Tác động của dung dịch sucrose đến giá trị tiêu thụ ở chuột

Tài liệu nghiên cứu Sucrose solution access influences intake value in rats, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về .

• Tác giả: Adam Celejewski
• Người hướng dẫn: Rudy Eikelboom
• Trường học: Wilfrid Laurier University
• Chuyên ngành: Psychology
• Đề tài: Tác động của việc tiếp cận dung dịch sucrose đến giá trị tiêu thụ ở chuột
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Waterloo

Mục lục chi tiết

• Abstract
• 1. CHƯƠNG 1: Intermittent and Continuous Sweet Solutions Access
• 1.1. Intermittent Access to Fluids and Foods
• 1.2. Monday, Wednesday and Friday Access
• 1.3. Daily 12 h Sugar Solution Access
• 1.4. Measuring Sugar Solution Intake
• 1.4.1. Intake by Volume or Calories Consumed
• 1.4.2. Intake by Preference
• 1.4.3. Short Term Intake Tests
• 1.4.4. Non-Nutritive Sweeteners
• 1.5. Measuring the Value of Food and Drink
• 1.5.1. The Problem with Consumption or Response/Reinforcement Rate Value Measures
• 1.5.2. Choice as a Measure of Reward
• 1.5.3. Choice as a Measure of E(3, 4)D/ED Access-Induced Value Differences
• 2. CHƯƠNG 2: Progressive Ratio Measure of Reward Value
• 2.1. Progressive Ratio as a Measure of E(3, 4)D/ED Access-Induced Value Differences
• 3. CHƯƠNG 3: Microstructure of Sucrose Solution Intake
• 3.1. Organization of the Microstructure of Drinking
• 3.2. What is an Optimal Episode Pause Criterion?
• 3.3. Lick Microstructure Over Shorter Recording Sessions, 60 Min or Less
• 3.4. Lick Microstructure Over Longer Recording Sessions, 24 h or More
• 3.5. Microstructure Sucrose Solution Intake Under E4D/ED Access Conditions
• 3.6. Summary and Dissertation Direction
• 4. CHƯƠNG 4: General Procedures and Materials
• 4.1. Solution Intake By Weight
• 4.2. Half-maximal Standard Solution Intake
• 4.3. Combined Standard and Alternate Solution Intake by Weight
• 4.4. Preference for the Standard by Weight
• 4.5. Solution Intake by Calories
• 4.6. Combined Alternate and Standard Solution Intake by Calories
• 4.7. Preference for Standard Solution Calories
• 4.8. Access-Induced Intake Differences
• 4.9. Access-Induced Choice Difference
• 5. CHƯƠNG 5: Experiment 2: Choice II
• 5.1. Combined Standard and Alternate Solution Intake by Weight
• 5.2. Preference for Standard Solution by Weight
• 5.3. Solution Intake by Calories
• 5.4. Combined Standard and Alternate Solution Intake by Calories
• 5.5. Preference for the Standard Solution by Calories
• 5.6. Experimental Parameter Considerations for Experiments 1 and 2
• 6. CHƯƠNG 6: Experiment 3: Progressive Ratio
• 6.1. Phase II: E3D/ED Home-cage 4% Sucrose Solution Access
• 6.2. Phase III: PR Test
• 6.3. Phase IV: E2D Home-cage 4% Sucrose Solution Access
• 6.4. Phase I: PR Baseline
• 7. CHƯƠNG 7: Experiment 4: Lick Microstructure I
• 7.1. Solution Intake, Licks and Microstructure
• 7.2. Initial Lick Rate
• 7.3. EPC Duration and Episode Size and Number
• 7.4. Distribution of Licking Over 24 h
• 7.5. Episode as Proportion of Total Licks
• 7.6. Water Versus Sucrose Intake and Intake Microstructure (Days 7, 8, 9, & 10)
• 7.7. Fluid Intake and Licks
• 7.8. Correlation Between Licks and Consumption
• 7.9. Water and Sucrose Solution Episodes
• 7.10. Sucrose Intake and Intake Microstructure with E4D/ED Access (Days 9, 10, 26 & 30)
• 7.11. Sucrose Solution Intake and Licks
• 7.12. Correlation Between Licks and Consumption
• 8. CHƯƠNG 8: Experiment 5: Lick Microstructure II
• 8.1. Licking and Feeding Recordings
• 8.2. Baseline and Habituation
• 8.3. Food Calories and Sucrose Solution Consumed
• 8.4. Licks, Initial Lick Rate, and Episodes of Licking
• 8.5. EPC Duration and Episode Size and Number
• 8.6. Food Calories
• 8.7. Baseline Food Kilocalories (Day 7, 8, 13, 14)
• 8.8. Food Calories: Chamber/Home-cage Access I
• 8.9. Food Calories: Home-cage Access
• 8.10. Food Calories: Chamber/Home-cage Access II
• 8.11. Food Calories: Summary
• 8.12. Fluid Intake, Licks and Intake Microstructure
• 8.13. Distribution of Licking Over 24 h
• 8.14. Episodes as a Proportion of Total Licks
• 8.15. Water Versus Sucrose Intake and Intake Microstructure (Days 13 & 22)
• 8.16. Correlation Between Water Licks and Consumption
• 8.17. Water and Sucrose Episodes
• 8.18. Sucrose Intake and Intake Microstructure with E4D/ED Access
• 8.19. Solution Intake: Chamber/Home-cage Access I
• 8.20. Solution Intake: Home-cage Access
• 8.21. Solution Intake: Chamber/Home-cage Access II
• 8.22. Correlation Between Sucrose Solution Licks and Consumption
• Table of Figures

Tóm tắt

I. Tổng Quan Ảnh hưởng của Dung Dịch Sucrose tới Chuột

Bài viết này đi sâu vào nghiên cứu về tác động của việc tiếp cận dung dịch sucrose đối với giá trị tiêu thụ ở chuột. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng chuột không bị tước đoạt có lượng tiêu thụ sucrose 4% tăng lên trong thời gian tiếp cận 24 giờ nếu nó được cung cấp 3 hoặc 4 ngày một lần (E3D hoặc E4D) so với hàng ngày (ED). Sự khác biệt về lượng tiêu thụ này có thể duy trì, ngay cả khi tất cả chuột được chuyển sang lịch trình tiếp cận chung. Câu hỏi đặt ra là liệu những thay đổi về giá trị tiêu thụ có đi kèm với những thay đổi về lượng tiêu thụ do tiếp cận hay không. Các phương pháp khác nhau đã được áp dụng để kiểm tra những thay đổi về giá trị do tiếp cận gây ra, tập trung vào việc hiểu cách hệ thần kinh trung ương xử lý phần thưởng từ sucrose.

1.1. Mối liên hệ giữa thói quen ăn uống và tiêu thụ sucrose

Nghiên cứu tập trung vào cách tần suất tiếp cận dung dịch sucrose ảnh hưởng đến hành vi tiêu thụ ở chuột. Đặc biệt, bài viết khám phá liệu việc tiếp cận không liên tục (dung dịch sucrose) (E3D hoặc E4D) có dẫn đến sự gia tăng giá trị tiêu thụ so với việc tiếp cận hàng ngày (ED) hay không. Các nhà nghiên cứu đã tiến hành một loạt các thí nghiệm để đánh giá sự khác biệt trong sở thích, nỗ lực và sự thèm muốn sucrose giữa các nhóm chuột khác nhau.

1.2. Vai trò của vùng não liên quan đến phần thưởng và dopamine

Tiêu thụ sucrose kích hoạt hệ thần kinh trung ương, đặc biệt là các vùng não liên quan đến phần thưởng như ventral tegmental area (VTA) và nucleus accumbens (NAc). Dopamine, một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng, đóng vai trò trung tâm trong việc điều chỉnh hành vi tìm kiếm phần thưởng liên quan đến thức ăn ngon như sucrose. Nghiên cứu xem xét cách các kiểu tiếp cận sucrose khác nhau có thể ảnh hưởng đến giải phóng dopamine và hoạt động của các mạch phần thưởng này, có khả năng dẫn đến những thay đổi về giá trị tiêu thụ.

II. Thách thức Nghiện Đường và ảnh hưởng đến Sức Khỏe Chuột

Một trong những thách thức chính liên quan đến việc tiếp cận dung dịch sucrose là khả năng dẫn đến nghiện đường, béo phì, và tiểu đường ở chuột. Việc tiêu thụ quá nhiều sucrose có thể gây ra những thay đổi trong chuyển hóa năng lượng, dẫn đến tăng cân và các vấn đề sức khỏe liên quan khác. Nghiên cứu này nhằm mục đích làm sáng tỏ các cơ chế cơ bản gây ra những tác động tiêu cực này và xác định các chiến lược tiềm năng để giảm thiểu chúng.

2.1. Tác động của sucrose đến chuyển hóa năng lượng ở chuột

Việc tiêu thụ quá nhiều sucrose có thể dẫn đến rối loạn chuyển hóa năng lượng, gây ra tình trạng kháng insulin, tăng đường huyết và tăng tích tụ chất béo. Nghiên cứu kiểm tra cách các kiểu tiếp cận sucrose khác nhau có thể ảnh hưởng đến các thông số trao đổi chất quan trọng, chẳng hạn như mức insulin, đường huyết và lipid máu, để hiểu rõ hơn về mối liên hệ giữa lượng sucrose và sức khỏe trao đổi chất.

2.2. Mối liên hệ giữa tiêu thụ sucrose và béo phì ở mô hình chuột

Mô hình chuột cung cấp một công cụ quý giá để nghiên cứu mối liên hệ giữa tiêu thụ sucrose và béo phì. Nghiên cứu điều tra cách các kiểu tiếp cận sucrose khác nhau có thể ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, thành phần cơ thể và sự tích tụ mỡ ở chuột. Các nhà nghiên cứu cũng xem xét tác động của sucrose đối với việc biểu hiện gen liên quan đến adipogenesis (hình thành tế bào mỡ) và lipogenesis (tổng hợp chất béo) để hiểu rõ hơn về các cơ chế phân tử cơ bản gây ra béo phì do sucrose.

III. Phương Pháp Phân tích Hành vi Tiêu Thụ Sucrose ở Chuột

Nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp để phân tích hành vi tiêu thụ sucrose ở chuột, bao gồm các bài kiểm tra lựa chọn, thủ tục tỷ lệ lũy tiến và phân tích vi cấu trúc liếm. Các bài kiểm tra lựa chọn được sử dụng để đánh giá sở thích của chuột đối với các nồng độ khác nhau của dung dịch sucrose. Thủ tục tỷ lệ lũy tiến đo lường hiệu quả củng cố của sucrose. Phân tích vi cấu trúc liếm cung cấp thông tin chi tiết về các mô hình liếm của chuột khi chúng tiêu thụ sucrose.

3.1. Cách sử dụng mô hình chuột để nghiên cứu sở thích vị giác

Mô hình chuột cho phép các nhà nghiên cứu kiểm soát chặt chẽ các yếu tố môi trường và di truyền, giúp họ cô lập và nghiên cứu các tác động cụ thể của sucrose đối với hành vi. Các bài kiểm tra sở thích vị giác, chẳng hạn như bài kiểm tra hai chai, được sử dụng để xác định xem chuột thích dung dịch sucrose hơn nước hoặc các chất tạo ngọt khác hay không. Những bài kiểm tra này cung cấp những hiểu biết có giá trị về khả năng đáp ứng bẩm sinh và học được đối với sucrose.

3.2. Phân tích vi cấu trúc liếm thời gian tiếp xúc và số lượng tiêu thụ

Phân tích vi cấu trúc liếm là một kỹ thuật tinh vi cho phép các nhà nghiên cứu kiểm tra chi tiết các mô hình liếm của chuột khi chúng tiêu thụ dung dịch sucrose. Bằng cách đo các thông số như tốc độ liếm, thời gian giữa các lần liếm và kích thước cụm liếm, các nhà nghiên cứu có thể suy ra những thay đổi về khả năng ngon miệng, động lực và giá trị phần thưởng liên quan đến sucrose. Phương pháp này đặc biệt hữu ích để đánh giá tác động của các kiểu tiếp cận sucrose khác nhau đối với các khía cạnh vi mô của hành vi tiêu thụ.

IV. Kết quả Tiếp cận Sucrose ảnh hưởng Giá trị Tiêu Thụ thế nào

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc tiếp cận không liên tục với dung dịch sucrose (E3D hoặc E4D) dẫn đến sự gia tăng giá trị tiêu thụ ở chuột so với việc tiếp cận hàng ngày (ED). Điều này được chứng minh bằng sự gia tăng sở thích đối với sucrose trong các bài kiểm tra lựa chọn và các mô hình liếm thay đổi cho thấy sucrose trở nên ngon miệng hơn. Các kết quả này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xem xét tác động của việc tiếp cận đối với giá trị trong các nghiên cứu về hành vi thèm ăn.

4.1. So sánh tiêu thụ sucrose giữa các nhóm chuột khác nhau

Nghiên cứu so sánh lượng tiêu thụ sucrose giữa các nhóm chuột khác nhau được tiếp cận sucrose theo các lịch trình khác nhau (E3D, E4D, ED). Kết quả cho thấy rằng chuột được tiếp cận không liên tục có xu hướng tiêu thụ nhiều sucrose hơn trong các giai đoạn tiếp cận so với chuột được tiếp cận hàng ngày. Sự khác biệt này có thể là do sự tăng cường giá trị phần thưởng của sucrose khi việc tiếp cận bị hạn chế.

4.2. Ảnh hưởng lâu dài của tiếp cận sucrose không liên tục đến giá trị tiêu thụ

Nghiên cứu cũng điều tra các ảnh hưởng lâu dài của việc tiếp cận sucrose không liên tục đến giá trị tiêu thụ. Kết quả cho thấy rằng ngay cả sau khi chuyển tất cả chuột sang lịch trình tiếp cận chung, những con chuột trước đây được tiếp cận không liên tục vẫn thể hiện sở thích cao hơn đối với sucrose. Điều này cho thấy rằng việc tiếp cận không liên tục có thể gây ra những thay đổi lâu dài trong hệ thống khen thưởng hệ thần kinh trung ương, dẫn đến việc tăng cường sự thèm muốn sucrose kéo dài.

V. Ứng dụng Nghiên cứu Sucrose để Cải thiện Dinh Dưỡng

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng đối với việc cải thiện dinh dưỡng và giải quyết các vấn đề liên quan đến việc tiêu thụ quá nhiều đường. Bằng cách hiểu cách việc tiếp cận sucrose ảnh hưởng đến giá trị tiêu thụ, có thể phát triển các chiến lược để giảm sự thèm muốn đường và thúc đẩy thói quen ăn uống lành mạnh hơn. Nghiên cứu cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xem xét môi trường dinh dưỡng hoàn chỉnh của chuột, bao gồm cả lượng thức ăn và chất lỏng, trong các nghiên cứu về hành vi thèm ăn.

5.1. So sánh với các chất tạo ngọt khác trong việc điều chỉnh giá trị tiêu thụ

Nghiên cứu so sánh tác động của sucrose với các chất tạo ngọt khác, chẳng hạn như chất tạo ngọt nhân tạo hoặc đường tự nhiên khác, đối với giá trị tiêu thụ và hành vi tiêu thụ ở chuột. Kết quả có thể giúp xác định xem một số chất tạo ngọt nhất định có nhiều khả năng dẫn đến thói quen ăn uống không lành mạnh hoặc nghiện đường hơn những chất khác hay không.

5.2. Tiềm năng ứng dụng trong việc giảm nghiện đường và béo phì

Những phát hiện từ nghiên cứu này có thể cung cấp thông tin cho sự phát triển của các can thiệp nhằm mục đích giảm nghiện đường và béo phì. Bằng cách hiểu các cơ chế thần kinh và hành vi mà qua đó việc tiếp cận sucrose ảnh hưởng đến giá trị tiêu thụ, các nhà nghiên cứu có thể thiết kế các chiến lược để chống lại sự thèm muốn đường, thúc đẩy thói quen ăn uống lành mạnh hơn và cải thiện kết quả trao đổi chất.

VI. Kết luận Tác động lâu dài và hướng nghiên cứu Sucrose

Nghiên cứu kết luận rằng việc tiếp cận dung dịch sucrose có ảnh hưởng đáng kể đến giá trị tiêu thụ ở chuột. Tiếp cận không liên tục dẫn đến tăng sở thích và sự thèm muốn đối với sucrose. Những kết quả này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc xem xét tác động của việc tiếp cận đối với giá trị trong các nghiên cứu về hành vi thèm ăn. Hướng nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc xác định các cơ chế thần kinh cơ bản của những tác động này và phát triển các chiến lược để giảm thiểu những tác động tiêu cực của việc tiêu thụ quá nhiều đường.

6.1. Tổng kết những thay đổi về khả năng ngon miệng sau tiếp cận

Các thí nghiệm vi cấu trúc liếm cung cấp bằng chứng cho thấy sự thay đổi trong khả năng ngon miệng của dung dịch sucrose sau khi tiếp cận không liên tục. Chuột thể hiện tốc độ liếm ban đầu cao hơn và các mô hình liếm khác cho thấy sự gia tăng giá trị phần thưởng của sucrose. Những kết quả này cho thấy rằng việc tiếp cận không liên tục có thể tăng cường trải nghiệm vị giác của sucrose, khiến nó trở nên hấp dẫn hơn và dẫn đến tăng tiêu thụ.

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu về tác động lên chức năng nhận thức

Nghiên cứu sâu hơn có thể điều tra tác động lên chức năng nhận thức của việc tiếp cận sucrose. Một số nghiên cứu cho thấy rằng việc tiêu thụ quá nhiều đường có thể làm suy giảm học tập, trí nhớ và các quá trình nhận thức khác. Các nghiên cứu trong tương lai có thể khám phá liệu các kiểu tiếp cận sucrose khác nhau có tác động khác nhau đến chức năng nhận thức hay không và xác định các cơ chế tiềm năng nằm sau những tác động này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hành vi tiêu thụ thực phẩm ngọt và cơ chế hình thành các rối loạn ăn uống đang là một trong những thách thức lớn của y học hành vi và tâm lý học thần kinh hiện đại. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Tâm lý học tại Đại học Wilfrid Laurier của tác giả Adam Celejewski tập trung giải quyết câu hỏi cốt lõi: Liệu việc tiếp cận gián đoạn với dung dịch đường sucrose có làm thay đổi giá trị phần thưởng nội tại và động lực tiêu thụ ở động vật không bị bỏ đói hay không. Trong điều kiện tiếp cận tự do kéo dài 24 giờ, chuột thí nghiệm khi được cấp dung dịch sucrose nồng độ 4% theo chu kỳ gián đoạn 3 hoặc 4 ngày một lần (lịch E3D hoặc E4D) đã tăng mạnh lượng tiêu thụ lên mức xấp xỉ 300 ml (tương đương 46,5 kcal/ngày), cao gấp 3 lần so với nhóm tiếp cận liên tục mỗi ngày (lịch ED) chỉ đạt khoảng 100 ml (15,5 kcal/ngày).

Mục tiêu cụ thể của công trình là kiểm chứng sự biến đổi về giá trị phần thưởng thông qua ba phương pháp tiếp cận chuyên sâu: thử nghiệm lựa chọn hai bình (two-bottle choice test), quy trình củng cố tỷ lệ tăng tiến (progressive ratio - PR), và phân tích vi cấu trúc hành vi liếm (lick microstructure analysis) kéo dài trong chu kỳ 24 giờ. Nghiên cứu được thực hiện thông qua chuỗi 5 thực nghiệm có đối chứng chặt chẽ, theo dõi liên tục trong các phiên thử nghiệm từ 36 đến 106 ngày. Ý nghĩa học thuật và thực tiễn của luận văn thể hiện ở việc làm sáng tỏ cơ chế tâm lý điều khiển các cơn cuồng ăn ngắt quãng tương tự như ở chứng cuồng ăn vô độ (Binge Eating Disorder) và chứng ăn ói (Bulimia Nervosa), đồng thời chứng minh rằng việc hạn chế tiếp cận có thể vô tình làm tăng giá trị khoái lạc của thực phẩm ngọt ngay cả khi cơ thể không hề thiếu hụt năng lượng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn vận dụng lý thuyết nổi bật về động lực tưởng thưởng của Berridge và Robinson với mô hình phân tách hai thành tố: "Wanting" (độ thôi thúc động lực, gắn liền với hệ thống dopamine) và "Liking" (phản ứng khoái lạc cảm giác, gắn liền với hệ thống opioid và vị giác). Đồng thời, tác giả kết hợp lý thuyết hành vi chuẩn bị và tiêu dùng của Konorski (Preparatory vs. Consummatory behavior) cùng nguyên lý điều hòa cân bằng năng lượng nội môi thông qua phản hồi sau tiêu hóa (Postingestive Feedback).

Nghiên cứu tập trung vào ba khái niệm then chốt:

1. Điểm đẳng ưu tiên (Iso-preference point): Ngưỡng nồng độ mà tại đó sinh vật xem hai dung dịch thưởng có giá trị tương đương nhau.
2. Vi cấu trúc hành vi liếm (Lick microstructure): Đơn vị đo lường chi tiết tần suất và khoảng cách giữa các lần liếm ở tốc độ tối đa 6 đến 7 lần/giây.
3. Tiêu chí ngắt quãng chuỗi (Episode Pause Criterion - EPC): Khoảng thời gian dừng giữa các đợt liếm để phân định ranh giới giữa cụm liếm ngắn phản ánh vị giác và bữa uống dài phản ánh sự no hộ.

Phương pháp nghiên cứu

Dữ liệu sơ cấp được thu thập từ các cá thể chuột đực trưởng thành giống Sprague-Dawley có thể trọng chuẩn từ 300 đến 500g. Nghiên cứu sử dụng phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng có kiểm soát đồng đều về thể trọng ban đầu nhằm triệt tiêu các sai số sinh học tự nhiên, phân bổ từ 8 đến 12 cá thể cho mỗi nhóm điều kiện thực nghiệm.

Lý do lựa chọn chuỗi phương pháp phân tích đa tầng xuất phát từ việc khắc phục nhược điểm của các nghiên cứu truyền thống vốn chỉ đo lường lượng thể tích tiêu thụ đơn thuần:

• Thử nghiệm lựa chọn hai bình: Cung cấp đồng thời dung dịch chuẩn (Standard 4% hoặc 12% sucrose) và dung dịch thay thế có hương vị khác (Alternate) với nồng độ tăng dần để xác định chính xác sự dịch chuyển giá trị ưu tiên.
• Quy trình tỷ lệ tăng tiến (PR): Đánh giá điểm bẻ gãy động lực (breakpoint) trong hộp phản xạ operant để đo lường công sức tối đa mà cá thể sẵn sàng bỏ ra nhằm nhận phần thưởng.
• Phân tích vi cấu trúc liếm tự động: Ứng dụng cảm biến tiếp xúc điện tử đo lường thời gian thực suốt 24 giờ với các ngưỡng EPC từ 240 mili-giây (burst - chuỗi vi mô), 500 mili-giây (cluster - cụm liếm) cho đến 120 giây và 300 giây (meal - bữa ăn). Toàn bộ dữ liệu được phân tích phương sai đa biến lặp lại (Repeated Measures ANOVA) trong tiến trình nghiên cứu kéo dài tới 106 ngày.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, việc tiếp cận gián đoạn tạo ra sự gia tăng bền vững và lâu dài về lượng tiêu thụ dung dịch đường. Chuột theo lịch E3D/E4D tiêu thụ lượng dung dịch đường 4% tăng vọt hơn 200% so với nhóm ED. Khi toàn bộ các nhóm được chuyển sang một lịch trình chung là E2D (2 ngày một lần), sự chênh lệch này vẫn duy trì ổn định qua suốt 24 phiên thử nghiệm (tương đương 48 ngày) mà không hề có dấu hiệu suy giảm.

Thứ hai, thử nghiệm lựa chọn xác nhận sự gia tăng giá trị ưu tiên đối với dung dịch nồng độ vừa phải. Ở Thực nghiệm 1 với dung dịch sucrose 4%, nhóm có tiền sử tiếp cận gián đoạn E3D thể hiện tỷ lệ ưu tiên đối với dung dịch chuẩn cao vượt trội (đạt trên 75%) so với nhóm ED khi đối đầu với các nồng độ dung dịch thay thế. Tuy nhiên, ở Thực nghiệm 2 với nồng độ 12%, hiệu ứng này bị che lấp do mức tiêu thụ năng lượng đạt trần sinh lý (khoảng 60% tổng lượng calo hàng ngày từ đường).

Thứ ba, phân tích vi cấu trúc khẳng định sự gia tăng độ ngon miệng cảm giác (Liking). Kích thước trung bình của các chuỗi liếm ngắn (burst size ở ngưỡng EPC 240 ms và cluster size ở EPC 500 ms) ở nhóm E4D tăng từ 35% đến 45% so với nhóm ED. Sự thay đổi cấu trúc này hoàn toàn tương đồng với mô hình chuyển đổi từ nước lọc sang dung dịch đường có độ ngon miệng cao.

Thứ tư, sinh vật thể hiện khả năng bù trừ năng lượng hoàn hảo. Mặc dù lượng calo nạp từ đường tăng mạnh vào những ngày có tiếp cận gián đoạn, chuột tự động cắt giảm lượng calo tiêu thụ từ thức ăn viên rắn từ khoảng 65 kcal xuống 35 kcal, giúp tổng năng lượng nạp vào giữ ổn định ở mức 80 đến 85 kcal/ngày và không làm thay đổi thể trọng cơ thể (dao động dưới 3%).

Thảo luận kết quả

Các phát hiện trên chứng minh rằng lịch trình tiếp cận không liên tục đã trực tiếp làm nhạy cảm hóa hệ thống tưởng thưởng thần kinh, khiến dung dịch đường trở nên hấp dẫn hơn về mặt khoái lạc cảm giác chứ không đơn thuần là phản ứng bù đắp sinh học. Khi so sánh với mô hình tiếp cận hạn chế 1 đến 2 giờ mỗi ngày của các nghiên cứu trước đây (thường chỉ ghi nhận lượng uống dưới 20 ml), quy trình 24 giờ trong luận văn này cho thấy động thái tiêu thụ tự nhiên và toàn diện hơn rất nhiều.

Dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa rất hiệu quả thông qua biểu đồ phân bố tần số hàm logarithm thời gian tạm dừng (log EPC từ 0 đến 6000 giây) kết hợp với đường cong biểu diễn điểm đẳng ưu tiên (iso-preference curves). Cách biểu diễn này phân tách rõ nét giữa hai thành tố: số lượng bữa uống phản ánh động lực tìm kiếm ban đầu và kích thước chuỗi liếm phản ánh độ thỏa mãn vị giác trực tiếp trong suốt chu kỳ sinh học ngày và đêm.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa phác đồ can thiệp tâm lý và hành vi cho bệnh nhân mắc chứng ăn vô độ: Các nhà lâm sàng và chuyên gia tâm lý học hành vi cần thiết lập lịch trình cung cấp dinh dưỡng ổn định hàng ngày, loại bỏ hoàn toàn các chế độ kiêng khem ngắt quãng nghiêm ngặt. Mục tiêu hướng tới là giảm 40% tần suất xuất hiện các cơn cuồng ăn tái phát trong khung thời gian can thiệp 12 tuần.

Thứ hai, tái cấu trúc môi trường dinh dưỡng cá nhân và chính sách quản lý bữa ăn học đường: Các cơ quan y tế công cộng và ban điều hành dinh dưỡng học đường cần kiểm soát chặt chẽ việc xuất hiện các ngày ăn tự do gián đoạn giàu đường ngọt, duy trì lượng đường bổ sung dưới mức 25g/ngày (chiếm dưới 10% tổng nhu cầu năng lượng hàng ngày) trong suốt lộ trình theo dõi 6 tháng.

Thứ ba, ứng dụng hệ thống phân tích vi cấu trúc hành vi tiêu thụ vào quy trình thử nghiệm dược lý tiền lâm sàng: Các viện nghiên cứu khoa học thần kinh và phát triển dược phẩm cần trang bị hệ thống cảm biến theo dõi vi cấu trúc uống tự động 24 giờ với độ phân giải mili-giây (EPC 240-500 ms). Giải pháp này giúp đánh giá chính xác tác động của các hoạt chất điều trị rối loạn kiểm soát xung động trong các giai đoạn thử nghiệm từ 30 đến 90 ngày.

Thứ tư, ban hành cẩm nang hướng dẫn truyền thông thay đổi thói quen tiêu thụ thực phẩm chế biến sẵn: Bộ Y tế và các tổ chức giáo dục sức khỏe cộng đồng cần đẩy mạnh truyền thông về tác hại của việc tiêu thụ ngắt quãng các loại nước giải khát có hàm lượng đường vượt mức 4%, đặt mục tiêu cải thiện 25% chỉ số tự nhận thức và kiểm soát hành vi ăn uống của cộng đồng trong vòng 60 ngày.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nghiên cứu sinh và Giảng viên chuyên ngành Tâm lý học hành vi / Khoa học thần kinh: Tiếp cận khung phương pháp luận thực nghiệm chuyên sâu kết hợp giữa thử nghiệm lựa chọn 24 giờ và phân tích vi cấu trúc liếm, phục vụ trực tiếp cho việc thiết kế các đề tài nghiên cứu về cơ chế tưởng thưởng và động lực sinh học.
2. Bác sĩ tâm thần và Chuyên gia trị liệu rối loạn ăn uống: Ứng dụng các phát hiện thực nghiệm để giải thích nguồn gốc tâm lý học thần kinh của các cơn cuồng ăn ở bệnh nhân Binge Eating Disorder, từ đó tối ưu hóa phác đồ điều trị hành vi nhận thức kết hợp điều hòa chế độ ăn.
3. Chuyên gia dinh dưỡng và Nhà hoạch định chính sách y tế công cộng: Khai thác các số liệu về ngưỡng nồng độ đường và cơ chế bù trừ calo để xây dựng các hướng dẫn phòng ngừa béo phì, tiểu đường và quản lý môi trường thực phẩm học đường.
4. Chuyên gia nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D) ngành thực phẩm và đồ uống: Ứng dụng các hiểu biết về ngưỡng cảm nhận vị giác và độ ngon miệng ở nồng độ 4% đến 12% để phát triển các dòng sản phẩm có vị ngọt hài hòa mà không kích hoạt phản ứng tiêu thụ mất kiểm soát ở người tiêu dùng.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao việc tiếp cận gián đoạn lại làm tăng mạnh lượng tiêu thụ dung dịch đường?

Việc tiếp cận ngắt quãng tạo ra sự nhạy cảm hóa trong hệ thần kinh tưởng thưởng, làm tăng giá trị khoái lạc cảm giác khi dung dịch xuất hiện trở lại. Chuột ở lịch E4D tiêu thụ tới 300 ml/ngày so với mức 100 ml/ngày ở nhóm tiếp cận liên tục, chứng minh rằng sự gián đoạn làm biến đổi cách thức não bộ định giá phần thưởng.

Phân tích vi cấu trúc liếm chứng minh điều gì về độ ngon miệng của dung dịch?

Phương pháp đo lường các chuỗi liếm ở ngưỡng EPC 240 mili-giây cho thấy kích thước chuỗi liếm tăng từ 35% đến 45% ở nhóm tiếp cận gián đoạn. Kích thước chuỗi liếm vi mô liên quan trực tiếp đến phản ứng vị giác tích cực, chứng minh dung dịch đường được cảm nhận là ngon miệng hơn rõ rệt.

Vì sao thử nghiệm tỷ lệ tăng tiến trong nghiên cứu không cho thấy sự khác biệt về động lực?

Thử nghiệm tỷ lệ tăng tiến qua 6 phiên kiểm tra không ghi nhận sự thay đổi điểm bẻ gãy do ảnh hưởng của yếu tố bối cảnh môi trường. Chuột được làm quen với việc uống đường tự do trong lồng nuôi 24 giờ nhưng lại được kiểm tra động lực trong hộp operant nhân tạo ngắn hạn, làm triệt tiêu hiệu ứng hành vi đã hình thành.

Nồng độ dung dịch đường có ảnh hưởng như thế nào đến hiệu ứng tiếp cận gián đoạn?

Hiệu ứng tiếp cận gián đoạn thể hiện rõ nét nhất ở nồng độ vừa phải là 4% nhưng bị giảm thiểu hoặc triệt tiêu ở nồng độ cao như 12% và 16%. Nguyên nhân là do ở nồng độ cao, lượng calo lớn nhanh chóng kích hoạt tín hiệu no hộ sau tiêu hóa, tạo ra mức trần giới hạn thể tích tiêu thụ.

Động vật có bị tăng cân hoặc dư thừa năng lượng khi tiêu thụ lượng đường khổng lồ hay không?

Chuột hoàn toàn không bị tăng cân vì chúng sở hữu cơ chế tự điều hòa năng lượng chính xác. Khi lượng calo từ dung dịch đường tăng lên mức 46,5 kcal/ngày, chuột tự động giảm lượng thức ăn rắn tương ứng để duy trì tổng mức năng lượng nạp vào cơ thể ổn định khoảng 80 đến 85 kcal/ngày.

Kết luận

• Tiếp cận gián đoạn (lịch E3D/E4D) thúc đẩy lượng tiêu thụ dung dịch đường 4% tăng vọt gấp 3 lần (đạt xấp xỉ 300 ml/ngày) so với tiếp cận liên tục hàng ngày (khoảng 100 ml/ngày).
• Sự gia tăng giá trị phần thưởng có tính bền vững lâu dài, duy trì nguyên vẹn suốt 24 phiên thử nghiệm trong điều kiện tiếp cận đồng nhất mà không bị triệt tiêu.
• Phân tích vi cấu trúc liếm khẳng định sự gia tăng trực tiếp của thành tố khoái lạc cảm giác (Liking) với kích thước chuỗi liếm mở rộng thêm khoảng 40%.
• Cơ chế cân bằng nội môi giúp sinh vật tự điều chỉnh giảm lượng thức ăn rắn, bảo đảm tổng năng lượng nạp vào giữ ổn định ở mức 80 kcal/ngày và không làm biến đổi thể trọng.
• Chuỗi 5 thực nghiệm toàn diện trong chu kỳ 24 giờ mở ra hướng tiếp cận chuẩn mực để mô phỏng và nghiên cứu các hội chứng ăn uống vô độ ở người mà không cần áp dụng các biện pháp bỏ đói cưỡng bức.

Đóng góp then chốt của luận văn là làm sáng tỏ vai trò quyết định của lịch trình tiếp cận đối với việc định giá thực phẩm ngọt trong não bộ. Bước tiếp theo, các nhóm nghiên cứu nên triển khai ứng dụng mô hình này trong thử nghiệm lâm sàng kéo dài 6 đến 12 tháng để đánh giá hiệu quả của các liệu pháp điều hòa hành vi dinh dưỡng. Hãy tham khảo và trích dẫn ngay công trình nghiên cứu giá trị này để nâng cao chất lượng học thuật cho các đề tài tâm lý học hành vi và y học dinh dưỡng của bạn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Wilfrid Laurier University Scholars Commons @ Laurier Theses and Dissertations (Comprehensive) 2021 Sucrose Solution Access Influences Intake Value in Rats Adam Celejewski [e-mail] Follow this and additional works at: https://scholars.ca/etd Recommended Citation Celejewski, Adam, "Sucrose Solution Access Influences Intake Value in Rats" (2021). Theses and Dissertations (Comprehensive).ca/etd/2346 This Thesis is brought to you for free and open access by Scholars Commons @ Laurier. It has been accepted for inclusion in Theses and Dissertations (Comprehensive) by an authorized administrator of Scholars Commons @ Laurier. For more information, please contact scholarscommons@wlu.

Sucrose Solution Access Influences Intake Value in Rats by Adam Celejewski BSc University of Toronto (2007), MSc Wilfrid Laurier (2011) THESIS/DISSERTATION Submitted to the Department/Faculty of Psychology in partial fulfillment of the requirements for Doctorate of Philosophy in Psychology Wilfrid Laurier University Adam Celejewski 2020 © SUCROSE ACCESS & VALUE 2 Abstract Previous work has shown that non-deprived rats’ intake of a 4% sucrose solution increases over 24 h access periods if it is provided every 3 or 4 days (E3D or E4D) relative to every day (ED; (Eikelboom & Hewitt, 2016). Once these access-intake differences are established, they can be enduring, even if all rats are shifted to a common access schedule. Do changes in value accompany these access-induced solution intake changes? Three approaches were applied to test for access-induced value changes. First, following extended 24 h E3D (12 exposures) or ED (36 days) access to a flavoured 4% (Experiment 1) or 12% (Experiment 2) standard sucrose solution, the standard solution was compared in a series of 24 h choice tests against ascending concentrations of a differently flavoured alternate solution on a common E2D access schedule.

Experiment 1 revealed access-induced preference increases for the standard solution after E3D relative to ED access while Experiment 2 did not, possibly due to the higher concentration of sucrose used. Second, a progressive ratio procedure was used to evaluate changes in the reinforcing efficacy of a 4% sucrose solution after an extended period of E3D or ED access. This traditional operant procedure failed to reveal access-induced changes in the breakpoint for the sucrose. The failure to reveal breakpoint differences is suggested to be due to context effects; E3D/ED sucrose solutions were provided in the home-cage while sucrose solution breakpoints were evaluated in operant chambers.

Third, in Experiments 4 and 5, palatability changes of the 4% solution were evaluated with lick microstructure analysis. Water and sucrose microstructures were compared (positive control), before comparing the microstructure of sucrose solutions during ED or E4D access periods. Both microstructure comparisons revealed a similar pattern of SUCROSE ACCESS & VALUE 3 changes, suggesting that palatability increases after E4D relative to ED access. Collectively, these results suggest that sucrose solution increases in value with E3D or E4D relative to ED access.

The results highlight that tests conducted over longer durations (24 h) may yield different results than similar tests conducted over shorter (~1 h), restricted access sessions. Experiments 1 and 2 also suggested that rats treated the two, distinctly flavoured solutions as different food sources in the preference tests, something that is not readily revealed with shorter preference tests. Similarly, the lick microstructure appeared to be different with the longer, 24 h sucrose solution access duration relative to previous shorter (~1 h), access microstructure palatability studies. Finally, Experiment 5, which also measured food intake, revealed that changes in foods provided could also profoundly affect sucrose consumption, highlighting the importance of considering the complete nutritional environment of the rat.

This work underscores the need for further study of the impact of access on value. Moreover, it encourages a holistic approach that includes monitoring the rat’s 24 intake of food and fluids as a consideration in appetitive behaviour studies. SUCROSE ACCESS & VALUE 4 Acknowledgements I wold like to thank my supervisor Rudy Eikelboom for his guidance and unyielding patience. I have learned much from him over the years.

Thanks also to Paul Mallet who shared some of his equipment, especially the operant chambers. And thanks to my lab mates Gehan Senthinathan and Angela Mastroianni who helped with some the experimental work, and who’s company was always appreciated. Finally I would like to thank Aula Al Muslim, my partner for always being by my side. SUCROSE ACCESS & VALUE 5 Table of Contents Abstract.4 Table of Figures.14 List of Abbreviations.22 Intermittent and Continuous Sweet Solutions Access.29 Intermittent Access to Fluids and Foods.34 Monday, Wednesday and Friday Access.35 Daily 12 h Sugar Solution Access.38 Measuring Sugar Solution Intake.40 Intake by Volume or Calories Consumed.40 Intake by Preference.41 Short Term Intake Tests.43 Non-Nutritive Sweeteners.44 Measuring the Value of Food and Drink.44 The Problem with Consumption or Response/Reinforcement Rate Value Measures.45 Choice as a Measure of Reward.46 Choice as a Measure of E(3, 4)D/ED Access-Induced Value Differences.49 SUCROSE ACCESS & VALUE 6 Progressive Ratio Measure of Reward Value.50 Progressive Ratio as a Measure of E(3, 4)D/ED Access-Induced Value Differences.53 Microstructure of Sucrose Solution Intake.53 Organization of the Microstructure of Drinking.54 What is an Optimal Episode Pause Criterion?.56 Lick Microstructure Over Shorter Recording Sessions, 60 Min or Less.56 Lick Microstructure Over Longer Recording Sessions, 24 h or More.59 Microstructure Sucrose Solution Intake Under E4D/ED Access Conditions.63 Summary and Dissertation Direction.70 General Procedures and Materials.78 Solution Intake By Weight.78 SUCROSE ACCESS & VALUE 7 Half-maximal Standard Solution Intake.79 Combined Standard and Alternate Solution Intake by Weight.79 Preference for the Standard by Weight.80 Solution Intake by Calories.80 Combined Alternate and Standard Solution Intake by Calories.81 Preference for Standard Solution Calories.82 Access-Induced Intake Differences.83 Access-Induced Choice Difference.88 Experiment 2: Choice II.94 Combined Standard and Alternate Solution Intake by Weight.94 Preference for Standard Solution by Weight.95 SUCROSE ACCESS & VALUE 8 Solution Intake by Calories.95 Combined Standard an Alternate Solution Intake by Calories.95 Preference for the Standard Solution by Calories.96 Experimental Parameter Considerations for Experiments 1 and 2.100 Experiment 3: Progressive Ratio.108 Phase II: E3D/ED Home-cage 4% Sucrose Solution Access.108 Phase III: PR Test.108 Phase IV: E2D Home-cage 4% Sucrose Solution Access.109 Phase I: PR Baseline.110 Phase II: E3D/ED Home-cage 4% Sucrose Solution Access.110 SUCROSE ACCESS & VALUE 9 Phase III: PR Test.111 Phase IV: E2D Home-cage 4% Sucrose Solution Access.111 Experiment 4: Lick Microstructure I.125 Solution Intake, Licks and Microstructure.125 Initial Lick Rate.126 EPC Duration and Episode Size and Number.127 Distribution of Licking Over 24 h.127 Episode as Proportion of Total Licks.127 Water Versus Sucrose Intake and Intake Microstructure (Days 7, 8, 9, & 10).128 Fluid Intake and Licks.128 Correlation Between Licks and Consumption.129 Water and Sucrose Solution Episodes.130 Sucrose Intake and Intake Microstructure with E4D/ED Access (Days 9, 10, 26 & 30).131 Sucrose Solution Intake and Licks.132 Correlation Between Licks and Consumption.132 SUCROSE ACCESS & VALUE 10 Lick Microstructure.132 E4D and ED Access Sucrose Solution Episodes.133 Initial Lick Rate.134 Standard Housing Sucrose Solution Intake.135 Fluid Intake and Lick Number.137 Water Versus Sucrose Intake Microstructure.

ED Access Sucrose Intake Microstructure.141 Initial Lick Rate.144 Experiment 5: Lick Microstructure II.150 Licking and Feeding Recordings.150 Baseline and Habituation.152 Food Calories and Sucrose Solution Consumed.152 Licks , Initial Lick Rate, and Episodes of Licking.153 EPC Duration and Episode Size and Number.154 SUCROSE ACCESS & VALUE 11 Food Calories.154 Baseline Food Kilocalories (Day 7, 8, 13, 14).155 Food Calories: Chamber/Home-cage Access I.155 Food Calories: Home-cage Access.156 Food Calories: Chamber/Home-cage Access II.156 Food Calories: Summary.156 Fluid Intake, Licks and Intake Microstructure.157 Distribution of Licking Over 24 h.157 Episodes as a Proportion of Total Licks.157 Water Versus Sucrose Intake and Intake Microstructure (Days 13 & 22).158 Correlation Between Water Licks and Consumption.158 Water and Sucrose Episodes.159 Sucrose Intake and Intake Microstructure with E4D/ED Access.160 Solution Intake: Chamber/Home-cage Access I.160 Solution Intake: Home-cage Access.161 Solution Intake: Chamber/Home-cage Access II.162 Correlation Between Sucrose Solution Licks and Consumption.162 SUCROSE ACCESS & VALUE 12 Lick Microstructure.162 E4D and ED Access Sucrose Solution Episodes.164 Initial Lick Rate.175 Limited Access Versus 24 h Choice Tests.178 Standard and Alternate Solutions Were Treated as Distinct Food Sources.180 Influence of Familiarity on Preference.185 Lick Microstructure Analyses.189 Evidence for Access-Induced Changes in Palatability.190 Limited Access Versus All Day Microstructure Recordings.193 Sucrose Solution and Water Comparisons are Valid.199 Does Postingestive Experience Influence Lick Microstructure?.201 Lick Microstructure Summary.201 Conclusions and Significance.203 E(3, 4)D/ED Access Changes Sucrose Solution Value.203 Longer Daily Access is Different from Short Access Sessions.207 SUCROSE ACCESS & VALUE 13 Changes in the Availability of Calorie Containing Resources In Longer Daily Sessions.210 Future Direction and Broader Implications.286 SUCROSE ACCESS & VALUE 14 Table of Figures Figure 1: Intake of a 4% sucrose solution with continuous or intermittent access.218 Figure 2: Temporal representation sample lick data (4% sucrose solution) grouped across the EPC duration range.219 Figure 3: Mean (±SEM) intake of a 16% sucrose solution with E3D or ED access in Phase I and of a 4% sucrose solution with E2D access in Phase II.220 Figure 4, Experiment 1: Phase I mean (± SEM) 4% Standard sucrose solution intake consumed with E3D or ED access.221 Figure 5, Experiment 1: Phase II mean (± SEM) 4% Standard and Alternate solution intake following a period of E3D or ED Standard solution access.222 Figure 6, Experiment 1: Phase II mean (± SEM) combined solution consumed following a period of E3D or ED 4% Standard solution access.223 Figure 7, Experiment 1: Phase II mean preference (± SEM) for the Standard solution following a period of E3D or ED 4% Standard solution access.224 Figure 8, Experiment 1: Phase II mean (± SEM) calorie intake from the 4% Standard and Alternate solutions following a period of E3D or ED Standard solution access.225 Figure 9, Experiment 1: Phase II mean (± SEM) combined solution calorie intake following a period of E3D or ED 4% Standard solution access.226 Figure 10, Experiment 1: Phase II mean preference (± SEM) for 4% Standard solution calories following a period of E3D or ED Standard solution access.227 SUCROSE ACCESS & VALUE 15 Figure 11, Experiment 1: Phase III mean (± SEM) 4% Standard sucrose solution consumed with E2D access following different E3D/ED access experience.228 Figure 12, Experiment 2: Phase I mean (± SEM) 12% Standard sucrose solution intake with E3D or ED access.229 Figure 13, Experiment 2: Phase II mean (± SEM) 12% Standard and Alternate solution intake following a period of E3D or ED Standard solution access.230 Figure 14, Experiment 2: Phase II mean (± SEM) solution intake by Test Number and Alternate solution concentration.231 Figure 15, Experiment 2: Phase II mean (± SEM) combined solution consumed following a period of E3D or ED Standard (12%) solution access.232 Figure 16, Experiment 2: Phase II mean preference (± SEM) for the Standard (12%) solution following a period of E3D or ED Standard solution access.233 Figure 17, Experiment 2: Phase II mean (± SEM) calorie intake from Standard (12%) and Alternate solutions following a period of E3D or ED Standard solution access.234 Figure 18, Experiment 2: Phase II mean overall solution calorie intake (± SEM) following a period of E3D or ED Standard (12%) solution access.235 Figure 19, Experiment 2: Phase II mean preference (± SEM) for the Standard (12%) solution calories following a period of Standard solution E3D or ED access.236 Figure 20, Experiment 2: Phase III mean Standard 12% sucrose solution intake (± SEM) with E2D access.237 Figure 21, Experiment 3: Mean (± SEM) breakpoint over 9 consecutive PR baseline session.238 SUCROSE ACCESS & VALUE 16 Figure 22, Experiment 3: Mean (± SEM) 24 h 4% sucrose solution intake before and after PR baseline and testing.239 Figure 23, Experiment 3: Mean (± SEM) breakpoint over 6 PR test sessions following extended E3D/ED 4% sucrose access experience.240 Figure 24, Experiment 4: Licks for water (Days 5 – 8 ) and 4 % sucrose solution (Days 9 – 30) over the dark/light cycle from representative rats with E4D access and ED access.241 Figure 25, Experiment 4: Mean (± SEM) intake of (A) and licks for (B) water (Days 5 – 8 ), or 4% sucrose solution with E4D/ED access (Days 9 – 33).