Nghiên cứu chọn chủng virus PRRSV làm nguồn sản xuất vacxin nhược độc tại Việt Nam

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chọn chủng virus PRRSV tại Việt Nam làm nguồn sản xuất vacxin nhược độc, cung cấp giải pháp phòng bệnh PRRS hiệu quả cho lợn.

• Tác giả: Cao Thị Bích Phượng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Bá Hiên
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên cứu chọn chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV) tại Việt Nam để làm nguồn sản xuất vacxin nhược độc
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• Danh sách các chữ viết tắt
• Danh mục bảng
• Danh mục hình
• Trích yếu luận văn
• Thesis abtract
• 1. Phần 1: Tính cấp thiết của đề tài
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 2. Phần 2: Tổng quan tài liệu
• 2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS)
• 2.1.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
• 2.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.1.3. Đặc điểm dịch tễ học
• 2.1.4. Triệu chứng bệnh
• 2.1.5. Chẩn đoán lâm sàng
• 2.1.6. Chẩn đoán phi lâm sàng
• 2.1.7. Phòng bệnh
• 2.2. Tác nhân gây bệnh
• 2.2.1. Hình thái học
• 2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
• 2.2.3. Sức đề kháng
• 3. Phần 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 3.1. Thời gian và địa điểm
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Vật liệu nghiên cứu
• 3.4.1. Sinh phẩm, hóa chất dùng cho tách chiết RNA
• 3.4.2. Cặp mồi và kit PCR
• 3.4.3. Hoá chất thực hiện phản ứng huyết thanh học
• 3.4.4. Tế bào, hóa chất dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus
• 3.4.5. Lợn thí nghiệm
• 3.4.6. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
• 3.4.7. Trang thiết bị
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Phương pháp tách chiết RNA
• 3.5.2. Phản ứng RT-PCR
• 3.5.3. Chạy điện di kiểm tra sự có mặt của virus PRRS
• 3.5.4. Phương pháp phân lập virus PRRS trên tế bào
• 3.5.5. Nghiên cứu tính thích ứng của PRRSV trên tế bào Marc-145
• 3.5.6. Phương pháp xác định hiệu giá virus trên môi trường tế bào
• 3.5.7. Phương pháp phát hiện kháng thể kháng PRRS
• 3.5.8. Phương pháp gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm
• 3.5.9. Phương pháp giải trình tự gen
• 3.5.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. Phần 4: Kết quả và thảo luận
• 4.1. Kết quả thu thập mẫu và triệu chứng bệnh tích
• 4.2. Khả năng gây bệnh tích trên môi trường tế bào MARC-145 của chủng VIRUS KTY-PRRS-06
• 4.3. Kết quả so sánh khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng VIRUS KTY- PRRS-06 cường độc sau khi cấy truyền qua 90 đời
• 4.4. Kết quả xác định hiệu giá Virus (TCID50) của chủng VIRUS KTY- PRRS-06 qua 90 đời cấy truyền
• 4.5. Kết quả xác định quy luật nhân lên của chủng VIRUS KTY-PRRS-06 qua 90 đời cấy truyền
• 4.6. Kiểm tra sự ổn định di truyền giữa các đời VIRUS KTY-PRRS-06
• 4.6.1. Kết quả so sánh tương đồng nucleotide gen ORF5 của các chủng virus KTY-PRRS-06 ở các đời cấy truyền khác nhau
• 4.6.2. Kết quả so sánh tương đồng axit amin của gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy truyền khác nhau
• 4.7. Kết quả xác định khả năng nhược độc hoá của VIRUS KTY-PRRS-06 sau 90 đời cấy truyền
• 4.7.1. Kết quả đo thân nhiệt của lợn sau khi gây nhiễm virus KTY-PRRS-06 sau 90 đời cấy truyền
• 4.7.2. Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của lợn bằng phản ứng ELISA
• 5. Phần 5: Kết luận và đề nghị
• 5.1. Kết luận
• 5.2. Đề nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Vacxin nhược độc PRRS Tổng quan và tầm quan trọng

Vacxin nhược độc PRRS là một giải pháp then chốt trong chiến lược phòng chống bệnh tai xanh ở lợn, một trong những dịch bệnh gây thiệt hại kinh tế nặng nề nhất cho ngành chăn nuôi lợn công nghiệp trên toàn cầu và đặc biệt là tại Việt Nam. Bệnh này, còn được biết đến với tên khoa học là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS), do virus PRRS gây ra, dẫn đến các triệu chứng nghiêm trọng như sảy thai, đẻ non ở lợn nái và viêm phổi nặng ở lợn con. Sự phức tạp của virus, với khả năng biến đổi di truyền liên tục, tạo ra nhiều thách thức trong công tác kiểm soát. Hiện nay, có hai dòng virus chính là chủng Châu Âu (Type 1) và chủng Bắc Mỹ (Type 2), mỗi chủng lại có nhiều biến thể khác nhau. Việc sử dụng vacxin là biện pháp phòng bệnh chủ động và hiệu quả nhất. Trong đó, vacxin sống nhược độc được ưu tiên nghiên cứu và phát triển nhờ khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và toàn diện hơn so với vacxin vô hoạt PRRS. Các vacxin này chứa virus đã được làm yếu đi (nhược độc) thông qua các phương pháp như cấy truyền liên tục trên môi trường tế bào, giúp virus mất khả năng gây bệnh nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên. Khi đưa vào cơ thể, virus nhược độc sẽ nhân lên ở mức độ giới hạn, đủ để kích thích hệ miễn dịch tạo ra cả miễn dịch dịch thể (sản xuất kháng thể kháng PRRS) và miễn dịch qua trung gian tế bào, mang lại hiệu quả bảo hộ cao và kéo dài. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu và tự chủ sản xuất vacxin nhược độc PRRS tại Việt Nam là rất lớn, nhằm tạo ra sản phẩm phù hợp với các chủng PRRS lưu hành tại Việt Nam, giảm sự phụ thuộc vào vacxin nhập ngoại và nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh PRRS một cách bền vững.

1.1. Hiểu đúng về Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus PRRS, một loại virus RNA thuộc họ Arteriviridae, gây ra. Bệnh đặc trưng bởi hai thể lâm sàng chính: rối loạn sinh sản ở lợn nái (sảy thai hàng loạt ở kỳ cuối, tăng tỷ lệ thai chết lưu, lợn con sinh ra yếu ớt) và bệnh lý đường hô hấp ở lợn mọi lứa tuổi, đặc biệt nghiêm trọng ở lợn con và lợn choai (viêm phổi, khó thở). Virus có ái lực cao với các đại thực bào phế nang, tế bào quan trọng của hệ miễn dịch. Bằng cách tấn công và phá hủy các tế bào này, virus làm suy giảm nghiêm trọng sức đề kháng của lợn, mở đường cho các mầm bệnh kế phát như Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma, làm bệnh trầm trọng hơn và tăng tỷ lệ chết.

1.2. Lý do cần phát triển vacxin nội địa cho chăn nuôi Việt Nam

Thực tế cho thấy các vacxin PRRS nhập ngoại, dù được sản xuất theo công nghệ tiên tiến, thường không mang lại hiệu quả bảo hộ như kỳ vọng tại Việt Nam. Nguyên nhân chính là sự khác biệt lớn về kháng nguyên giữa chủng virus trong vacxin (thường là các chủng cổ điển ở Bắc Mỹ hoặc Châu Âu) và các chủng PRRS lưu hành tại Việt Nam, đặc biệt là các chủng virus PRRS độc lực cao. Sự sai khác này dẫn đến hiện tượng bảo hộ chéo thấp, khiến đàn lợn đã tiêm phòng vẫn có nguy cơ mắc bệnh khi tiếp xúc với virus thực địa. Do đó, việc phát triển vacxin nội địa từ chính các chủng virus địa phương đang gây bệnh là một yêu cầu cấp thiết. Một vacxin như vậy sẽ đảm bảo tính tương đồng về kháng nguyên, giúp tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và hiệu quả hơn, là chìa khóa để kiểm soát dịch bệnh PRRS thành công.

1.3. Ưu điểm của vacxin sống nhược độc trong phòng bệnh PRRS

Vacxin sống nhược độc (Modified Live Vaccine - MLV) có nhiều ưu điểm vượt trội so với vacxin vô hoạt trong phòng bệnh do virus. Thứ nhất, vacxin MLV có khả năng kích thích một đáp ứng miễn dịch toàn diện và mạnh mẽ hơn, bao gồm cả miễn dịch dịch thể (tạo kháng thể) và miễn dịch qua trung gian tế bào. Miễn dịch tế bào đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc tiêu diệt các tế bào đã bị nhiễm virus, điều mà vacxin vô hoạt khó làm được. Thứ hai, liều kháng nguyên cần thiết trong vacxin MLV thường thấp hơn và thường chỉ cần tiêm một liều duy nhất để tạo miễn dịch cơ bản. Thứ ba, thời gian bảo hộ của vacxin MLV thường kéo dài hơn. Những ưu điểm này làm cho vacxin sống nhược độc trở thành lựa chọn ưu tiên trong nghiên cứu chọn chủng và sản xuất vacxin phòng bệnh tai xanh ở lợn.

II. Thách thức kiểm soát bệnh tai xanh ở lợn tại Việt Nam

Công tác kiểm soát dịch bệnh PRRS tại Việt Nam đối mặt với vô số thách thức, bắt nguồn từ chính đặc điểm sinh học phức tạp của virus PRRS và thực tiễn ngành chăn nuôi lợn công nghiệp. Kể từ khi dịch bùng phát lần đầu vào năm 2007, bệnh tai xanh ở lợn đã liên tục gây ra những tổn thất kinh tế khổng lồ. Các báo cáo của Cục Thú y qua các năm cho thấy dịch bệnh lây lan nhanh trên diện rộng, với số lợn mắc bệnh và tiêu hủy lên đến hàng trăm nghìn con mỗi đợt dịch lớn. Thách thức lớn nhất đến từ sự đa dạng và biến đổi không ngừng của virus. Các chủng PRRS lưu hành tại Việt Nam thường thuộc dòng Bắc Mỹ và có độc lực rất cao, khác biệt đáng kể so với các chủng virus gốc được dùng để sản xuất vacxin thương mại trên thế giới. Điều này lý giải tại sao nhiều trang trại dù đã tuân thủ nghiêm ngặt quy trình tiêm phòng bằng vacxin nhập ngoại vẫn không thể ngăn chặn được dịch bệnh. Hơn nữa, virus PRRS còn có khả năng gây suy giảm miễn dịch, tạo điều kiện cho các bệnh kế phát bùng phát, làm cho bức tranh dịch tễ thêm phức tạp và việc điều trị trở nên khó khăn. Việc lựa chọn được một chủng virus địa phương phù hợp, có khả năng gây miễn dịch chéo rộng với nhiều biến chủng khác nhau, để từ đó phát triển vacxin nội địa là một bài toán khoa học đầy thách thức nhưng mang tính sống còn đối với ngành chăn nuôi lợn.

2.1. Sự biến đổi của virus PRRS và các chủng virus độc lực cao

Virus PRRS là một virus RNA, vốn có tỷ lệ đột biến tự nhiên rất cao trong quá trình sao chép. Điều này dẫn đến sự hình thành liên tục các biến chủng mới với đặc tính kháng nguyên và độc lực khác nhau. Tại Việt Nam và các nước châu Á, sự xuất hiện của các chủng virus PRRS độc lực cao (Highly Pathogenic PRRSV) đã làm thay đổi hoàn toàn cục diện dịch bệnh. Các chủng này không chỉ gây ra các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích trầm trọng hơn mà còn có khả năng lẩn tránh hệ miễn dịch của vật chủ hiệu quả hơn. Sự đa dạng di truyền này đòi hỏi các chiến lược phòng chống phải linh hoạt và các loại vacxin phải được cập nhật hoặc có khả năng bảo hộ chéo rộng, một yêu cầu mà nhiều vacxin thế hệ cũ không đáp ứng được. Đây là thách thức cốt lõi trong miễn dịch học thú y đối với PRRS.

2.2. Hạn chế của vacxin ngoại nhập trong chăn nuôi lợn công nghiệp

Trong bối cảnh chăn nuôi lợn công nghiệp với mật độ cao, áp lực mầm bệnh rất lớn. Vacxin nhập ngoại, dù chất lượng tốt, thường được phát triển dựa trên các chủng virus PRRS phân lập từ nhiều thập kỷ trước tại Bắc Mỹ hoặc Châu Âu. Khi áp dụng tại Việt Nam, hiệu quả bảo hộ của chúng bị hạn chế do không tương đồng về mặt kháng nguyên với các chủng virus thực địa. Kháng thể được tạo ra sau khi tiêm phòng có thể không nhận diện hoặc trung hòa hiệu quả các chủng PRRS lưu hành tại Việt Nam. Theo nghiên cứu của Cao Thị Bích Phượng (2016), "có một sự sai khác đáng kể về tính kháng nguyên của chủng virus PRRS gây bệnh trên đàn lợn ở Việt Nam với chủng virus PRRS của vacxin nhập ngoại". Điều này dẫn đến tình trạng "vỡ trận" vacxin, gây thiệt hại kinh tế và làm giảm lòng tin của người chăn nuôi vào biện pháp phòng bệnh bằng vacxin.

2.3. Tầm quan trọng chiến lược của việc chọn chủng virus địa phương

Để khắc phục những hạn chế của vacxin ngoại nhập, chiến lược tất yếu là phải nghiên cứu và sản xuất vacxin từ chính chủng virus địa phương. Việc phân lập virus PRRS trực tiếp từ các ổ dịch trong nước giúp xác định chính xác tác nhân gây bệnh đang lưu hành. Từ đó, các nhà khoa học có thể lựa chọn ra những chủng virus có tính kháng nguyên phổ biến, đại diện cho quần thể virus tại địa phương. Việc phát triển một vacxin sống nhược độc từ chủng này sẽ tạo ra một công cụ phòng bệnh "may đo", đảm bảo sự tương đồng kháng nguyên tối đa. Điều này không chỉ nâng cao hiệu quả bảo hộ trực tiếp mà còn góp phần quan trọng vào việc xây dựng một chương trình an toàn sinh học và kiểm soát dịch bệnh PRRS bền vững, mang lại lợi ích lâu dài cho ngành chăn nuôi Việt Nam.

III. Quy trình phân lập và cấy truyền virus PRRS tại Việt Nam

Nền tảng của việc phát triển vacxin nội địa là một quy trình khoa học nghiêm ngặt để phân lập, nuôi cấy và làm thuần khiết chủng virus mục tiêu. Nghiên cứu của Cao Thị Bích Phượng (2016) tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã thực hiện một cách bài bản quy trình này để chọn lọc chủng virus địa phương tiềm năng. Quá trình bắt đầu bằng việc thu thập mẫu bệnh phẩm từ những ổ dịch thực địa. Các mẫu này, thường là phổi và hạch phổi từ lợn có triệu chứng điển hình của bệnh tai xanh ở lợn, được xử lý và kiểm tra sơ bộ bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR để khẳng định sự hiện diện của virus PRRS. Sau khi có kết quả dương tính, bước tiếp theo và cũng là thách thức lớn nhất là phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào. Virus PRRS có tính hướng tế bào rất hẹp, chỉ có thể nhân lên trên một số ít dòng tế bào nhất định. Trong nghiên cứu này, dòng tế bào MARC-145 (một dòng tế bào thận khỉ) đã được sử dụng thành công. Huyễn dịch từ mẫu bệnh phẩm được gây nhiễm vào lớp tế bào MARC-145 và theo dõi hàng ngày dưới kính hiển vi để quan sát bệnh tích tế bào (Cytopathic Effect - CPE), dấu hiệu cho thấy virus đang nhân lên và phá hủy tế bào. Quá trình này được lặp đi lặp lại qua nhiều đời cấy truyền, không chỉ để tăng sinh lượng virus mà còn là bước đầu tiên trong quá trình làm nhược độc virus.

3.1. Phương pháp phân lập virus PRRS từ mẫu bệnh phẩm thực địa

Quy trình phân lập virus PRRS bắt đầu bằng việc lựa chọn và thu thập mẫu bệnh phẩm có chất lượng. Mẫu phổi và hạch phổi được thu từ lợn chết tại một ổ dịch ở Nam Định năm 2015, có biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đặc trưng như sốt cao, tai tím, viêm phổi nặng, hạch lympho sưng to. Các mẫu này được xử lý trong điều kiện vô trùng để tạo thành huyễn dịch 10%. Trước khi nuôi cấy, huyễn dịch được khẳng định dương tính với virus PRRS bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu. Bước này đảm bảo chỉ những mẫu chứa virus mới được đưa vào quy trình phân lập tốn kém và mất thời gian, đồng thời giúp sàng lọc ban đầu. Đây là khâu then chốt, quyết định sự thành công của việc phân lập một chủng virus địa phương thuần khiết.

3.2. Kỹ thuật nuôi cấy virus PRRS trên dòng tế bào MARC 145

Tế bào MARC-145 là một trong số ít những dòng tế bào duy trì có khả năng cho phép virus PRRS (đặc biệt là chủng Bắc Mỹ) nhân lên. Nghiên cứu đã sử dụng dòng tế bào này để nuôi cấy virus. Huyễn dịch mẫu bệnh phẩm sau khi lọc qua màng lọc vô trùng được cho tiếp xúc với lớp đơn tế bào MARC-145 đã phát triển phủ kín đáy bình nuôi cấy. Sau một thời gian ủ để virus xâm nhập, huyễn dịch được loại bỏ và thay thế bằng môi trường nuôi cấy mới. Bình nuôi cấy được giữ trong tủ ấm CO2 ở 37°C và được theo dõi liên tục. Kỹ thuật này đòi hỏi sự tỉ mỉ, tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc, đảm bảo môi trường tối ưu cho virus phát triển và nhân lên.

3.3. Theo dõi và đánh giá bệnh tích tế bào CPE qua các đời

Bệnh tích tế bào (CPE) là những thay đổi về hình thái của tế bào sau khi bị virus xâm nhiễm, có thể quan sát được dưới kính hiển vi soi ngược. Đối với virus PRRS trên tế bào MARC-145, CPE đặc trưng là các tế bào trở nên tròn lại, co cụm, nổi lên và cuối cùng bong tróc khỏi bề mặt nuôi cấy. Trong nghiên cứu, chủng virus được đặt tên KTY-PRRS-06 đã cho thấy khả năng gây CPE nhanh và mạnh. Theo dữ liệu, CPE bắt đầu xuất hiện sau 24 giờ gây nhiễm, và đến 60-72 giờ, toàn bộ lớp tế bào đã bị phá hủy hoàn toàn. Việc theo dõi CPE qua nhiều đời cấy truyền (90 đời) không chỉ để xác nhận sự tồn tại và nhân lên của virus mà còn giúp đánh giá sự thích ứng của virus với môi trường tế bào, một yếu tố quan trọng trong quá trình làm nhược độc virus.

IV. Phương pháp đánh giá và làm nhược độc chủng virus PRRS

Sau khi phân lập thành công, bước quan trọng tiếp theo là làm nhược độc và đánh giá toàn diện các đặc tính sinh học của chủng virus được chọn. Quá trình làm nhược độc virus về cơ bản là một quá trình chọn lọc thích nghi, trong đó virus được cấy truyền liên tục qua nhiều đời trên môi trường tế bào không phải là ký chủ tự nhiên của nó. Nghiên cứu của Cao Thị Bích Phượng (2016) đã cấy truyền chủng KTY-PRRS-06 qua 90 đời trên tế bào MARC-145. Quá trình này giúp virus dần thích nghi với tế bào nuôi cấy và đồng thời mất đi độc lực đối với ký chủ tự nhiên là lợn. Để theo dõi và đánh giá sự thay đổi của virus trong suốt quá trình này, nhiều phương pháp khoa học hiện đại đã được áp dụng. Một trong những phương pháp cốt lõi là giải trình tự gen virus, đặc biệt là gen ORF5. Gen này mã hóa cho glycoprotein GP5, một protein bề mặt chính và là kháng nguyên quan trọng nhất trong việc kích thích tạo kháng thể kháng PRRS trung hòa. Bằng cách so sánh trình tự gen qua các đời cấy truyền, các nhà khoa học có thể đánh giá tính ổn định về mặt di truyền và kháng nguyên của virus. Bên cạnh đó, việc xác định hiệu giá virus (TCID50) và xây dựng đường cong sinh trưởng giúp định lượng nồng độ virus và hiểu rõ quy luật nhân lên của nó trên tế bào, cung cấp dữ liệu quan trọng cho việc tối ưu hóa quy trình sản xuất vacxin nhược độc PRRS trong tương lai.

4.1. Kỹ thuật giải trình tự gen ORF5 để kiểm tra tính ổn định

Kỹ thuật giải trình tự gen virus là công cụ mạnh mẽ để phân tích cấu trúc di truyền của virus ở cấp độ phân tử. Trong nghiên cứu này, đoạn gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-06 ở các đời cấy truyền khác nhau (P#1, P#10, P#40, P#90...) đã được giải trình tự. Mục đích là để kiểm tra xem quá trình cấy truyền kéo dài có gây ra những đột biến lớn, làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của virus hay không. Một chủng virus vacxin lý tưởng cần phải ổn định về mặt di truyền, đảm bảo rằng mỗi lô vacxin sản xuất ra đều có chất lượng đồng nhất. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và axit amin của gen ORF5 sẽ cho thấy mức độ tương đồng giữa các đời, từ đó khẳng định tính ổn định của chủng virus ứng viên.

4.2. Cách xác định hiệu giá virus TCID50 và quy luật nhân lên

Hiệu giá virus (TCID50 - 50% Tissue Culture Infectious Dose) là một chỉ số định lượng, cho biết liều virus thấp nhất có khả năng gây bệnh tích tế bào trên 50% số đơn vị nuôi cấy. Phương pháp này được sử dụng để xác định nồng độ virus trong một mẫu. Trong nghiên cứu, hiệu giá virus KTY-PRRS-06 được đo lường ở các đời cấy truyền khác nhau. Việc theo dõi chỉ số này cho thấy khả năng nhân lên và thích ứng của virus. Một hiệu giá virus cao và ổn định là tiêu chí quan trọng đối với một chủng giống sản xuất vacxin, vì nó quyết định năng suất và hiệu quả kinh tế của quá trình sản xuất. Ngoài ra, việc xây dựng đường cong sinh trưởng bằng cách đo hiệu giá virus ở nhiều thời điểm sau gây nhiễm giúp xác định thời gian tối ưu để thu hoạch virus, khi nồng độ đạt mức cao nhất.

4.3. Đánh giá độc lực của virus sau 90 đời cấy truyền trên lợn

Đây là bước kiểm tra quan trọng nhất để xác nhận quá trình làm nhược độc đã thành công. Virus sau 90 đời cấy truyền (P#90) được tiêm trở lại cho lợn thí nghiệm khỏe mạnh, không có kháng thể với PRRS. Các chỉ tiêu như thân nhiệt, triệu chứng lâm sàng (sốt, bỏ ăn, khó thở...), và bệnh tích sau mổ khám được theo dõi chặt chẽ. Kết quả được so sánh với nhóm lợn nhiễm virus cường độc ban đầu. Nếu virus P#90 không gây ra các triệu chứng bệnh hoặc chỉ gây ra phản ứng rất nhẹ, đồng thời kích thích cơ thể lợn sản sinh kháng thể kháng PRRS (được kiểm tra bằng phương pháp ELISA), thì chủng virus đó được kết luận là đã nhược độc hoàn toàn và an toàn để sử dụng làm vacxin sống nhược độc.

V. Kết quả chọn chủng KTY PRRS 06 cho vacxin nhược độc PRRS

Nghiên cứu của Cao Thị Bích Phượng (2016) đã đạt được những kết quả đột phá trong việc chọn lọc và đánh giá chủng KTY-PRRS-06, một ứng cử viên sáng giá cho việc sản xuất vacxin nhược độc PRRS nội địa. Sau quá trình cấy truyền 90 đời trên tế bào MARC-145, chủng virus này đã thể hiện những đặc tính sinh học ưu việt, đáp ứng đầy đủ các tiêu chí của một chủng giống sản xuất vacxin. Về khả năng phát triển, KTY-PRRS-06 cho thấy sự thích ứng rất tốt với môi trường tế bào. Bệnh tích tế bào (CPE) xuất hiện sớm và phá hủy tế bào nhanh chóng, cho thấy khả năng nhân lên mạnh mẽ. Đáng chú ý, hiệu giá virus (TCID50) có xu hướng tăng dần và đạt mức cao, ổn định từ đời cấy truyền thứ 50 trở đi, đạt tới 5,60 x 10⁶ TCID50/25µl ở đời thứ 90. Đây là một hiệu giá rất lý tưởng, đảm bảo năng suất cao trong sản xuất. Về mặt di truyền, kết quả giải trình tự gen virus ở vùng ORF5 cho thấy sự ổn định vượt trội. Mức độ tương đồng về nucleotide và axit amin giữa các đời cấy truyền rất cao, chứng tỏ chủng virus không bị biến đổi nhiều về mặt kháng nguyên trong suốt quá trình làm nhược độc. Quan trọng nhất, kết quả thử nghiệm hiệu lực vacxin tiềm năng trên lợn đã khẳng định chủng KTY-PRRS-06 ở đời thứ 90 đã được làm nhược độc hoàn toàn, an toàn cho lợn và có khả năng kích thích tạo đáp ứng miễn dịch tốt.

5.1. Đặc điểm sinh học nổi bật của chủng virus KTY PRRS 06

Chủng KTY-PRRS-06 sau 90 đời cấy truyền thể hiện nhiều đặc điểm sinh học quý giá. Thứ nhất, khả năng nhân lên mạnh mẽ trên tế bào MARC-145, với hiệu giá virus cao và ổn định. Cụ thể, hiệu giá virus tăng từ 1,74 x 10⁵ TCID50/25µl ở đời đầu lên đến 5,60 x 10⁶ TCID50/25µl ở đời thứ 90 và ổn định từ đời thứ 50. Thứ hai, thời gian gây bệnh tích tế bào (CPE) được rút ngắn. Từ đời cấy truyền thứ 50, CPE đã xuất hiện chỉ sau 12 giờ gây nhiễm, và phá hủy 100% tế bào sau 48 giờ. Điều này cho phép rút ngắn chu kỳ sản xuất vacxin. Những đặc tính này chứng tỏ KTY-PRRS-06 là một chủng virus địa phương không chỉ phù hợp về mặt kháng nguyên mà còn có tiềm năng lớn về mặt công nghệ sản xuất.

5.2. Phân tích tính ổn định di truyền và kháng nguyên qua 90 đời

Tính ổn định là một trong những yêu cầu khắt khe nhất đối với một chủng sản xuất vacxin. Kết quả phân tích gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy truyền khác nhau cho thấy mức độ tương đồng rất cao. Theo bảng 4.5 và 4.7 của luận văn, mức độ tương đồng về nucleotide dao động từ 98.44% đến 100%, và tương đồng về axit amin là từ 97.33% đến 100%. Những con số này khẳng định rằng cấu trúc kháng nguyên chính của virus (protein GP5) gần như không thay đổi trong suốt quá trình làm nhược độc kéo dài. Sự ổn định di truyền này đảm bảo rằng vacxin sống nhược độc sản xuất từ chủng KTY-PRRS-06 sẽ có tính kháng nguyên đồng nhất và hiệu quả bảo hộ ổn định qua từng lô sản xuất.

5.3. Kết quả thử nghiệm trên lợn An toàn và tạo miễn dịch tốt

Bước cuối cùng và mang tính quyết định là đánh giá độc lực và khả năng sinh miễn dịch trên động vật. Lợn được tiêm chủng virus KTY-PRRS-06 ở đời thứ 90 (P#90) không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng như sốt cao hay các dấu hiệu bệnh lý khác. Hình 4.8 trong nghiên cứu gốc cho thấy thân nhiệt của lợn sau khi tiêm duy trì ở mức ổn định, không khác biệt so với lợn đối chứng. Ngược lại, phân tích huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA (Hình 4.8) cho thấy hiệu giá kháng thể kháng PRRS tăng cao và bền vững sau khi gây nhiễm. Điều này chứng minh rằng chủng KTY-PRRS-06 P#90 đã mất đi độc lực nhưng vẫn giữ nguyên khả năng kích thích hệ miễn dịch của lợn. Đây là bằng chứng vững chắc nhất khẳng định sự thành công của việc chọn chủng và làm nhược độc virus.

VI. Tương lai phát triển vacxin PRRS nội địa từ chủng chọn lọc

Việc nghiên cứu thành công và chọn lọc được chủng virus KTY-PRRS-06 đã mở ra một chương mới đầy hứa hẹn cho công tác kiểm soát dịch bệnh PRRS tại Việt Nam. Kết quả này không chỉ là một thành tựu khoa học có giá trị của Viện Thú y Quốc gia và Học viện Nông nghiệp Việt Nam, mà còn đặt nền móng vững chắc cho việc phát triển vacxin nội địa. Một vacxin nhược độc PRRS được sản xuất từ chính chủng virus địa phương có độc lực cao đã được làm yếu đi sẽ giải quyết được bài toán về sự không tương đồng kháng nguyên, vấn đề cốt lõi khiến các vacxin nhập ngoại hoạt động kém hiệu quả. Tương lai của hướng đi này là vô cùng sáng lạn, hướng tới mục tiêu tự chủ hoàn toàn trong sản xuất vacxin, giảm chi phí phòng bệnh cho người chăn nuôi và nâng cao hiệu quả bảo hộ cho tổng đàn lợn quốc gia. Tuy nhiên, để biến tiềm năng này thành hiện thực, cần có những bước đi tiếp theo một cách bài bản và quyết liệt. Quá trình này đòi hỏi sự phối hợp chặt chẽ giữa các nhà khoa học, các doanh nghiệp sản xuất vacxin và các cơ quan quản lý nhà nước như Cục Thú y. Việc hoàn thiện quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp, tiến hành các thử nghiệm lâm sàng trên diện rộng và hoàn tất các thủ tục đăng ký lưu hành là những nhiệm vụ trọng tâm trong thời gian tới để sớm đưa sản phẩm vacxin nhược độc PRRS “made in Vietnam” đến tay người chăn nuôi.

6.1. Tiềm năng của chủng KTY PRRS 06 trong sản xuất vacxin

Chủng virus KTY-PRRS-06 hội tụ đầy đủ các yếu tố của một chủng giống gốc (Master seed) lý tưởng để sản xuất vacxin sống nhược độc. Chủng có nguồn gốc từ chủng PRRS lưu hành tại Việt Nam, đảm bảo tính tương đồng kháng nguyên. Sau khi nhược độc, chủng đã được chứng minh là an toàn tuyệt đối trên lợn, không gây bệnh tích. Quan trọng hơn, nó kích thích tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ, thể hiện qua mức kháng thể kháng PRRS cao. Về mặt công nghệ, chủng virus này có khả năng nhân lên với hiệu giá cao và ổn định trên môi trường tế bào MARC-145, một yếu tố quyết định đến tính kinh tế và khả thi của việc sản xuất ở quy mô lớn. Những tiềm năng này đặt KTY-PRRS-06 vào vị trí hàng đầu trong các ứng viên vacxin nội địa.

6.2. Hướng đi tiếp theo cho công tác kiểm soát dịch bệnh PRRS

Từ thành công của nghiên cứu này, hướng đi tiếp theo cần tập trung vào việc hoàn thiện sản phẩm và đưa vào ứng dụng thực tiễn. Các bước tiếp theo bao gồm: (1) Xây dựng quy trình sản xuất vacxin quy mô công nghiệp từ chủng KTY-PRRS-06, tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy, thu hoạch và đông khô. (2) Tiến hành các đợt thử nghiệm hiệu lực vacxin trên quy mô lớn hơn, tại nhiều vùng dịch tễ khác nhau để đánh giá khả năng bảo hộ trong điều kiện thực địa. (3) Nghiên cứu, đánh giá khả năng bảo hộ chéo của vacxin đối với các biến chủng virus PRRS mới xuất hiện. (4) Xây dựng quy trình sử dụng vacxin hiệu quả, kết hợp với các biện pháp an toàn sinh học khác để tạo thành một chiến lược tổng thể kiểm soát dịch bệnh PRRS.

6.3. Vai trò của Viện Thú y Quốc gia và Cục Thú y trong tương lai

Để đưa một sản phẩm vacxin từ phòng thí nghiệm ra thị trường, vai trò của các cơ quan nghiên cứu và quản lý là không thể thiếu. Viện Thú y Quốc gia và các viện nghiên cứu khác cần tiếp tục đóng vai trò tiên phong trong việc giám sát sự lưu hành và biến đổi của virus, liên tục cập nhật và cải tiến các chủng vacxin. Cục Thú y với vai trò là cơ quan quản lý nhà nước, sẽ chịu trách nhiệm thẩm định, cấp phép và giám sát chất lượng vacxin trong quá trình sản xuất và lưu hành. Sự phối hợp đồng bộ, chặt chẽ giữa nghiên cứu khoa học, sản xuất và quản lý sẽ là yếu tố quyết định, giúp Việt Nam sớm có được công cụ vacxin nội địa hiệu quả, góp phần ổn định ngành chăn nuôi lợn công nghiệp và đảm bảo an ninh lương thực quốc gia.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dịch bệnh tai xanh (Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn - PRRS) tại Việt Nam là một trong những thách thức nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi. Đỉnh điểm vào năm 2010, dịch đã bùng phát dữ dội trên 49 tỉnh thành với ước tính hơn 850.000 con lợn mắc bệnh và hơn 460.000 con bị tiêu hủy, gây thiệt hại kinh tế ước tính hàng nghìn tỷ đồng. Trước đó, trong hai đợt dịch năm 2007 và 2008, số lượng lợn mắc bệnh và tiêu hủy cũng lên tới hơn 340.000 con. Vấn đề cốt lõi đặt ra là các chủng virus PRRS thực địa tại Việt Nam chủ yếu thuộc thể độc lực cao dòng Bắc Mỹ (Type 2), biến đổi kháng nguyên liên tục, khiến các loại vacxin nhập khẩu từ châu Âu hoặc các chủng cổ điển không mang lại hiệu quả bảo hộ chéo đồng chủng như kỳ vọng.

Mục tiêu cụ thể của luận văn là phân lập chủng virus PRRS cường độc thực địa tại Việt Nam, thuần hóa và cấy truyền liên tục qua 90 thế hệ trên môi trường tế bào nhằm tạo ra một chủng virus nhược độc có tính kháng nguyên cao, di truyền ổn định để làm nguồn giống gốc sản xuất vacxin phòng bệnh hiệu quả. Nghiên cứu được triển khai từ tháng 10/2015 đến tháng 10/2016 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, sử dụng mẫu bệnh phẩm thu thập từ ổ dịch thực địa tại tỉnh Nam Định.

Công trình có ý nghĩa thực tiễn to lớn khi chọn tạo thành công chủng virus KTY-PRRS-06 ở đời cấy truyền thứ 90 (P#90), đạt độ tương đồng nucleotide gen ORF5 từ 98,44% đến 100%, hiệu giá virus đạt mức $5,60 \times 10^6 TCID_{50}/25\mu l$, an toàn tuyệt đối trên động vật cảm nhiễm và mở ra triển vọng tự chủ công nghệ sản xuất vacxin thú y chất lượng cao tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết virus học phân tử và dịch tễ học thú y hiện đại. Tác nhân gây bệnh PRRS là virus RNA sợi đơn dương thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Hệ gen của PRRSV có kích thước xấp xỉ 14,5 kb với 10 khung đọc mở (ORF). Trong đó, ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 75% chiều dài genome mã hóa cho các enzyme sao chép phi cấu trúc, trong khi ORF2 đến ORF7 mã hóa cho các protein cấu trúc. Đặc biệt, protein màng lớn GP5 (mã hóa bởi gen ORF5, trọng lượng phân tử khoảng 25 kDa) liên kết với protein màng M tạo thành phức hợp M-GP5, đóng vai trò nhận diện thụ thể tế bào đích, kích hoạt hiện tượng tự chết tế bào (apoptosis) và chứa các epitope trung hòa chủ yếu.

Cơ sở lý thuyết về miễn dịch học chỉ ra rằng đại thực bào phế nang lợn (PAM) là tế bào đích tự nhiên của PRRSV qua trung gian thụ thể heparan sulfate. Khi nuôi cấy thích ứng trên dòng tế bào liên tục Marc-145 (nguồn gốc từ biểu mô thận khỉ MA-104), virus sử dụng thụ thể vimentin để xâm nhập bằng con đường nhập nội bào qua trung gian thụ thể. Quá trình cấy truyền liên tục qua nhiều thế hệ in vitro tạo ra áp lực chọn lọc, dẫn đến các đột biến điểm có định hướng trên genome, làm suy giảm độc lực gây bệnh trên vật chủ tự nhiên nhưng vẫn bảo tồn trọn vẹn tính kháng nguyên đặc hiệu.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và mẫu bệnh phẩm được thu thập từ các ca lợn ốm chết với bệnh tích viêm phổi và sưng hạch lympho điển hình tại ổ dịch Nam Định. Cỡ mẫu ban đầu được sàng lọc kỹ lưỡng, xác định dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu N22-N24 khuếch đại phân đoạn 349 bp. Động vật thí nghiệm là lợn khỏe mạnh từ 4 đến 6 tuần tuổi, hoàn toàn âm tính với kháng thể và kháng nguyên PRRSV qua xét nghiệm ELISA và RT-PCR.

Phương pháp phân tích được chuẩn hóa theo quy trình nghiêm ngặt:

• Nuôi cấy, phân lập và thích ứng virus trên tế bào Marc-145 một lớp với môi trường $\alpha\text{MEM}$ bổ sung 5% huyết thanh bào thai bê (FBS).
• Đánh giá khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) và xác định hiệu giá virus bằng phương pháp chuẩn độ $TCID_{50}$ trên đĩa 96 giếng theo công thức Spearman-Karber.
• Phân tích động thái nhân lên của virus (đường cong sinh trưởng) ở các liều gây nhiễm MOI = 1 qua từng mốc thời gian 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ.
• Khuếch đại và giải trình tự toàn bộ gen ORF5 bằng cặp mồi Go3F-Go5R (kích thước 720 bp) trên hệ thống máy giải trình tự tự động Beckman Coulter CEQ 8000 theo nguyên lý Sanger. Xử lý phân tích phả hệ bằng phần mềm Mega6 và Genetyx.
• Đánh giá khả năng nhược độc và đáp ứng sinh kháng thể trên lợn thí nghiệm qua theo dõi thân nhiệt, triệu chứng lâm sàng và bộ kit thương mại IDEXX HerdChek PRRS 2XR ELISA. Toàn bộ timeline nghiên cứu 90 đời cấy truyền được thực hiện liên tục trong chu kỳ 12 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình cấy truyền và thuần hóa chủng virus KTY-PRRS-06 qua 90 thế hệ trên tế bào Marc-145 mang lại những kết quả mang tính đột phá:

Thứ nhất, tốc độ thích ứng và khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) tăng rõ rệt theo số đời cấy truyền. Ở các đời đầu (P#1 đến P#40), bệnh tích tế bào xuất hiện sau 24 giờ gây nhiễm (khoảng 10%), đạt 55% sau 48 giờ và hủy hoại 100% tế bào sau 60 giờ. Tuy nhiên, từ đời P#50 đến P#90, thời gian xuất hiện CPE rút ngắn xuống chỉ sau 12 giờ (10%), nhanh chóng phá hủy 50% thảm tế bào ở mốc 24 giờ, 85 - 90% ở 36 giờ và đạt 100% tế bào bong tróc hoàn toàn sau 48 giờ, nhanh hơn 20% thời gian so với các thế hệ ban đầu.

Thứ hai, hiệu giá virus tăng trưởng vượt bậc và duy trì độ ổn định tuyệt đối. Hiệu giá virus tại đời P#1 đạt $1,74 \times 10^5 TCID_{50}/25\mu l$, đến đời P#40 tăng lên $4,16 \times 10^5 TCID_{50}/25\mu l$. Đáng chú ý, từ đời P#50, hiệu giá tăng vọt gấp khoảng 10 lần, đạt $4,34 \times 10^6 TCID_{50}/25\mu l$ và tiếp tục nâng lên $5,60 \times 10^6 TCID_{50}/25\mu l$ ở đời P#90. So với chủng vacxin đối chứng thương mại duy trì ở mức $2,16 \times 10^6 TCID_{50}/25\mu l$, hiệu giá của chủng KTY-PRRS-06 P#90 cao hơn gấp 2,3 lần.

Thứ ba, sự ổn định di truyền và bảo tồn kháng nguyên gen ORF5 được khẳng định vững chắc. Kết quả giải trình tự gen cho thấy mức độ tương đồng nucleotide giữa các đời cấy truyền P#1, P#40, P#50, P#80 và P#90 dao động rất hẹp từ 98,44% đến 100%, và tương đồng acid amin từ 97,33% đến 100%. Các đột biến điểm phát sinh không làm thay đổi các vùng epitope trung hòa cốt lõi.

Thứ tư, tính an toàn sinh học và khả năng đáp ứng miễn dịch hoàn hảo trên động vật thí nghiệm. Lợn 4 - 6 tuần tuổi được gây nhiễm chủng P#90 qua xoang mũi không biểu hiện bất kỳ triệu chứng sốt hay tổn thương hô hấp nào, thân nhiệt ổn định trong giới hạn sinh lý ($38,5 - 39,5^\circ C$). Phản ứng ELISA kiểm tra sau gây nhiễm cho thấy hiệu giá kháng thể đặc hiệu tăng cao liên tục, đạt tỷ lệ mẫu dương tính với giá trị S/N < 0,4 từ ngày thứ 14 đến ngày thứ 35.

Thảo luận kết quả

Khi biểu diễn động thái nhân lên của virus thông qua đồ thị đường cong sinh trưởng, dữ liệu thực nghiệm phản ánh quy luật phân bố rõ ràng giữa hàm lượng virus nội bào và ngoại bào. Trong 12 đến 24 giờ đầu, hiệu giá virus trong tế bào luôn cao hơn bên ngoài môi trường ($10^{2,6}$ so với $10^{1,5} TCID_{50}/25\mu l$ ở P#10). Khi tế bào bị phá hủy mạnh mẽ từ sau 36 giờ, lượng virus giải phóng ra môi trường tăng vọt và đạt cực đại $10^{6,5} TCID_{50}/25\mu l$ tại khoảng thời gian 36 - 60 giờ sau gây nhiễm. Điều này chỉ ra rằng khoảng thời gian 36 - 60 giờ sau nhiễm là thời điểm tối ưu nhất để thu hoạch dịch virus phục vụ sản xuất.

So sánh với các nghiên cứu thích ứng chủng virus Bắc Mỹ trên thế giới như chủng VR2332 hay JXA1-R, việc cấy truyền qua 90 đời trên tế bào Marc-145 đã làm giảm độc lực hoàn toàn của chủng KTY-PRRS-06 nhưng vẫn giữ nguyên tính sinh miễn dịch mạnh mẽ. Sự tương đồng cao về mặt di truyền chứng minh chủng phân lập không bị biến đổi cấu trúc kháng nguyên bảo hộ, khắc phục triệt để nhược điểm bảo hộ kém của các dòng vacxin ngoại lai đối với các ổ dịch thực địa tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Để nhanh chóng đưa kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn sản xuất vacxin thương mại, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

• Chuẩn hóa quy trình tạo ngân hàng giống gốc (Master Seed và Working Seed): Đơn vị nghiên cứu cần tiến hành đông khô, bảo quản chủng KTY-PRRS-06 P#90 ở nhiệt độ âm sâu $-80^\circ C$ và trong nitơ lỏng, thiết lập tiêu chuẩn cơ sở với mục tiêu duy trì hiệu giá tối thiểu $10^6 TCID_{50}/ml$ và tỷ lệ sống sót của hạt virus sau bảo quản đạt trên 95%. Thời gian thực hiện trong 6 - 12 tháng do Học viện Nông nghiệp Việt Nam chủ trì.
• Triển khai thử nghiệm lâm sàng và đánh giá hiệu lực bảo hộ thực địa: Doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm thú y cần phối hợp với cơ quan thú y địa phương tiến hành tiêm phòng khảo nghiệm trên quy mô tối thiểu 500 lợn thịt và 200 lợn nái sinh sản tại các vùng có áp lực dịch cao. Mục tiêu đạt tỷ lệ bảo hộ lâm sàng trên 85%, giảm tỷ lệ sảy thai ở nái mang thai xuống dưới 5% và hoàn thành trong vòng 18 tháng.
• Hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành và thương mại hóa sản phẩm: Doanh nghiệp phối hợp cùng Cục Thú y thực hiện kiểm nghiệm độc tính thuần khiết, tính vô trùng và công lực vacxin theo đúng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (TCVN), phấn đấu hoàn tất cấp phép sản xuất vacxin nhược độc PRRS nội địa trong lộ trình 24 tháng.
• Thiết lập mạng lưới giám sát dịch tễ học phân tử thường niên: Các phòng thí nghiệm thú y trọng điểm cần định kỳ thu thập mẫu bệnh phẩm tại các ổ dịch mới bùng phát, tiến hành giải trình tự gen ORF5 với tần suất 6 tháng/lần nhằm phát hiện sớm các biến chủng có độ sai khác nucleotide trên 5% so với chủng giống gốc KTY-PRRS-06.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Doanh nghiệp và nhà máy sản xuất thuốc thú y, sinh phẩm y tế: Tiếp nhận quy trình công nghệ nhân nuôi, cấy truyền thích ứng virus PRRS trên dòng tế bào Marc-145 một lớp, áp dụng các thông số thu hoạch tối ưu ở 36 - 60 giờ để nâng cao năng suất mẻ sản xuất đạt hiệu giá $5,60 \times 10^6 TCID_{50}/25\mu l$.
• Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật - Thú y: Sử dụng tài liệu như một cẩm nang phương pháp luận chuẩn mực về quy trình giải trình tự gen Sanger, kỹ thuật RT-PCR mồi đặc hiệu, chuẩn độ virus theo Spearman-Karber và thiết kế thí nghiệm gây nhiễm nhược độc trên động vật.
• Cán bộ quản lý dịch tễ, Chi cục Chăn nuôi và Thú y các tỉnh thành: Nắm vững các đặc điểm bệnh lý đại thể, vi thể, triệu chứng lâm sàng và cơ chế lây truyền của PRRSV để xây dựng bản đồ dịch tễ học, hỗ trợ chẩn đoán phân biệt chính xác với các bệnh bội nhiễm như Dịch tả lợn cổ điển, Circo virus type 2 và tụ huyết trùng.
• Chủ trang trại chăn nuôi lợn quy mô công nghiệp và gia trại: Hiểu rõ cơ chế đáp ứng miễn dịch của đàn nái và lợn con, nhận diện tầm quan trọng của việc sử dụng vacxin đồng chủng nội địa kết hợp an toàn sinh học nghiêm ngặt để kiểm soát hội chứng tai xanh bền vững.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần chọn tạo chủng PRRSV phân lập tại Việt Nam thay vì nhập khẩu vacxin ngoại?
Các chủng PRRSV lưu hành tại Việt Nam chủ yếu là thể độc lực cao dòng Bắc Mỹ với nhiều biến đổi đặc thù trên gen ORF5. Vacxin nhập khẩu từ các chủng cổ điển thường có mức độ tương đồng kháng nguyên thấp, không tạo ra miễn dịch bảo hộ chéo đồng chủng hoàn toàn, dẫn đến nguy cơ bùng phát dịch ngầm trên đàn lợn đã tiêm phòng.

Tế bào Marc-145 có ưu điểm gì trong quá trình nhược độc hóa virus PRRS?
Marc-145 là dòng tế bào liên tục từ thận khỉ, biểu hiện thụ thể vimentin tương thích cao cho PRRSV xâm nhập. Nuôi cấy qua 90 đời trên dòng tế bào này giúp virus thích ứng hoàn hảo, nâng hiệu giá lên tới $5,60 \times 10^6 TCID_{50}/25\mu l$, đồng thời tạo áp lực làm mất dần độc lực tự nhiên trên lợn.

Các chỉ số nào chứng minh chủng KTY-PRRS-06 đã ổn định di truyền qua 90 đời cấy truyền?
Độ ổn định di truyền thể hiện qua mức độ tương đồng chuỗi nucleotide gen ORF5 đạt 98,44% - 100% và tương đồng acid amin đạt 97,33% - 100%. Đường cong sinh trưởng và hiệu giá virus đạt trạng thái cân bằng, đồng nhất liên tục từ đời cấy truyền thứ 50 đến đời thứ 90.

Làm thế nào để xác định virus đã được nhược độc hóa an toàn trên động vật?
Lợn thí nghiệm từ 4 - 6 tuần tuổi sau khi nhỏ mũi chủng P#90 được theo dõi liên tục trong 35 ngày. Kết quả đo thân nhiệt hàng ngày luôn duy trì ở mức sinh lý bình thường ($38,5 - 39,5^\circ C$), không có triệu chứng khó thở, tai xanh hay tổn thương phổi, đồng thời huyết thanh chuyển biến dương tính ELISA (S/N < 0,4).

Thời điểm thu hoạch dịch nuôi cấy virus tối ưu nhất là khi nào?
Theo quy luật đường cong sinh trưởng, thời điểm thu hoạch tối ưu là từ 36 đến 60 giờ sau gây nhiễm. Tại giai đoạn này, tế bào bị phá hủy từ 85% đến 100%, lượng virus giải phóng ra ngoài môi trường đạt nồng độ cực đại ($10^{6,5} TCID_{50}/25\mu l$), đảm bảo hoạt lực sinh học cao nhất cho sản xuất vacxin.

Kết luận

• Phân lập thành công chủng PRRSV cường độc thực địa thuộc dòng Bắc Mỹ tại ổ dịch Nam Định, đặt tên là KTY-PRRS-06.
• Thuần hóa và cấy truyền ổn định chủng virus qua 90 thế hệ liên tục trên môi trường tế bào Marc-145 với khả năng hủy hoại tế bào nhanh chóng sau 12 - 48 giờ.
• Nâng cao và duy trì hiệu giá virus đạt mức vượt trội $5,60 \times 10^6 TCID_{50}/25\mu l$, cao gấp hơn 2,3 lần so với chủng vacxin thương mại đối chứng.
• Chứng minh tính ổn định di truyền và bảo tồn kháng nguyên gen ORF5 với độ tương đồng nucleotide đạt từ 98,44% đến 100%.
• Khẳng định chủng KTY-PRRS-06 ở đời cấy truyền thứ 90 đã nhược độc hóa hoàn toàn, an toàn sinh học và kích thích miễn dịch đặc hiệu mạnh mẽ trên lợn thí nghiệm.

Công trình là bước đột phá khoa học cung cấp nguồn giống gốc (Master Seed) đạt chuẩn quốc gia, mở đường cho việc chủ động sản xuất vacxin nhược độc phòng chống hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam. Trong lộ trình 12 đến 24 tháng tới, các cơ quan quản lý và doanh nghiệp sinh phẩm cần tăng cường liên kết, đẩy mạnh thử nghiệm thực địa quy mô lớn và hoàn tất thủ tục thương mại hóa để bảo vệ an toàn cho ngành chăn nuôi nước nhà.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009). Một khi hơn 40% đại thực bào của cơ thể bị phá hủy, PRRSV hầu như đã loại bỏ hệ thống miễn dịch của cơ thể. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm trùng kế phát. Đặc biệt có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi nhiễm virus PRRS sẽ tăng đột biến tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn có sẵn trong đường hô hấp như Pasteurella multocida, Mycoplasma 8 hyopneumoniae, Streptococcus suis, Staphylococcus.

Ngoài ra lợn mắc PRRS thường bị bội nhiễm với các bệnh khác như Dịch tả lợn, Tụ huyết trùng, Phó thương hàn, bệnh do Xoắn khuẩn Leptospira spp, bệnh do Streptococcus spp, Mycoplasma spp, E.coli… Các bệnh kế phát này mới là nguyên nhân gây chết nhiều ở lợn mắc PRRS (Wang X. PRRS Virus PRRS Đạạii thực bàobào Đại thực bào bị PRRSV phá huỷ Đại thực bào bị virus phá huỷ Hình 2.Hình ảnh xâm nhiễm và phá huỷ đại thực bào của virus PRRS Nguồn: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Trên lợn nái mang thai, virus ở dạng tự do hoặc kết hợp với tế bào bạch cầu, tế bào đơn nhân trong máu để đến cơ quan sinh sản. Cảm nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào của quá trình mang thai nhưng biểu hiện lâm sàng phụ thuộc lớn vào giai đoạn nhiễm trùng của bào thai và độc lực của chủng virus gây bệnh. Nhiễm virus ở giai đoạn đầu và giai đoạn giữa của kỳ mang thai không có hay chỉ gây tác động nhẹ so với nhiễm virus ở giai đoạn sau.

Cảm nhiễm trong thời kỳ phôi thường có biểu hiện bệnh rất thấp vì tế bào phôi chưa biệt hóa, không thích hợp cho sự nhân lên của virus. Mặt khác lúc này trứng thụ tinh gắn chặt chẽ với nội mạc tử cung nên sự truyền virus từ mẹ sang phôi bị hạn chế. Trong khi ở giai đoạn sau, nhau thai và mạch máu nuôi thai rất phát triển, nhau thai trở thành bộ phận trao đổi cần thiết, đồng thời là cầu nối truyền virus và 9 kháng thể chống virus từ mẹ sang thai. Virus có thể qua nhau thai ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào khác của lợn mẹ.

Cảm nhiễm ở giai đoạn này tạo nhiều vết bong tróc nhỏ trên tế bào biểu mô nhau thai và bệnh tích hoại tử động mạch cuống rốn, từ đó làm cho bào thai bị thiếu dưỡng chất, oxy, gây sảy thai kỳ cuối, lợn con sinh ra yếu ớt, dị tật và tăng tỷ lệ thai chết tươi khi sinh (Prieto C. Triệu chứng bệnh Nhìn chung lợn mắc PRRS thường có biểu hiện lâm sàng đặc trưng như: o sốt cao 40-41 C, viêm phổi nặng, ỉa chảy, tai xanh, lợn nái mang thai thường sảy thai, thai chết lưu hoặc lợn sơ sinh chết yểu. Tuy nhiên tùy từng chủng virus, đặc điểm giống lợn, lứa tuổi, trạng thái miễn dịch cơ thể và các nhân tố ngoại cảnh mà triệu chứng lâm sàng rất khác nhau. Theo ước tính cứ 3 đàn lợn lần đầu tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện, một đàn biểu hiện ở mức độ vừa và một đàn bị nặng (Nguyễn Bá Hiên và cs.

Lý do cho điều này vẫn chưa giải thích được, tuy nhiên với những đàn khỏe mạnh thì mức độ bệnh cũng nhẹ hơn, hơn nữa cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau. Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có dấu hiệu lâm sàng. Đây là đặc điểm chính của hội chứng PRRS (White, 1992). Thời kỳ ủ bệnh có thể kéo dài từ 3-37 ngày (FAO, 2011).

Các triệu chứng chính gồm có: - Các dấu hiệu về da: da thường đổi màu từ ửng đỏ tới xanh, đặc biệt là vùng da tai và vùng âm hộ. Có dấu hiệu phù nề dưới da, mí mắt, chi sau, mõm… - Các triệu chứng về hô hấp ở lợn con và lợn trưởng thành: khó thở, suy hô hấp. Các triệu chứng về hô hấp thường trở nên nghiêm trọng hơn khi nhiễm các bệnh kế phát Pasteurella multocida, Porcine Circovirus Type 2 (PCV2), Mycoplasma hyopneumonia, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Swine influenza virus…Tỷ lệ chết cao thường gặp ở lợn con (30-50%) và thấp hơn ở lợn trưởng thành (4-20%) (OIE, 2008). - Các triệu chứng về sinh sản ở lợn nái: Trong giai đoạn mang thai, khi bị nhiễm bệnh thường biếng ăn, sốt cao, sảy thai ở các giai đoạn khác nhau, đẻ non vào giai đoạn cuối hoặc đẻ con chết yểu, tỷ lệ lợn con chết yểu có thể lên tới 70%.

Lợn nái ở giai đoạn nuôi con có dấu hiệu sốt cao, biếng ăn, lười uống nước, viêm vú, mất sức, động dục lẫn lộn (5-10 ngày sau sinh), lợn con mới sinh ra rất yếu. Các bệnh về hô hấp cũng thường xảy ra với lợn nái bị nhiễm bệnh. 10 - Các triệu chứng ở lợn đực giống: bỏ ăn, sốt cao, đờ đẫn, hôn mê đặc biệt có hiện tượng viêm dịch hoàn, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh dịch kém, lợn khỏi bệnh lâu hồi phục khả năng sinh sản. Phần lớn đực giống nhiễm virus không có biểu hiện lâm sàng nhưng tinh dịch có virus.

Điều này gây khó khăn trong việc kiểm soát dịch bệnh tại các trại lớn. - Đối với lợn con theo mẹ: thể trọng gầy yếu, tụt đường huyết do không bú được, mắt có dử màu nâu, lợn tiêu chảy, chân yếu, đi run rẩy, dễ mắc bệnh kế phát và tỷ lệ chết cao. Tuy nhiên những dấu hiệu lâm sàng trên không hoàn toàn là đặc trưng cho bệnh PRRS, mà còn xuất hiện ở các bệnh lây nhiễm do các tác nhân khác gây nên. Điều này dễ gây nhầm lẫn trong chẩn đoán bệnh nếu chỉ dựa vào các dấu hiệu lâm sàng.

Bệnh tích Mổ khám lợn chết do PRRSV ở mọi lứa tuổi thường thấy hiện tượng viêm kẽ phổi, thùy phổi viêm không đối xứng, đặc chắc trên các thùy phổi. Thùy bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ và nhục hóa. Trên mặt cắt thùy phổi viêm lồi ra, khô. Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hóa mủ ở mặt dưới thùy đỉnh.

Về mặt phôi thai học thường thấy dịch thẩm xuất và phế nang chứa đầy dịch viêm, đại thực bào, một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ đa nhân. Có sự thâm nhiễm các tế bào phế nang loại II (Pneumocyte) làm cho phế nang nhăn lại, thường bắt gặp đại thực bào phân hủy trong phế nang. Một bệnh tích đặc trưng nữa là hạch lympho sưng to (gấp 2-10 lần so với bình thường). Lúc đầu hạch sưng to, thủy thũng, màu nâu vàng nhạt sau hạch cứng chắc, có màu trắng hoặc nâu sáng.

- Ở lợn nái sảy thai: âm môn sưng tụ huyết, niêm mạc tử cung và âm đạo sưng thũng, xuất huyết và chảy dịch, viêm phổi có những đám tụ huyết, trong phế quản có nhiều dịch và bọt khí. Một số trường hợp có viêm bàng quang xuất huyết. - Ở lợn con theo mẹ: viêm đường hô hấp cấp, phế quản và phổi sưng có màu vàng hoặc tụ huyết đỏ, hạch phổi và hạch hầu sưng màu vàng, khi kế phát Streptococcus suis thấy màng não sung huyết do viêm não. - Ở lợn con sau cai sữa và lợn thịt : biểu hiện viêm đường hô hấp đặc trưng : phổi viêm thủy thũng từng đám, có màu vàng do nhục hóa hoặc đỏ do xuất huyết, phế quản chứa dịch nhày và bọt khí (Nguyễn Bá Hiên và cs.

Ngoài ra nếu kế phát các bệnh khác, sẽ thấy thêm các bệnh tích đặc trưng của từng loại bệnh. Chẩn đoán lâm sàng Theo Benfiled (1999), khi có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên cả đàn ở mọi lứa tuổi, lợn nái giảm khả năng sinh sản và năng suất đàn giảm hơn bình thường thì có thể nghi bệnh do virus PRRS. Cụ thể tỷ lệ chết lúc sinh >20%, tỷ lệ sảy thai, thai chết lưu >8%, tỷ lệ lợn con chết trước khi cai sữa >26%, tỷ lệ lợn con chết trong tuần đầu tiên vượt quá 25%. Ngoài ra lợn con theo mẹ, lợn cai sữa có dấu hiệu của hội chứng viêm phế quản phổi, suy hô hấp và một số lợn có biểu hiện tái xanh cũng là những dấu hiệu đầu của bệnh PRRS (Nguyễn Bá Hiên và cs.

Tuy nhiên cần tiến hành các chẩn đoán phi lâm sàng để xác định chính xác tác nhân gây bệnh. Chẩn đoán phi lâm sàng Trong phòng thí nghiệm có thể dùng phản ứng IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay) để phát hiện kháng thể 1-2 tuần sau khi nhiễm; phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM trong 5-28 ngày sau khi nhiễm và kiểm tra kháng thể IgG trong 7-14 ngày sau khi nhiễm; phản ứng ELISA phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi tiếp xúc virus. Ngoài ra, phương pháp PCR phân tích mẫu máu (được lấy trong giai đoạn đầu của pha cấp tính) để xác định sự có mặt của virus cũng là một phương pháp tương đối nhạy và chính xác… 2. Phát hiện gen của virus PRRS Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm.

Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện thí nghiệm cũng ngắn hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào vì thế nó được sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng để phát hiện vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus PRRS. Để tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 dòng virus thì Han-Kook Chung et al. Mẫu là huyết thanh, tinh dịch, dịch xoang, bệnh phẩm…với các cặp mồi khác nhau đều cho phép phát hiện virus.

Kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có kỹ thuật cao từ các quy trình thu nhận, trữ mẫu, tách chiết và tinh sạch… RNA phải được thực hiện một cách nghiêm ngặt. Do đó, kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau. Phân lập virus trên môi trường tế bào Trong phân lập virus, cũng như các phương pháp chẩn đoán khác, khâu đầu tiên và quan trọng nhất đó là cách lấy mẫu và bảo quản mẫu. Mẫu xét nghiệm có thể là huyết thanh, dịch tràn ổ bụng, dịch phế nang, dịch mẫu mô (hạch, phổi, lách).

Trong đó, dịch phế nang và huyết thanh được đánh giá là mẫu tốt nhất cho việc phân lập virus khi dịch bùng phát. PRRSV tồn tại trong huyết thanh lâu hơn trong mô, nhưng với thú già thì ngược lại.