để gây apoptosis độc lập với caspase [26]. Quá trình apoptosis đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển bệnh ung thƣ và đáp trả lại tín hiệu của các tác nhân chống ung thƣ. Tuy nhiên, vai trò chính xác của đột biến mtDNA trong phản ứng chết theo chƣơng trình của tế bào để đáp trả lại tín hiệu của các tác nhân chống ung thƣ vẫn chƣa đƣợc xác định.

Những biến đổi ti thể và bệnh ung thƣ Khiếm khuyết chức năng ti thể từ lâu đã đƣợc cho là đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và tiến triển của ung thƣ. Hơn 70 năm trƣớc, Warburg tiên phong nghiên cứu sự biến đổi trong quá trình hô hấp của ti thể với bệnh ung thƣ và đề xuất cơ chế để giải thích ảnh hƣởng của ti thể trong quá trình gây ung thƣ. Ông đƣa ra giả thuyết rằng một sự kiện then chốt trong ung thƣ liên quan đến sự phát triển tổn thƣơng của bộ máy hô hấp, dẫn đến tăng sản xuất ATP trong quá trình đƣờng phân [34]. Cuối cùng, các tế bào ác tính sẽ đáp ứng nhu cầu năng lƣợng bằng cách sản xuất một phần lớn ATP thông qua quá trình đƣờng phân chứ không phải thông qua sự phosphoryl oxy hóa.

Do hiệu suất của quá trình đƣờng phân thấp, điều này có thể giải 7 thích phần nào các tế bào ác tính có nhu cầu tiêu thụ glucose lớn để đáp ứng nhu cầu năng lƣợng. Điều này trái ngƣợc với các tế bào bình thƣờng, ƣu tiên sử dụng quá trình phosphoryl oxy hóa tạo ATP với hiệu quả cao. Sự khác biệt về trao đổi năng lƣơng giữa các tế bào bình thƣờng và ung thƣ là một cơ sở sinh hóa để phát triển chiến lƣợc điều trị để tiêu diệt tế bào ung thƣ có chọn lọc. Kể từ khi ấn phẩm đầu tiên của Warburg ra đời hơn nửa thế kỷ trƣớc, đến nay nhiều khiếm khuyết của ti thể liên quan đến ung thƣ đã đƣợc xác định và mô tả.

Những khiếm khuyết này bao gồm các thay đổi trong biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp và các enzym đƣờng phân và đột biến mtADN [10]. Hầu hết các protein ti thể đƣợc mã hóa bởi ADN nhân (nADN) và đƣa vào ti thể. Mặc dù các quá trình nhân bản của mtADN là không đồng bộ với quá trình nhân bản nADN, số lƣợng tổng thể của ti thể trong mỗi tế bào vẫn tƣơng đối ổn định trong các loại tế bào cụ thể trong quá trình tăng sinh, cho thấy rằng quá trình tạo ti thể quyết định phần lớn bởi các tín hiệu ngoài ti thể. Sự sinh tổng hợp của ti thể có thể tiếp tục ngay cả khi mất mtADN.

Nhƣ vậy, việc nhân bản ti thể không cần sự có mặt của mtADN và không chịu ảnh hƣởng của các đột biến trong mtADN, dẫn đến việc duy trì các khiếm khuyết của ti thể [5]. Đột biến gen ti thể và bệnh ung thư Hầu hết các tế bào của động vật có vú có chứa hàng chục, hàng trăm ti thể, mỗi ti thể lại có chứa 2-10 bản sao mtADN [25]. Trong một cá thể, tất cả các bản sao mtADN thƣờng giống hệt nhau (homoplasmy), nhƣng đột biến có thể phát sinh, duy trì và đƣợc khuếch đại, do đó các bản sao đột biến khác nhau cùng tồn tại với kiểu mtADN ban đầu (heteroplasmy). Khi tế bào phân chia, bộ gen ti thể đƣợc phân bố ngẫu nhiên cho các tế bào con và do đó, mặc dù chỉ bắt đầu từ một trƣờng hợp heteroplasmy nhất định, nhƣng kết quả có thể tồn tại mức độ khác nhau của heteroplasmy và thậm chí có thể homoplasmy mtADN trong dòng tế bào khác nhau [14].

Bộ gen ti thể đƣợc đi truyền theo dòng mẹ; một vài ti thể từ tinh trùng có thể xâm nhập vào trứng trong quá trình thụ tinh sẽ bị loại bỏ bởi cơ chế phụ thuộc ubiquitin. Trong quá trình tạo trứng, chỉ có số lƣợng nhỏ phân tử mtADN đƣợc 8 khuếch đại và truyền tới thế hệ sau con [18]. Hiện tƣợng này giải thích tại sao một đột biến có thể trở thành dạng homoplasmy sau một hoặc một vài thế hệ. Tỷ lệ biến đổi của mtADN nhanh hơn rất nhiều so với bộ gen nhân.

Một trong những nguyên nhân là mtADN không đƣợc bảo vệ bởi protein (histone), thêm vào đó ti thể là nhà máy năng lƣợng của tế bào, nơi xảy ra các quá trình photphoryl oxi hóa và nhiều quá trình sinh hóa khác, các quá trình này tạo ra các gốc oxy hóa tự do ROS nên mtADN rất dễ bị tổn thƣơng. Mặt khác, ti thể lại không có các cơ chế sửa chữa ADN nhƣ nhân, theo một số công bố mtADN đột biến đột biến cao hơn nADN 10- 100 lần [22]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các đột biến và thay đổi trong mtADN đóng một vai trò quan trọng trong một số bệnh nhƣ bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber, bệnh tiểu đƣờng di truyền theo dòng mẹ, hội chứng Leigh [8]. Bên cạnh các bệnh của ti thể là đột biến dòng mầm, các đột biến soma mtADN cũng đƣợc tìm thấy ở nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là ung thƣ.

Với vai trò quan trọng của ti thể trong quá trình chuyển hóa ATP, trong tạo ra các gốc oxy hóa tự do và trong việc điều hòa quá trình apoptosis, đột biến ở mtADN có khả năng ảnh hƣởng đến năng lƣợng tế bào, gây ra tổn thƣơng ADN trung gian qua ROS và làm thay đổi phản ứng của tế bào cảm ứng apoptosis với các tác nhân chống ung thƣ. Ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng minh ảnh hƣởng của đột biến mtADN đối với sự phát triển, di truyền và tiến triển của nhiều bệnh ung thƣ khác nhau. Hơn nữa, tần suất đột biến mtADN cao trong ung thƣ và sự xuất hiện của chúng trong giai đoạn sớm của bệnh có thể là chỉ thị để phát hiện sớm bệnh ung thƣ [19]. Ung thư đại trực tràng: Trong một nghiên cứu đã tiến hành trên mô thƣờng và mô u của 10 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng đã phát hiện 7 trong số 10 bệnh nhân có đột biến soma mtADN.

Các đột biến đƣợc tìm thấy trên các gen 12S rRNA, 16S rRNA, ND1, ND4L, ND5, Cytochrome b, COXI, COXIIvà COXIII [23]. Phần lớn các đột biến là đột biến điểm soma ở vùng D-Loop không mã hóa trong đó A  T và G  C và các đột biến mất đoạn đƣợc phát hiện bằng cách kết hợp 2 phƣơng pháp phân tích sợi đôi tƣơng đồng heteroduplex và phƣơng pháp biến tính sợi đơn (SSCP) [1].