Luận Văn Thạc Sĩ: Phát Hiện Escherichia coli O157:H7 Trong Rau Sống Bằng Thực Khuẩn Thể Tái Tổ Hợp

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học trình bày quy trình phát hiện Escherichia coli O157:H7 trong mẫu rau ăn sống bằng thực khuẩn thể tái tổ hợp.

• Tác giả: Nguyen Thi Tuyet Nhung
• Người hướng dẫn: TS. Hoang Anh Hoang
• Trường học: Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Phát Hiện Escherichia coli O157:H7 Trong Rau Sống Bằng Thực Khuẩn Thể Tái Tổ Hợp
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Hiện trạng nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm
• 1.2. Các phương pháp phát hiện Escherichia coli O157:H7
• 1.2.1. Phương pháp sử dụng môi trường đặc hiệu
• 1.2.2. Phương pháp phân tách miễn dịch (IMS)
• 1.2.3. Phương pháp sử dụng thực khuẩn thể
• 1.2.4. Nghiên cứu ứng dụng phương pháp thực khuẩn thể trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh
• 1.3. Vật liệu và phương pháp
• 1.3.1. Vật liệu
• 1.3.2. Thiết bị - dụng cụ
• 1.3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.3.3.1. Thuyết minh quy trình
• 1.3.3.2. Thiết kế thí nghiệm
• 1.3.3.3. Tái kiểm tra hoạt tính thực khuẩn thể PP01ccp
• 1.3.3.4. Tái kiểm tra hoạt tính enzyme CCP được tổng hợp từ bộ gen thực khuẩn thể
• 1.3.3.5. Lựa chọn kháng sinh trên môi trường BHI
• 1.3.3.6. Lựa chọn kháng sinh trên mẫu rau
• 1.3.3.7. Xác định độ nhạy của phương pháp
• 1.3.3.8. Thử nghiệm hoạt tính phage trên mẫu rau
• 1.3.3.9. Xác định thời gian thử nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỂN LUẬN
• 3.1. Kết quả kiểm tra hoạt tính thực khuẩn thể PP01ccp
• 3.2. Kiểm tra gen CCP
• 3.3. Kết quả lựa chọn kháng sinh
• 3.3.1. Kết quả lựa chọn kháng sinh trên môi trường BHI
• 3.3.2. Kết quả lựa chọn kháng sinh trên mẫu rau
• 3.4. Kết quả xác định độ nhạy của E. coli O157:H7 sau giai đoạn tăng sinh
• 3.5. Thử nghiệm hoạt tính phage trên mẫu rau
• 3.6. Kết quả xác định thời gian thử nghiệm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phát Hiện E

Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn Gram âm, tồn tại tự nhiên trong đường tiêu hóa. Hầu hết các chủng không gây hại, nhưng một số chủng, đặc biệt là E. coli O157:H7, có khả năng sản xuất độc tố Shiga, gây bệnh nguy hiểm. Chủng này là nguyên nhân chính gây hội chứng tan huyết urê, với tỉ lệ tử vong và biến chứng đáng kể. E. coli O157:H7 thường có mặt ở động vật nhai lại và lây truyền sang người qua thực phẩm ô nhiễm, bao gồm cả rau sống. Theo CDC, E. coli O157:H7 gây ra hàng chục nghìn ca bệnh mỗi năm. Vì vậy, việc phát hiện nhanh chóng và hiệu quả E. coli O157:H7 trong rau sống là vô cùng quan trọng để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và đảm bảo an toàn thực phẩm.

1.1. Nguy Cơ Nhiễm E. coli O157 H7 Từ Rau Sống

Việc tiêu thụ rau sống đang ngày càng phổ biến, đặc biệt tại Việt Nam. Thói quen này làm tăng nguy cơ nhiễm E. coli O157:H7 nếu rau không được rửa sạch và chế biến đúng cách. Rau có thể bị ô nhiễm do tiếp xúc với phân động vật trong quá trình trồng trọt, thu hoạch hoặc vận chuyển. Các loại rau như xà lách, cải xanh, giá đỗ, rau thơm là những đối tượng dễ bị nhiễm khuẩn nhất. Cần có biện pháp xử lý rau sống an toàn để giảm thiểu nguy cơ này, bảo vệ người tiêu dùng khỏi ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn gây bệnh.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Phát Hiện Nhanh E. coli O157 H7

Việc phát hiện nhanh E. coli O157:H7 có ý nghĩa quan trọng trong việc ngăn chặn các vụ ngộ độc thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Các phương pháp truyền thống thường tốn thời gian, trong khi việc phát hiện nhanh cho phép can thiệp kịp thời, thu hồi sản phẩm ô nhiễm và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn. Phát hiện nhanh cũng giúp các nhà sản xuất và nhà phân phối đảm bảo an toàn thực phẩm, nâng cao uy tín và giảm thiểu thiệt hại kinh tế do thu hồi sản phẩm. Các kỹ thuật hiện đại như sử dụng thực khuẩn thể tái tổ hợp đang được nghiên cứu và ứng dụng để đáp ứng nhu cầu này.

II. Thách Thức Trong Phát Hiện E

Việc phát hiện E. coli O157:H7 trong rau sống đối mặt với nhiều thách thức. Thứ nhất, nồng độ vi khuẩn trong rau có thể rất thấp, đòi hỏi phương pháp phát hiện phải có độ nhạy cao. Thứ hai, rau sống chứa nhiều vi sinh vật khác, có thể gây nhiễu và ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm. Thứ ba, các phương pháp truyền thống thường tốn thời gian, không đáp ứng được yêu cầu kiểm tra nhanh chóng. Để vượt qua những thách thức này, cần có các phương pháp phát hiện tiên tiến, có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tốt, và thời gian thực hiện ngắn. Việc kết hợp các kỹ thuật khác nhau, như tăng sinh chọn lọc và phát hiện bằng sinh học phân tử, có thể giúp nâng cao hiệu quả phát hiện.

2.1. Giới Hạn Của Các Phương Pháp Phát Hiện Truyền Thống

Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy trên môi trường chọn lọc (ví dụ, SMAC agar) thường mất nhiều thời gian (24-48 giờ) để có kết quả. Điều này không đáp ứng được yêu cầu kiểm tra nhanh chóng trong sàng lọc thực phẩm. Hơn nữa, các phương pháp này có thể cho kết quả âm tính giả nếu nồng độ E. coli O157:H7 quá thấp hoặc có sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác. Mặc dù các phương pháp này có ưu điểm là đơn giản và chi phí phát hiện E. coli thấp, nhưng chúng không đủ hiệu quả để đảm bảo an toàn thực phẩm trong thời đại hiện nay.

2.2. Ảnh Hưởng Của Nền Mẫu Rau Sống Đến Kết Quả Xét Nghiệm

Nền mẫu rau sống chứa nhiều hợp chất hữu cơ và vi sinh vật tự nhiên, có thể gây nhiễu trong quá trình xét nghiệm. Các hợp chất này có thể ức chế sự phát triển của E. coli O157:H7 hoặc ảnh hưởng đến độ nhạy của các phương pháp phát hiện. Do đó, cần có các biện pháp xử lý mẫu phù hợp để loại bỏ các chất gây nhiễu và tăng cường khả năng phát hiện vi khuẩn mục tiêu. Các kỹ thuật như phân tách miễn dịch (IMS) có thể giúp tách E. coli O157:H7 khỏi nền mẫu phức tạp, nâng cao độ đặc hiệu của xét nghiệm.

III. Giải Pháp Sử Dụng Thực Khuẩn Thể Tái Tổ Hợp PPO1ccp

Một giải pháp đầy hứa hẹn để phát hiện E. coli O157:H7 trong rau sống là sử dụng thực khuẩn thể tái tổ hợp PPO1ccp. Phương pháp này dựa trên khả năng ứng dụng thực khuẩn thể (bacteriophage) để nhận diện và tấn công vi khuẩn mục tiêu. Phage tái tổ hợp PPO1ccp được thiết kế để mang gen mã hóa enzyme Cytochrome C Peroxidase (ccp). Khi phage xâm nhiễm vào E. coli O157:H7, enzyme ccp sẽ được tạo ra, cho phép phát hiện vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác. Phương pháp này có tiềm năng vượt trội so với các phương pháp truyền thống về thời gian phát hiện E. coli và độ nhạy.

3.1. Cơ Chế Hoạt Động Của Thực Khuẩn Thể Tái Tổ Hợp PPO1ccp

Thực khuẩn thể (phage) tái tổ hợp PPO1ccp được thiết kế để đặc hiệu với E. coli O157:H7. Khi phage tiếp xúc với vi khuẩn, nó sẽ bám vào bề mặt tế bào và bơm DNA của mình vào. DNA này mang gen mã hóa enzyme Cytochrome C Peroxidase (ccp). Vi khuẩn bị nhiễm sẽ tổng hợp enzyme ccp. Enzyme này có khả năng oxy hóa cơ chất, tạo ra sản phẩm có màu, cho phép phát hiện E. coli O157:H7 bằng phương pháp đo màu đơn giản.

3.2. Ưu Điểm Vượt Trội Của Phương Pháp So Với PCR và ELISA

So với các phương pháp phát hiện vi khuẩn gây bệnh phổ biến như PCR và ELISA, phương pháp sử dụng phage tái tổ hợp có nhiều ưu điểm. Thứ nhất, nó có thể nhanh hơn, vì không cần các bước chiết tách DNA hoặc protein phức tạp. Thứ hai, nó có thể rẻ hơn, vì không cần các hóa chất đắt tiền. Thứ ba, nó có thể dễ thực hiện hơn, vì không cần các thiết bị chuyên dụng. Mặc dù PCR và ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phương pháp sử dụng phage tái tổ hợp mang lại sự cân bằng tốt giữa hiệu quả, chi phí phát hiện E. coli và tính tiện dụng.

IV. Nghiên Cứu Phát Hiện E

Nghiên cứu tập trung vào việc xây dựng quy trình phát hiện E. coli O157:H7 trên bốn loại rau ăn sống phổ biến: rau xà lách, rau cải xanh, giá đỗ và rau ngò. Quy trình bao gồm các bước: (1) tăng sinh E. coli O157:H7 trong môi trường chọn lọc; (2) sử dụng phage tái tổ hợp PPO1ccp để xâm nhiễm vi khuẩn; (3) đo hoạt tính enzyme ccp để xác định sự hiện diện của E. coli O157:H7. Nghiên cứu cũng đánh giá độ nhạy và thời gian phát hiện E. coli của phương pháp, cũng như lựa chọn kháng thể phù hợp để ức chế các vi khuẩn khác.

4.1. Quy Trình Phát Hiện E. coli O157 H7 Trên Mẫu Rau

Quy trình bắt đầu bằng việc chuẩn bị mẫu rau, bao gồm rửa sạch và nghiền nhỏ. Sau đó, mẫu rau được ủ trong môi trường tăng sinh chọn lọc để tăng số lượng E. coli O157:H7. Tiếp theo, thực khuẩn thể PPO1ccp được thêm vào mẫu và ủ để phage xâm nhiễm vào vi khuẩn. Sau thời gian ủ, cơ chất của enzyme ccp được thêm vào và sự thay đổi màu sắc được đo bằng máy quang phổ. Sự thay đổi màu sắc tỷ lệ thuận với nồng độ E. coli O157:H7 trong mẫu.

4.2. Kết Quả Về Độ Nhạy Và Thời Gian Phát Hiện Của Phương Pháp

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp sử dụng phage tái tổ hợp PPO1ccp có độ nhạy cao, có thể phát hiện E. coli O157:H7 ở nồng độ rất thấp (2 CFU/g) trong các mẫu rau. Thời gian phát hiện E. coli cũng được rút ngắn đáng kể so với các phương pháp truyền thống, chỉ mất 16,5 giờ. Điều này cho phép kiểm tra an toàn thực phẩm nhanh chóng và hiệu quả hơn. Nghiên cứu cũng xác định được hỗn hợp kháng sinh vancomycin và novobiocin hiệu quả trong việc ức chế vi khuẩn nền, tăng cường khả năng phát hiện E. coli O157:H7.

V. Kết Luận Và Triển Vọng Phát Triển Phương Pháp PPO1ccp

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của thực khuẩn thể tái tổ hợp PPO1ccp trong việc phát hiện nhanh chóng và hiệu quả E. coli O157:H7 trong rau sống. Phương pháp này có độ nhạy cao, thời gian phát hiện E. coli ngắn và dễ thực hiện, phù hợp cho việc kiểm tra an toàn thực phẩm trên diện rộng. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình, mở rộng ứng dụng cho các loại thực phẩm khác và phát triển các phiên bản phage cải tiến với độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn.

5.1. Ứng Dụng Thực Tế Của Phương Pháp Trong Kiểm Nghiệm Thực Phẩm

Phương pháp này có thể được ứng dụng trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thực phẩm để sàng lọc thực phẩm và phát hiện E. coli O157:H7 một cách nhanh chóng. Nó cũng có thể được sử dụng trong các nhà máy chế biến thực phẩm để kiểm tra an toàn thực phẩm trong quá trình sản xuất. Việc áp dụng phương pháp này sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Để Hoàn Thiện Phương Pháp

Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: (1) tối ưu hóa điều kiện tăng sinh để tăng độ nhạy của phương pháp; (2) phát triển các phiên bản phage tái tổ hợp với độ đặc hiệu cao hơn, tránh phản ứng chéo với các vi khuẩn khác; (3) nghiên cứu ứng dụng phương pháp cho các loại thực phẩm khác như thịt, sữa; (4) phát triển các thiết bị phát hiện đơn giản, có thể sử dụng tại chỗ, không cần thiết bị phòng thí nghiệm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Escherichia coli O157:H7 là một chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến, liên quan đến nhiều vụ ngộ độc thực phẩm trên toàn cầu. Theo Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Bệnh tật Hoa Kỳ (CDC), mỗi năm có khoảng 73.000 trường hợp nhiễm bệnh, 2.200 trường hợp nhập viện và 60 trường hợp tử vong do E. coli O157:H7. Tại Việt Nam, thói quen sử dụng rau ăn sống làm tăng nguy cơ nhiễm vi khuẩn này, góp phần vào các vụ ngộ độc thực phẩm với tỷ lệ vi sinh vật gây bệnh chiếm từ 34% đến 49%. Năm 2016, cả nước ghi nhận 129 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 4.000 người mắc và 12 trường hợp tử vong, trong đó phần lớn do vi sinh vật gây ra.

Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình phát hiện E. coli O157:H7 trên bốn loại rau ăn sống phổ biến gồm rau xà lách, rau cải xanh, rau giá và rau ngò bằng phương pháp sử dụng thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp. Mục tiêu cụ thể là xác định độ nhạy, thời gian phát hiện và hiệu quả của phương pháp trên các mẫu rau thực tế. Thời gian nghiên cứu tập trung trong năm 2017 tại TP. Hồ Chí Minh, với ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và hỗ trợ kiểm soát dịch bệnh liên quan đến vi khuẩn E. coli O157:H7.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: lý thuyết về thực khuẩn thể (bacteriophage) và mô hình phát hiện vi khuẩn dựa trên enzyme báo hiệu. Thực khuẩn thể là virus đặc hiệu xâm nhiễm và tiêu diệt vi khuẩn chủ, có khả năng nhận diện chính xác chủng vi khuẩn mục tiêu. Mô hình tái tổ hợp thực khuẩn thể PP01ccp được xây dựng bằng cách chèn gen mã hóa enzyme Cytochrome C Peroxidase (ccp) vào bộ gen phage PPO1, cho phép phát hiện E. coli O157:H7 thông qua phản ứng đổi màu cơ chất enzyme.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp: Phage mang gen ccp, tạo enzyme báo hiệu khi xâm nhiễm E. coli O157:H7.
• Kháng sinh chọn lọc: Sử dụng novobiocin và vancomycin để ức chế vi khuẩn nền trên rau mà không ảnh hưởng đến E. coli O157:H7.
• Độ nhạy phát hiện: Khả năng phát hiện vi khuẩn ở nồng độ thấp nhất (2 CFU/g rau).
• Thời gian phát hiện: Tổng thời gian từ mẫu đến kết quả, rút ngắn so với phương pháp truyền thống.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu bao gồm các mẫu rau ăn sống (rau xà lách, rau cải xanh, rau giá, rau ngò) thu thập tại các siêu thị địa phương TP. Hồ Chí Minh. Chủng E. coli O157:H7 ATCC 43888 và thực khuẩn thể PP01ccp được sử dụng trong phòng thí nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu gồm các bước:

1. Kiểm tra hoạt tính enzyme CCP: Xác nhận sự biểu hiện gen ccp và hoạt tính enzyme trong môi trường BHI.
2. Lựa chọn kháng sinh: Thử nghiệm novobiocin và vancomycin trên môi trường BHI và mẫu rau để chọn kháng sinh ức chế vi khuẩn nền mà không ảnh hưởng đến E. coli O157:H7.
3. Xác định độ nhạy: Tăng sinh E. coli O157:H7 ở các nồng độ 10¹, 10² CFU/5g rau, sau đó phát hiện bằng phương pháp thực khuẩn thể.
4. Xác định thời gian phát hiện: Đo nồng độ vi khuẩn sau các khoảng thời gian tăng sinh khác nhau để xác định thời gian tối ưu cho phát hiện.

Phân tích dữ liệu sử dụng máy đo quang phổ để đo sự thay đổi hấp thụ tại bước sóng 550 nm, đánh giá hoạt tính enzyme CCP. Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 4 loại rau, mỗi loại được thử nghiệm nhiều lần để đảm bảo tính lặp lại và độ tin cậy. Timeline nghiên cứu kéo dài từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2017.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xác nhận gen ccp trong phage PP01ccp: Kết quả PCR cho thấy gen ccp đã được tích hợp thành công vào bộ gen phage PP01ccp, với sản phẩm khuếch đại đúng kích thước dự kiến, trong khi phage gốc PP01wt không có gen này.

2. Hoạt tính enzyme CCP: Mẫu phage PP01ccp xâm nhiễm E. coli O157:H7 tạo ra sự giảm hấp thụ tại 550 nm rõ rệt, chứng tỏ enzyme CCP được tổng hợp và hoạt động hiệu quả. Mẫu đối chứng PP01wt không có sự thay đổi hấp thụ đáng kể.

3. Lựa chọn kháng sinh: Sự kết hợp novobiocin 5 mg/L và vancomycin 10 mg/L không ảnh hưởng đến sự phát triển của E. coli O157:H7 trong môi trường BHI và trên mẫu rau, nhưng ức chế đáng kể vi khuẩn nền như Bacillus sp. Điều này giúp tăng khả năng phát hiện vi khuẩn mục tiêu.

4. Độ nhạy phát hiện: Phương pháp phát hiện bằng thực khuẩn thể PP01ccp có thể phát hiện E. coli O157:H7 ở nồng độ thấp nhất 2 CFU/g trên cả 4 loại rau sau giai đoạn tăng sinh 15 giờ, vượt trội so với phương pháp truyền thống sử dụng môi trường SMAC agar.

5. Thời gian phát hiện: Thời gian phát hiện rút ngắn còn khoảng 16,5 giờ, bao gồm giai đoạn tăng sinh và thử nghiệm enzyme, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp truyền thống mất hơn 24 giờ.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy phương pháp sử dụng thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp là một công cụ phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu đối với E. coli O157:H7 trên mẫu rau ăn sống. Việc tích hợp gen ccp tạo enzyme báo hiệu giúp nhận biết sự hiện diện của vi khuẩn thông qua phản ứng đổi màu, dễ dàng quan sát và đo lường bằng máy quang phổ.

Sự lựa chọn kháng sinh novobiocin và vancomycin là bước đột phá giúp ức chế vi khuẩn nền cạnh tranh, tạo điều kiện cho E. coli O157:H7 phát triển đủ mức để phát hiện. So với các nghiên cứu trước đây sử dụng phage mang gen huỳnh quang hoặc phát quang sinh học, phương pháp này đơn giản hơn, không cần thiết bị đắt tiền mà vẫn đảm bảo độ nhạy cao.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong hấp thụ enzyme CCP theo thời gian và bảng so sánh độ nhạy, thời gian phát hiện giữa các phương pháp. Điều này minh chứng tính ưu việt của quy trình phát hiện mới trong thực tiễn kiểm soát an toàn thực phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai quy trình phát hiện tại các cơ sở kiểm nghiệm thực phẩm: Áp dụng phương pháp PP01ccp để phát hiện E. coli O157:H7 trên rau ăn sống nhằm nâng cao hiệu quả giám sát an toàn thực phẩm, giảm thiểu nguy cơ ngộ độc. Thời gian thực hiện: trong vòng 6 tháng đầu sau khi hoàn thiện quy trình.

2. Đào tạo nhân viên kỹ thuật và cán bộ kiểm nghiệm: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật sử dụng thực khuẩn thể tái tổ hợp và phân tích enzyme CCP, đảm bảo nhân lực có năng lực vận hành chính xác. Thời gian: 3 tháng.

3. Phát triển bộ kit phát hiện thương mại: Hợp tác với các đơn vị sản xuất để phát triển bộ kit dựa trên phage PP01ccp, giúp đơn giản hóa quy trình và mở rộng ứng dụng trong ngành thực phẩm. Thời gian: 1 năm.

4. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng trên các loại thực phẩm khác: Nghiên cứu áp dụng phương pháp cho thịt, nước uống và các sản phẩm nông sản khác nhằm đa dạng hóa công cụ phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Thời gian: 1-2 năm.

5. Tăng cường phối hợp với cơ quan quản lý nhà nước: Đề xuất bổ sung phương pháp vào quy chuẩn kiểm nghiệm an toàn thực phẩm quốc gia, hỗ trợ công tác giám sát và phòng chống dịch bệnh. Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về ứng dụng thực khuẩn thể tái tổ hợp trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh, hỗ trợ phát triển đề tài liên quan.

2. Cán bộ kiểm nghiệm an toàn thực phẩm tại các phòng thí nghiệm: Áp dụng quy trình phát hiện nhanh, nhạy để nâng cao hiệu quả kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trên rau ăn sống và thực phẩm khác.

3. Doanh nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm: Sử dụng phương pháp để kiểm tra chất lượng sản phẩm, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng, giảm thiểu rủi ro ngộ độc thực phẩm.

4. Cơ quan quản lý nhà nước về an toàn thực phẩm và y tế dự phòng: Tham khảo để xây dựng chính sách, quy chuẩn kiểm nghiệm mới, nâng cao năng lực giám sát và phòng chống dịch bệnh liên quan đến E. coli O157:H7.

Câu hỏi thường gặp

1. Phương pháp phát hiện E. coli O157:H7 bằng thực khuẩn thể PP01ccp có ưu điểm gì so với phương pháp truyền thống?
   Phương pháp này có độ nhạy cao, phát hiện được nồng độ thấp 2 CFU/g rau, thời gian rút ngắn còn khoảng 16,5 giờ so với hơn 24 giờ của phương pháp truyền thống dùng môi trường SMAC agar. Ngoài ra, nó phân biệt được tế bào sống và chết nhờ cơ chế xâm nhiễm phage.

2. Tại sao cần sử dụng kháng sinh novobiocin và vancomycin trong quy trình?
   Hai kháng sinh này được chọn vì ức chế hiệu quả vi khuẩn nền trên rau mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của E. coli O157:H7, giúp tăng sinh vi khuẩn mục tiêu đủ mức để phát hiện chính xác.

3. Phương pháp này có thể áp dụng cho các loại thực phẩm khác ngoài rau không?
   Có thể mở rộng ứng dụng cho các loại thực phẩm khác như thịt, nước uống, tuy nhiên cần nghiên cứu điều chỉnh quy trình phù hợp với từng loại mẫu để đảm bảo độ nhạy và đặc hiệu.

4. Quy trình phát hiện có yêu cầu thiết bị phức tạp hay không?
   Phương pháp sử dụng máy đo quang phổ để đo hoạt tính enzyme CCP, không cần thiết bị đắt tiền như máy phát huỳnh quang hoặc PCR, giúp giảm chi phí và dễ dàng triển khai tại các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm.

5. Thời gian tổng thể để có kết quả phát hiện là bao lâu?
   Tổng thời gian từ khi lấy mẫu đến kết quả khoảng 16,5 giờ, bao gồm giai đoạn tăng sinh vi khuẩn và thử nghiệm enzyme, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp truyền thống mất hơn 24 giờ.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình phát hiện E. coli O157:H7 trên mẫu rau ăn sống bằng thực khuẩn thể tái tổ hợp PP01ccp với độ nhạy cao (2 CFU/g) và thời gian phát hiện ngắn (16,5 giờ).
• Phage PP01ccp mang gen ccp biểu hiện enzyme Cytochrome C Peroxidase, tạo tín hiệu đổi màu dễ quan sát và đo lường.
• Sự kết hợp kháng sinh novobiocin và vancomycin giúp ức chế vi khuẩn nền, tăng hiệu quả phát hiện vi khuẩn mục tiêu.
• Phương pháp có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
• Đề xuất triển khai đào tạo, phát triển bộ kit thương mại và mở rộng nghiên cứu ứng dụng trên các loại thực phẩm khác trong thời gian tới.

Luận văn này là cơ sở khoa học quan trọng để nâng cao năng lực phát hiện nhanh vi khuẩn gây bệnh trong ngành công nghệ sinh học và an toàn thực phẩm. Các đơn vị nghiên cứu, kiểm nghiệm và quản lý nhà nước nên phối hợp triển khai để phát huy hiệu quả thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

LỜI MỞ ĐẦU Escherichia coli (E. coli) tồn tại một cách tự nhiên và hầu hết không gây hại trong đường tiêu hóa, Tuy nhiên, một số chủng E. coli có thé gây bệnh cho người va một số loài động vật. Điển hình là chủng E.

coli 0157: H7 có kha năng sản xuất độc tổ Shiga, chúng là nguyên nhân chính gây hội chứng tan huyết urê với tỉ lệ tử vong 3-5% và tỉ lệ biến chứng là 25% trường hợp nhiễm. coli O157:H7 có ở động vật nhai lại đặc biệt là bò, cừu, một số động vật khác như thỏ, heo. Chúng lây truyền sang người chủ yếu qua việc tiêu thụ thực phẫm bị ô nhiễm như thịt, sữa, chưa nau chín. coli O157:H7 cũng liên quan đến việc tiêu thụ trái cây và rau quả (bao gồm giá, rau bina, rau xà lách, salad.) bị ô nhiễm do tiếp xúc với phân từ động vật hoang dã hoặc gia súc trong giai đoạn nào đó trong quá trình trồng trọt hoặc xử lý (Hugh Pennington, 2010).

Theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật (CDC) ước tính rang E. coli O157:H7 gây ra 73.000 trường hợp nhiễm bệnh, 2.200 trường hợp nhập viện, và 60 trường hợp tử vong hang năm ở Hoa Kỳ. coli O157:H7 cũng gây ra nhiều vụ ngộ độc tại nhiều nơi trên thé giới. Tại Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm đã xảy ra, đặc biệt là ngộ độc tập thé, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thé không đảm bao vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm).

Bộ Y tế cho biết năm 2016 cả nước xảy ra 129 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.139 người mắc, và 12 trường hợp tử vong, trong đó, 80% sé ca ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Trước tình hình an toản vệ sinh thực phẩm trên thế giới và Việt Nam đang diễn ra hết sức phức tạp, yêu cầu kiếm soát mam bệnh này ngày càng lớn. Do đó, việc xây dựng một kỹ thuật có thé phát hiện E. coli O157:H7 nhanh chóng, đơn giản với có độ nhạy cao đang được tập trung nghiên cứu.

Bên cạnh các kỹ thuật truyền thống, kỹ thuật sử dụng thực khuẩn thể (bacteriophage) đang hứa hẹn là một kỹ thuật tối ưu trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Thực khuẩn thé tái tổ hợp PPOlccp do TS. Hoang Anh Hoàng và công sự xây dựng năm 2015, có khả năng phát hiện E. coli O157:H7 trên môi trường chuẩn với độ nhanh và độ nhạy cao.

Tuy nhiên, để có ứng dụng thực tế trong các mẫu thực phẩm cần phải tiến hành nhiều thử nghiệm. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu dé tai: Xây dựng quy trình phát hiện E. coli O157:H7 trên mẫu rau ăn sống bằng thực khuẩn thé tái tổ hợp. Mục tiêu của đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện E.

coli O157:H7 trên bốn mẫu rau ăn sống là rau xà lách, rau cải xanh, rau giá và rau ngò băng thực khuẩn thé tái tổ hợp PP01ccp. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: — Xây dựng phương pháp giúp phát hiện E. coli O157:H7 với độ nhạy cao trong thời gian ngăn. — Đề tài góp phần bảo đảm an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, phòng tránh tác nhân gây bệnh.

Nội dung nghiên cứu: — Kiểm tra hoạt tính của thực khuẩn thể tái tổ hợp PP0Ilccp; — Lựa chọn kháng sinh phù hợp cho giai đoạn tăng sinh FE. coli O157:H7 trên các mẫu rau xà lách, rau cải xanh, rau giá và rau ngo; — Xác định độ nhạy của phương pháp; — Xác định độ nhanh của phương pháp. TONG QUAN TÀI LIEU Trang | 1. coli là vi khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3zm x 0.

coli thường có hình que, không tao bào tử, có khả năng di động, có thé phát triển ở nhiệt độ từ 5-40°C, nhiệt độ thích hợp nhất là 37°C. Chúng được mô tả lần dau tiên bởi Theodor Escherich vào năm 1885 (Trần Linh Thước, 2003). Hầu hết các chủng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hai trong đường tiêu hóa, chúng còn đóng vai trò quan trong trong việc 6n định sinh lý đường tiêu hóa.

Tuy nhiên, một số chủng E. coli có thé gây bệnh cho người và một số loai động vật. coli gây bệnh được phân loại dựa trên nhóm huyết thanh, cơ chế gây bệnh, các triệu chứng lâm sàng, hoặc các yếu tố động lực (James và cộng sự, 2004). Dựa vào cau trúc kháng nguyên, E.

coli được chia thành các kiểu huyết thanh. Với sự tổ hợp của các yếu tô kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều kiểu huyết thanh khác nhau. Mỗi kiểu huyết thanh được ký hiệu bang kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại Bì). Dựa vào vi tri gây bệnh các E.

coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E. coli gay tiên chảy (DEC-Dierrheagenic FE. coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E. coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm: EPEC (Enteropathogenic E.

coli gay bệnh đường ruột ETEC (Enterotoxigenic E. coli sinh độc tô ruột EIEC (Enteroinvasive E. coli xam nhập ruột EAEC (Enteroaggregative EF. coli ngưng tap ruột DAEC (Diffusely adherent EF.

coli bám dính phân tan EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli gây xuất huyết ruột Hai loại E. coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trong nhất là: MAEC (Meningitidis-associated E. coli gầy viêm mang não UPEC (Uropathogenic E.

coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu Trong số đó, Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) gồm hon 100 serotype có kha năng san xuất độc tô Shiga và độc tổ giống Shiga (Shiga toxin-producing E. coli) hay còn gọi E. coli có khả năng sản xuất độc tố Vero[VTEC]), chúng gây bệnh viêm đại tràng xuất huyết (Hemorrhagic Colitis_HC) và hội chứng tan huyết urê (Hemolytic Uremic Syndrome_HUS) ở người.

Một số type huyết thanh EHEC thường gây bệnh ở người như 026:H11, 091:H21, O111:H8,O157:NM, và O157:H7 (Angela và cộng sự, 1996). coli O157:H7 là serotype thường xuyên gây bệnh ở người nhất, việc nhiễm E. coli O157:H7 có thé xảy ra ở mọi lứa tuổi, và pho biến nhất là ở trẻ em và người gia. coli O157:H7 sẽ được tập trung nghiên cứu trong đề tai này.

Hiện trạng nhiễm Escherichia coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm. coli O157:H7 có ở động vật nhai lại, đặc biệt là bò, cừu, một số động vật khác như thỏ, heo. Con người có thé bị nhiễm E. coli O157:H7 do việc sử dụng các thực phẩm, nước bị bi ô nhiễm hay khi tiếp xúc với động vật, phân, đất bị nhiễm E.

coli O157:H7 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1982 như là một tác nhân gây bệnh ở người liên quan đến vụ bùng phát tiêu chảy xuất huyết ở Oregon và Michigan, Hoa Kỳ (Riley và cộng sự, 1983) và cũng liên quan đến những trường hợp HUS vao năm 1983 (Karmali và cộng sự, 2005). Kế từ đó, nhiều vụ bùng phát bệnh liên quan đến EHEC đã được báo cáo ở Hoa Ky và E. coli O157:H7 là một trong những mam bệnh chính trong thực phẩm. Sự bùng phát bệnh do nhiễm E.

coli O157:H7 lớn nhất ở Trang 3 Mỹ được báo cáo váo tháng 1 năm 1993 với hơn 700 trường hợp nhiễm bệnh và 4 trẻ em tử vong (Rangel et al. Tại Anh trong tháng 8 và tháng 9 năm 2009 có 96 ca nhiễm bệnh. 78 bệnh nhân có các triệu chứng va 17 trường hợp HUS. Sự bùng phát dịch lớn nhất đã xảy ra ở thành phố Sakai, Nhật Bản vào năm 1996, với 7966 trường hợp nhiễm khuẩn (2764 đã được xác minh băng vi sinh học, 106 trường hợp HUS) do sự dụng củ cải trang nhiễm E.

coli O157:H7 trong các bữa ăn của trường. Các trường hợp nhiễm E. coli O157:H7 cũng được ghi nhận tại Châu Phi (tại Swaziland và Nam Phi vào năm 1990), 5 6 dịch đã được ghi nhận tai Walkerton, ON, Canada, năm 2000 (Hugh Pennington, 2010). Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật (CDC) ước tính rang E.

coli O157:H7 gây ra 73.000 trường hợp nhiễm bệnh, 2.200 trường hợp nhập viện, và 60 trường hợp tử vong hang năm ở Hoa Kỳ (Mead và cộng sự, 1999). Số liệu giám sát dich bệnh từ CDC cho thay, nhiễm E. coli O157:H7 đang giảm sau đỉnh điểm vào năm 1999. Tuy nhiên, các vụ dịch bùng phát và các trường hợp nhiễm bệnh vẫn tiếp tục xảy ra.

Chỉ phí bệnh tật hàng năm do nhiễm E. coli O157:H7 khoang 405 triệu đô la, bao gồm chi phí do mat năng suất lao động, chăm sóc y tế, và tử vong sớm (Frenzen va cộng sự, 1983). Tại Việt Nam, từ ngày 8/7/2014 đến ngày 23/7/2014, xảy ra ô dịch tiêu chảy tại xã Lê Minh Xuân, huyện Bình Chánh, TP. Hồ Chí Minh.

Kết quả xét nghiệm 21 mẫu bệnh pham trong đó có 4 mẫu dương tính với E. Ô dịch tiêu chảy tại ấp 5, xã Vĩnh Lộc A, huyện Bình Chánh vào tháng 7/2014 ghi nhận 05 trường hợp tiêu chảy, trong đó có 1 trường hợp tử vong. Kết quả phân tích của viện Pasteur TP. HCM cho thay nguyên nhân gây bệnh là do nhiễm E.

Theo thống kê của bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có khoãng 250 — 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 nạn nhân và 100 — 200 ca tử vong. Trong đó, nguyên nhân ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm 34 - 49%. Theo số liệu thống kê đến năm 2012 của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, năm 2007 xảy ra nhiều nhất với 247 vụ với 7.239 trường hợp ngộ độc, số nhập viện là 5.584 ca trong đó có 55 ca tử vong. Năm 2008, có 205 vụ ngộ độc với số trường hợp nhập viện là 7.829 và 62 trường hợp tử vong, cao nhất trong cả giai đoạn.

Nhà nước đã chi trả rất nhiều tiền cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra nguyên nhân. Trang 4 Chi phí bệnh tật cao đòi hỏi những nỗ lực bố sung để kiểm soát mầm bệnh nay. Phát hiện nhanh và nhạy E. coli O157:H7 là điều cần thiết để giảm thiểu sự bùng phát của các trường hợp bệnh, và hỗ trợ cho quá trình giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm.

Cac phương pháp phát hiện Escherichia coli O157:H7 1. coli O157:H7 bang môi trường đặc hiệu Khác với hầu hết các chủng E. coli O157:H7 chỉ sử dụng nguồn dinh dưỡng là peptone, không lên men sorbitol, do đó, băng cách sử dụng môi trường Mac Conkey Sorbitol agar (SMAC) có thé phát hiện E. coli O157:H7 sẽ tạo khuẩn lạc tròn trong suốt khác với các vi khuẩn khác.

coli O157: H7 bằng môi trường SMAC có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 85% và độ chính xác 86% (Sandra và Samuel, 1986). Đề tăng tính chọn lọc agar SMAC đã được cải thiện với việc bổ sung cefixime và tellurite (CT-SMAC).