Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Trong bối cảnh y học hiện đại, các bệnh không lây nhiễm như tim mạch, ung thư, thoái hóa thần kinh và đái tháo đường đang gia tăng nhanh chóng. Các nghiên cứu bệnh sinh học đã chứng minh stress oxy hóa—tình trạng mất cân bằng giữa sự gia tăng các dạng oxy hoạt động (gốc tự do) và hệ thống phòng vệ chống oxy hóa của cơ thể—là một trong những nguyên nhân cốt lõi gây tổn thương tế bào, đột biến vật chất di truyền và thúc đẩy tiến trình bệnh lý. Nhằm ngăn ngừa và giảm thiểu tác hại của stress oxy hóa, việc sử dụng các chất chống oxy hóa được xem là giải pháp quan trọng. Tuy nhiên, các chất chống oxy hóa tổng hợp phổ biến hiện nay như butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), tert-butylhydroquinone (TBHQ) và propyl gallate (PG) đang gặp nhiều cảnh báo về độc tính, nguy cơ gây đột biến và tiềm năng sinh ung thư khi sử dụng ở liều lượng cao.
Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa và ức chế enzyme có nguồn gốc tự nhiên an toàn. Địa y (lichen) là một dạng sống cộng sinh đặc thù giữa nấm (mycobiont) và sinh vật quang hợp (tảo lục hoặc vi khuẩn lam phycobiont). Phần lớn các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học của địa y do thành phần nấm cộng sinh tổng hợp. Đáng chú ý, khi nấm cộng sinh được phân lập và nuôi cấy độc lập trong điều kiện nhân tạo, chúng có khả năng sản sinh ra các chất chuyển hóa mới không xuất hiện ở trạng thái cộng sinh tự nhiên. Mặc dù vậy, các công trình khảo sát sự tác động của môi trường nuôi cấy và thời gian thu sinh khối lên hoạt tính sinh học của nấm cộng sinh địa y, đặc biệt là loài Graphis cf. persicina, tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Trương Phú Vạn Tài (ngành Sư phạm Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2024, dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Thị Minh Định) được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.
Mục đích nghiên cứu:
Phân lập nấm cộng sinh từ địa y Graphis cf. persicina và bước đầu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy cùng thời gian nuôi cấy đến hiệu suất tạo cao, hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase của cao chiết methanol.
Nhiệm vụ nghiên cứu:
- Phân lập và thuần khiết nấm cộng sinh từ mẫu địa y Graphis cf. persicina.
- Nuôi cấy nấm Graphis cf. persicina trên 3 môi trường dinh dưỡng khác nhau gồm MY10 (Malt yeast 10% sucrose), PDA (Potato dextrose agar), S4 (Sabouraud 4% sucrose) và thu nhận sinh khối ở 3 mốc thời gian: 3 tháng, 4 tháng và 5 tháng.
- Chiết xuất cao methanol từ 9 mẫu sinh khối nấm thu được và xác định hiệu suất tạo cao (%H).
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các mẫu cao methanol thông qua phương pháp bẫy gốc tự do DPPH.
- Khảo sát năng lực khử in vitro của các mẫu cao chiết theo phương pháp Oyaizu.
- Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase in vitro của cao chiết nhằm định hướng tiềm năng hỗ trợ điều trị đái tháo đường.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Nấm cộng sinh Graphis cf. persicina được phân lập từ mẫu địa y dạng khảm thu tại thị xã Kiến Tường, tỉnh Long An (tọa độ 10.766815, 105.940536) vào tháng 10 năm 2023. Mẫu địa y được định danh khoa học bởi TS. Võ Thị Phi Giao (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM).
- Phạm vi nghiên cứu: Đề tài giới hạn trên 01 mẫu địa y thu thập tại Long An; nấm cộng sinh chỉ được khảo sát trên 3 loại môi trường (MY10, PDA, S4) với 3 mốc thời gian thu sinh khối (3, 4, 5 tháng); dung môi chiết xuất duy nhất là methanol; các thử nghiệm hoạt tính sinh học chỉ thực hiện in vitro bao gồm thử nghiệm quét gốc tự do DPPH, năng lực khử sắt và ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và tổng quan tài liệu
Khóa luận xây dựng hệ thống cơ sở lý thuyết dựa trên các trụ cột chính:
- Cơ sở sinh học về gốc tự do và stress oxy hóa: Hệ thống hóa bản chất của các gốc tự do ($O_2^{\bullet-}, H_2O_2, ^{\bullet}OH, ^1O_2$), cơ chế phân tách đồng ly liên kết cộng hóa trị, quá trình rò rỉ điện tử trong chuỗi hô hấp tế bào và cơ chế gây tổn thương lipid màng, biến tính protein, đứt gãy DNA. Đi kèm là hệ thống phòng vệ chống oxy hóa nội sinh gồm các enzyme (Superoxide dismutase - SOD, Glutathione peroxidase - GSHPO, Catalase) và các hợp chất chống oxy hóa tự nhiên (Vitamin E, Vitamin C, $\beta$-carotene, ubiquinone/coenzyme Q10).
- Cơ chế bệnh sinh đái tháo đường và enzyme $\alpha$-glucosidase: Trình bày phân loại bệnh đái tháo đường theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA 2022) và Bộ Y tế. Phân tích vai trò của enzyme $\alpha$-glucosidase tại diềm bàn chải tế bào niêm mạc ruột non trong việc thủy phân carbohydrate thành glucose tự do đi vào máu. Thuốc ức chế $\alpha$-glucosidase (như acarbose, miglitol) làm chậm hấp thu đường nhưng gây tác dụng phụ đường tiêu hóa, thúc đẩy xu hướng tìm kiếm chất ức chế tự nhiên.
- Đặc trưng sinh học của địa y và nấm cộng sinh (mycobiont): Phân loại hình thái địa y (dạng khảm/vỏ, dạng phiến/lá, dạng sợi). Phân tích mối liên hệ cộng sinh giữa nấm (chiếm ưu thế ngành Ascomycota và Basidiomycota) và quang dưỡng thể. Nhấn mạnh hiện tượng nấm cộng sinh nuôi cấy độc lập (in vitro) có thể kích hoạt các cụm gene trao đổi chất thứ cấp im lặng để sản sinh các hợp chất mới như depside, depsidone, dibenzofuran, polyphenol, xanthone.
| Loại môi trường |
Thành phần dinh dưỡng cấu tạo |
| MY10 |
Malt extract, Yeast extract, Sucrose (10%), Agar, Nước cất |
| PDA |
Khoai tây (Potato extract), Sucrose, Agar, Nước cất |
| S4 |
Peptone, Sucrose (4%), Agar, Nước cất |
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Nghiên cứu được triển khai từ tháng 10/2023 đến tháng 03/2024 tại Phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP.HCM với các quy trình cụ thể:
- Phương pháp phân lập nấm cộng sinh: Thực hiện theo quy trình của Tanaka (1991). Mẫu vỏ cây mang địa y được rửa dưới vòi nước chảy 15 phút, khử trùng bề mặt bằng cồn $70^\circ$ trong 30 giây, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Mẫu được cắt nhỏ, quan sát dưới kính hiển vi quang học, dùng micropipette hút bào tử của mycobiont cấy gạt lên môi trường MY10 trong điều kiện vô trùng.
- Phương pháp nuôi cấy sinh khối: Nấm cộng sinh sau khi thuần khiết được cắt thành các khối kích thước 1–2 mm, cấy chuyển lên 3 môi trường thử nghiệm (MY10, PDA, S4), nuôi trong điều kiện tối, nhiệt độ ổn định $18^\circ\text{C}$ theo các mốc thời gian 3, 4 và 5 tháng.
- Phương pháp tạo cao và xác định hiệu suất (%H): Sinh khối nấm tươi thu nhận được sấy khô ở $50^\circ\text{C}$, nghiền mịn, ngâm chiết kiệt bằng dung môi methanol theo tỷ lệ 1:1 trong 1–2 ngày (ngâm và thay dung môi nhiều lần đến khi dịch chiết không màu). Dịch ngâm gộp lại, lọc, cô quay chân không và để bay hơi tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày. Hiệu suất tạo cao được tính theo công thức:
$$%H = \frac{m_{\text{cao khô}}}{m_{\text{sinh khối khô}}} \times 100$$
- Phương pháp thử nghiệm bẫy gốc tự do DPPH: Đo độ giảm mật độ quang tại bước sóng 517 nm khi cho cao chiết (nồng độ thử nghiệm 1000 $\mu\text{g/mL}$) phản ứng với dung dịch DPPH 0,08 mM pha trong methanol. Đối chứng dương là acid ascorbic (30 $\mu\text{g/mL}$), đối chứng âm là dung môi methanol.
- Phương pháp xác định năng lực khử theo Oyaizu: Đánh giá khả năng khử $\text{Fe}^{3+}$ trong phức $\text{K}_3[\text{Fe}(\text{CN})_6]$ thành $\text{Fe}^{2+}$ tạo phức màu xanh Prussian $\text{Fe}_4[\text{Fe}(\text{CN})_6]_3$. Đo mật độ quang tại bước sóng 700 nm ở nồng độ mẫu 1000 $\mu\text{g/mL}$.
- Phương pháp ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase: Thử nghiệm trên phiến 96 giếng, ủ hỗn hợp enzyme $\alpha$-glucosidase (0,2 U/mL), cao chiết pha trong DMSO 5% (nồng độ thử nghiệm 200 $\mu\text{g/mL}$) và cơ chất p-nitrophenyl-$\alpha$-D-glucopyranoside (pNPG 5 mM) ở $37^\circ\text{C}$. Phản ứng dừng bằng $\text{Na}_2\text{CO}_3$ 0,2 M. Đo quang tại bước sóng 405 nm trên máy BMG Labtech CLARIOstar. Đối chứng dương là acarbose (200 $\mu\text{g/mL}$).
- Phương pháp xử lý số liệu: Tất cả thí nghiệm lặp lại 3 lần độc lập. Kết quả được biểu diễn dưới dạng Trung bình $\pm$ Độ lệch chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SD}$) và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 1 cung cấp nền tảng lý luận chuyên sâu về ba nhóm vấn đề: stress oxy hóa, bệnh đái tháo đường và địa y. Tác giả trình bày chi tiết động học hình thành gốc tự do, độ bền của các gốc tự do (gốc bậc 3 > bậc 2 > bậc 1; phenoxyl > alkoxyl), cấu trúc và chức năng xúc tác của enzyme SOD (các dạng MnSOD, CuZnSOD, FeSOD), cơ chế khử peroxide của enzyme GSHPO có chứa Selenium và không chứa Selenium, cùng chu trình tái sinh vitamin E thông qua phản ứng chuyển giao điện tử với vitamin C ($K = 1{,}55 \times 10^6,\text{M}^{-1}\text{s}^{-1}$).
Về đái tháo đường, tác giả làm rõ cơ chế tác động của phức hệ enzyme $\alpha$-glucosidase (maltase, glucoamylase, isomaltase) tại ruột non và cơ chế ức chế cạnh tranh của các hoạt chất tiềm năng. Ở phần địa y, chương tổng hợp các nghiên cứu trong và ngoài nước: nghiên cứu của Yunhee Jang (2012) trên nấm địa y Ramalina terebrata ở Nam Cực; Thiago Lopes (2008) trên Parmotrema tinctorum; Manojlovic trên Umbilicaria cylindrica; Bùi Văn Mười (2021) phân lập usneaceratin A và usneaceratin B từ Usnea ceratina; Dương Thúc Huy (2021) phân lập reticulatin từ Parmotrema reticulatum; và Trần Thị Minh Định (2024) khảo sát nấm cộng sinh Graphis handelii. Qua đó, tác giả khẳng định tính mới của đề tài khi lần đầu tiên đánh giá nấm cộng sinh Graphis cf. persicina dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu địa y tại thị xã Kiến Tường, Long An; quy trình phân lập mycobiont vô trùng; danh mục hóa chất tinh khiết của các hãng Merck, Scharlau, TCI, Sigma-Aldrich; cùng hệ thống thiết bị đo đạc chuyên dụng như nồi hấp ALP, tủ sấy Memmert, máy ly tâm, máy đo quang học và máy đọc đĩa vi thể BMG Labtech CLARIOstar. Toàn bộ thông số thực nghiệm, công thức pha chế đệm phosphate pH 6,88, nồng độ dung dịch thử nghiệm và công thức toán học tính toán hiệu suất cao, tỷ lệ bẫy gốc DPPH, tỷ lệ năng lực khử và phần trăm ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase đều được chuẩn hóa và ghi nhận rõ ràng.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu
Chương 3 trình bày các phát hiện thực nghiệm thông qua 4 nội dung chính:
- Đặc điểm sinh trưởng và hình thái khuẩn lạc: Trên môi trường MY10, nấm ban đầu có dạng sợi màu trắng, sau 3 tháng chuyển sang khuẩn lạc hình tròn, xuất hiện các lỗ li ti tiết dịch vàng nhạt và đen; đến tháng thứ 5, khuẩn lạc chuyển hoàn toàn sang màu vàng nâu nhạt, khô ráo, không còn dịch tiết. Trên môi trường PDA, nấm phát triển chiều cao, đỉnh nhô cao, bám thạch kém, dễ vỡ cấu trúc và không tiết dịch. Trên môi trường S4, khuẩn lạc phát triển không đều viền, tiết nhiều dịch màu đen từ các lỗ nhỏ trên bề mặt sau 5 tháng nuôi cấy.
- Hiệu suất tạo cao methanol: Ghi nhận sự khác biệt rõ rệt giữa các môi trường và thời gian. Môi trường MY10 cho hiệu suất chiết xuất vượt trội tại mọi thời điểm so với PDA và S4.
- Hoạt tính kháng oxy hóa và năng lực khử: Tất cả các mẫu cao chiết đều thể hiện hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH và năng lực khử ở mức trung bình - yếu ở nồng độ 1000 $\mu\text{g/mL}$ khi so với acid ascorbic. Tuy nhiên, thời gian và môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính.
- Hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase: Nghiệm thức MY10 ở thời điểm 5 tháng (MY10-5M) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất ($56{,}11%$), vượt trội so với chất đối chứng dương acarbose ($24{,}99%$) tại cùng nồng độ 200 $\mu\text{g/mL}$.
Kết quả và đóng góp
Tổng hợp số liệu thực nghiệm
Bảng dưới đây tổng hợp toàn bộ các chỉ tiêu thực nghiệm của 9 nghiệm thức nấm cộng sinh địa y Graphis cf. persicina được khảo sát trong khóa luận:
| STT |
Ký hiệu nghiệm thức |
Sinh khối khô (g) |
Khối lượng cao (g) |
Hiệu suất tạo cao (%H) |
Tỷ lệ bẫy DPPH (%) (1000 $\mu\text{g/mL}$) |
Năng lực khử (%) (1000 $\mu\text{g/mL}$) |
Tỷ lệ ức chế $\alpha$-glucosidase (%) (200 $\mu\text{g/mL}$) |
| 1 |
MY10-3M |
1,35 |
0,592 |
43,86 |
$28{,}51 \pm 0{,}16$ |
$19{,}65 \pm 0{,}24$ |
$38{,}35 \pm 4{,}69$ |
| 2 |
MY10-4M |
1,90 |
0,409 |
21,50 |
$15{,}85 \pm 0{,}47$ |
$22{,}28 \pm 0{,}40$ |
20,95 |
| 3 |
MY10-5M |
1,11 |
0,411 |
37,05 |
$31{,}87 \pm 0{,}34$ |
$21{,}28 \pm 0{,}28$ |
$56{,}11 \pm 1{,}29$ |
| 4 |
PDA-3M |
0,95 |
0,105 |
11,01 |
$6{,}52 \pm 0{,}31$ |
$10{,}08 \pm 0{,}36$ |
Rất thấp |
| 5 |
PDA-4M |
0,40 |
0,031 |
7,90 |
13,34 |
$13{,}89 \pm 0{,}17$ |
Rất thấp |
| 6 |
PDA-5M |
0,41 |
0,075 |
18,28 |
$8{,}33 \pm 0{,}42$ |
$7{,}52 \pm 0{,}13$ |
$\approx 7{,}00$ |
| 7 |
S4-3M |
0,29 |
0,032 |
11,15 |
$10{,}30 \pm 0{,}29$ |
15,26 |
0,11 |
| 8 |
S4-4M |
0,32 |
0,042 |
13,08 |
$17{,}27 \pm 0{,}32$ |
19,57 |
29,88 |
| 9 |
S4-5M |
0,48 |
0,039 |
8,05 |
$21{,}83 \pm 0{,}14$ |
$25{,}33 \pm 0{,}58$ |
21,96 |
| -- |
Vitamin C (đ/c dương) |
-- |
-- |
-- |
96,80 (ở 30 $\mu\text{g/mL}$) |
Mạnh |
-- |
| -- |
Acarbose (đ/c dương) |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
$24{,}99 \pm 1{,}29$ (ở 200 $\mu\text{g/mL}$) |
Các phát hiện và quy luật quan trọng
- Hiệu suất tạo cao chiết: Đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức MY10-3M ($43{,}86%$), gấp 5,5 lần so với nghiệm thức thấp nhất là PDA-4M ($7{,}90%$). Nhìn chung, môi trường giàu dưỡng chất malt extract và sucrose cao (MY10) hỗ trợ tích lũy sinh khối và các chất hòa tan trong methanol tốt hơn môi trường PDA và S4.
- Hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH: Nghiệm thức MY10-5M đạt tỷ lệ cao nhất ($31{,}87 \pm 0{,}34%$), cao gấp 4,88 lần nghiệm thức PDA-3M ($6{,}52%$). Môi trường S4 thể hiện xu hướng tăng dần hoạt tính kháng oxy hóa theo thời gian nuôi cấy (từ $10{,}30%$ ở 3 tháng lên $21{,}83%$ ở 5 tháng).
- Năng lực khử: Nghiệm thức S4-5M đạt giá trị cao nhất ($25{,}33 \pm 0{,}58%$), theo sau là MY10-4M ($22{,}28%$) và MY10-5M ($21{,}28%$). Các mẫu nuôi cấy trên môi trường PDA luôn thể hiện năng lực khử thấp nhất ($7{,}52% - 13{,}89%$).
- Hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase: Phát hiện quan trọng nhất của khóa luận là cao chiết nấm nuôi trên môi trường MY10 ở thời điểm 5 tháng (MY10-5M) có tỷ lệ ức chế đạt $56{,}11 \pm 1{,}29%$, cao gấp 2,24 lần so với thuốc chuẩn acarbose ($24{,}99 \pm 1{,}29%$) ở cùng nồng độ thử nghiệm 200 $\mu\text{g/mL}$. Nghiệm thức MY10-3M ($38{,}35%$) và S4-4M ($29{,}88%$) cũng cho hoạt tính cao hơn đối chứng dương.
- Tương quan sinh hóa: Tác giả chỉ ra rằng hiệu suất tạo cao chiết không tỷ lệ thuận với hoạt tính sinh học. Điển hình, mẫu MY10-3M có hiệu suất tạo cao lớn nhất ($43{,}86%$) nhưng hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase ($38{,}35%$) và bẫy DPPH ($28{,}51%$) đều thấp hơn mẫu MY10-5M (hiệu suất $37{,}05%$, ức chế $\alpha$-glucosidase $56{,}11%$). Điều này chứng minh sự tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học phụ thuộc chặt chẽ vào sự biệt hóa sinh lý của nấm ở từng giai đoạn phát triển và thành phần môi trường nuôi cấy.
Đóng góp học thuật
Đề tài là công trình nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam phân lập thành công chủng nấm mycobiont từ loài địa y Graphis cf. persicina và thiết lập dữ liệu về sự biến đổi hình thái, hiệu suất chiết xuất cùng hoạt tính sinh học (in vitro) dưới tác động của 3 loại môi trường dinh dưỡng (MY10, PDA, S4) qua các mốc thời gian 3, 4, 5 tháng. Kết quả phát hiện hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase vượt trội của cao chiết MY10-5M mở ra hướng tiếp cận triển vọng trong việc khai thác nguồn nấm cộng sinh địa y phục vụ nghiên cứu dược liệu hỗ trợ điều trị đái tháo đường.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
Dựa trên phạm vi và điều kiện thực hiện được tác giả nêu trong văn bản, đề tài tồn tại một số giới hạn:
- Mẫu địa y nghiên cứu chỉ thu thập tại một địa điểm duy nhất (thị xã Kiến Tường, tỉnh Long An) từ một cá thể đại diện.
- Nghiên cứu chỉ sử dụng 01 hệ dung môi chiết xuất đơn lẻ (methanol), chưa tiến hành phân đoạn chiết xuất phân bố trên các dung môi có độ phân cực khác nhau (như n-hexane, chloroform, ethyl acetate).
- Khảo sát hoạt tính sinh học dừng lại ở mức cao chiết thô (crude extract) và thử nghiệm in vitro ở các nồng độ cố định (1000 $\mu\text{g/mL}$ cho DPPH/năng lực khử; 200 $\mu\text{g/mL}$ cho $\alpha$-glucosidase), chưa xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ cho toàn bộ các nghiệm thức.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
Tác giả đề xuất kiến nghị: Cần tiếp tục nghiên cứu chuyên sâu nhằm phân lập, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase hiện diện trong cao chiết nấm cộng sinh địa y Graphis cf. persicina.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:
- Sinh viên, học viên ngành Sư phạm Sinh học, Sinh học, Công nghệ Sinh học và Hóa dược: Tham khảo phương pháp phân lập vi nấm từ bào tử địa y (single spore isolation), kỹ thuật nuôi cấy nấm phát triển chậm trong điều kiện vô trùng và các mô hình thử nghiệm hoạt tính sinh học vi lượng trên đĩa 96 giếng.
- Người nghiên cứu về địa y học (Lichenology) và hợp chất tự nhiên: Cung cấp thông số đối sánh về thành phần môi trường nuôi cấy (MY10, PDA, S4) ảnh hưởng đến hình thái khuẩn lạc và sự tiết dịch trao đổi chất thứ cấp của chi Graphis.
- Các phòng thí nghiệm nghiên cứu sàng lọc hoạt chất hỗ trợ điều trị đái tháo đường: Kế thừa quy trình thử nghiệm ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase sử dụng đầu đọc vi thể CLARIOstar và cơ chất pNPG.
Câu hỏi thường gặp
1. Nấm cộng sinh địa y trong đề tài được phân lập từ loài nào và thu thập ở đâu?
Nấm cộng sinh được phân lập từ mẫu địa y dạng khảm Graphis cf. persicina, thu thập trên thân cây tại thị xã Kiến Tường, tỉnh Long An (tọa độ 10.766815, 105.940536) vào tháng 10 năm 2023. Mẫu được định danh bởi TS. Võ Thị Phi Giao (Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM).
2. Ba loại môi trường nuôi cấy được thử nghiệm trong khóa luận gồm những môi trường nào và nấm được nuôi trong điều kiện gì?
Ba môi trường được sử dụng là:
- MY10 (Malt extract, Yeast extract, Sucrose 10%, Agar, Nước cất)
- PDA (Potato extract, Sucrose, Agar, Nước cất)
- S4 (Peptone, Sucrose 4%, Agar, Nước cất)
Nấm được cấy và nuôi trong buồng tối, nhiệt độ ổn định $18^\circ\text{C}$, thời gian theo dõi và thu sinh khối ở các mốc 3 tháng, 4 tháng và 5 tháng.
3. Nghiệm thức nào cho hiệu suất tạo cao chiết methanol cao nhất và thấp nhất?
Nghiệm thức cho hiệu suất tạo cao cao nhất là MY10-3M (nuôi trên môi trường MY10 trong 3 tháng) đạt $43{,}86%$ (thu được 0,592 g cao từ 1,35 g sinh khối khô). Nghiệm thức có hiệu suất thấp nhất là PDA-4M (nuôi trên môi trường PDA trong 4 tháng) chỉ đạt $7{,}90%$ (thu được 0,031 g cao từ 0,40 g sinh khối khô).
4. Kết quả ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase của cao chiết nấm Graphis cf. persicina so với đối chứng dương acarbose như thế nào?
Ở nồng độ thử nghiệm 200 $\mu\text{g/mL}$, nghiệm thức MY10-5M (nuôi 5 tháng trên MY10) thể hiện tỷ lệ ức chế mạnh nhất đạt $56{,}11 \pm 1{,}29%$, cao gấp 2,24 lần so với đối chứng dương acarbose ($24{,}99 \pm 1{,}29%$). Nghiệm thức MY10-3M ($38{,}35%$) và S4-4M ($29{,}88%$) cũng cho khả năng ức chế cao hơn acarbose.
5. Có mối tương quan thuận giữa hiệu suất tạo cao chiết và hoạt tính sinh học hay không?
Không. Kết quả thực nghiệm cho thấy hiệu suất tạo cao không quyết định mức độ hoạt tính sinh học. Mẫu MY10-3M đạt hiệu suất tạo cao lớn nhất ($43{,}86%$) nhưng hoạt tính kháng oxy hóa bẫy gốc DPPH ($28{,}51%$) và hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase ($38{,}35%$) đều thấp hơn mẫu MY10-5M (hiệu suất tạo cao $37{,}05%$, bẫy DPPH đạt $31{,}87%$, ức chế $\alpha$-glucosidase đạt $56{,}11%$).
Kết luận
Khóa luận của tác giả Phạm Trương Phú Vạn Tài đã phân lập thuần khiết thành công nấm cộng sinh từ địa y Graphis cf. persicina và đánh giá toàn diện ảnh hưởng của 3 môi trường dinh dưỡng (MY10, PDA, S4) cùng các mốc thời gian nuôi cấy (3, 4, 5 tháng) lên sự sinh trưởng, hiệu suất tạo cao và hoạt tính sinh học in vitro. Kết quả chỉ ra rằng môi trường MY10 ở thời điểm 5 tháng (MY10-5M) là điều kiện tối ưu để nấm tổng hợp hoạt chất ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase với tỷ lệ đạt $56{,}11%$, vượt trội so với thuốc chuẩn acarbose. Công trình cung cấp dữ liệu thực nghiệm có giá trị khoa học về sinh học vi nấm cộng sinh địa y và định hướng tiềm năng phân lập các hoạt chất tự nhiên ứng dụng trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường.
