Khóa luận: Phân lập, tuyển chọn vi nấm đối kháng S. rolfsii thối gốc lạc - Vũ Thị Huế

Khám phá khóa luận tốt nghiệp của Vũ Thị Huế, tập trung vào các khía cạnh quan trọng của ngành in ấn. Nghiên cứu phân tích công nghệ, quy trình và quản lý

• Tác giả: Vũ Thị Huế
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Xuân Cảnh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Vi sinh
• Đề tài: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi nấm có khả năng đối kháng nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thối gốc lạc
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh thối gốc lạc do nấm Sclerotium rolfsii

Nấm Sclerotium rolfsii là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên cây lạc, dẫn đến thối gốc và giảm năng suất nghiêm trọng. Bệnh lây lan nhanh trong điều kiện nóng ẩm, tạo ra các hạch nấm bền vững trong đất. Phương pháp hóa học để kiểm soát bệnh thường gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Do đó, nghiên cứu về các biện pháp kiểm soát sinh học, đặc biệt là sử dụng vi nấm đối kháng, đang được quan tâm. Các loài vi nấm như Trichoderma đã chứng minh khả năng ức chế sự phát triển của S. rolfsii thông qua nhiều cơ chế khác nhau. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi nấm có hiệu quả đối kháng cao từ tự nhiên là bước đầu tiên quan trọng để phát triển chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường.

1.1. Đặc điểm gây hại của nấm Sclerotium rolfsii trên lạc

Nấm Sclerotium rolfsii xâm nhiễm vào vùng gốc thân cây lạc, gây ra hiện tượng thối nhũn. Các sợi nấm màu trắng phát triển bao phủ bề mặt mô bệnh. Tác nhân này hình thành hạch nấm (sclerotia) có khả năng tồn tại nhiều năm trong đất. Điều kiện nhiệt độ cao và độ ẩm lớn là yếu tố thuận lợi cho bệnh bùng phát. Bệnh gây hại trên diện rộng, làm cây chết hàng loạt, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng nông sản.

1.2. Hạn chế của biện pháp phòng trừ hóa học và hướng đi sinh học

Sử dụng thuốc hóa học để trừ nấm S. rolfsii gây ra nhiều vấn đề như tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trong nông sản, ô nhiễm đất và nước. Nấm bệnh cũng có thể phát sinh tính kháng thuốc. Hướng đi bền vững hơn là áp dụng kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng các vi sinh vật đối kháng. Phương pháp này an toàn, thân thiện với môi trường và không để lại dư lượng độc hại. Các vi nấm đối kháng như Trichoderma là ứng cử viên tiềm năng.

II. Phân tích cơ chế đối kháng của vi nấm với S

Vi nấm đối kháng ức chế S. rolfsii thông qua nhiều cơ chế phức tạp. Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian là phổ biến, trong đó vi nấm đối kháng phát triển nhanh hơn, chiếm ưu thế và ngăn cản sự phát triển của mầm bệnh. Một số loài tiết ra các chất kháng sinh (chất chuyển hóa) có hoạt tính kháng nấm trực tiếp. Cơ chế ký sinh và tiêu diệt nấm bệnh cũng được ghi nhận, ví dụ như enzym chitinase phân hủy vách tế bào của nấm gây hại. Ngoài ra, vi nấm đối kháng còn có thể kích thích hệ thống phòng thủ tự nhiên của cây trồng. Việc hiểu rõ các cơ chế này giúp tuyển chọn được các chủng vi nấm có hiệu quả cao và ứng dụng hiệu quả trong thực tế sản xuất nông nghiệp.

2.1. Cạnh tranh và kháng sinh thể

Cạnh tranh là cơ chế cơ bản, nơi vi nấm đối kháng tranh chấp nguồn dinh dưỡng và không gian sống với S. rolfsii. Các chủng Trichoderma thường phát triển rất nhanh, bao phủ và cô lập mầm bệnh. Kháng sinh thể là các hợp chất hóa học được vi nấm tiết ra môi trường, có khả năng ức chế trực tiếp sự nảy mầm của bào tử hoặc phát triển sợi nấm của S. rolfsii. Sự kết hợp hai cơ chế này tạo nên hiệu quả đối kháng mạnh mẽ.

2.2. Ký sinh và enzym phân giải

Một số vi nấm có thể ký sinh trực tiếp trên sợi nấm hoặc hạch nấm của S. rolfsii. Chúng tiết ra các enzyme thủy phân như chitinase, glucanase và cellulase. Các enzyme này phân hủy chitin và cellulose, những thành phần chính của vách tế bào nấm gây bệnh, dẫn đến sự phá hủy tế bào nấm. Khả năng sinh enzyme này là một tiêu chí quan trọng để tuyển chọn các chủng vi nấm đối kháng hiệu quả trong nghiên cứu.

III. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi nấm đối kháng hiệu quả

Quy trình phân lập và tuyển chọn vi nấm đối kháng đòi hỏi sự nghiêm ngặt và có nhiều bước. Mẫu đất được thu thập từ các vùng có hệ vi sinh vật đa dạng, thường là vùng rễ cây khỏe mạnh. Vi nấm được phân lập trên môi trường chọn lọc và làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử. Khả năng đối kháng được đánh giá ban đầu bằng kỹ thuật đồng nuôi cấy trên đĩa thạch với nấm S. rolfsii. Các chủng cho thấy vòng ức chế lớn sẽ được chọn để thử nghiệm sâu hơn. Các tiêu chí đánh giá bổ sung bao gồm khả năng sinh enzyme như cellulase và chitinase, tốc độ phát triển, và tính ổn định di truyền. Các chủng ưu tú nhất sẽ được giữ giống và nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

3.1. Kỹ thuật đồng nuôi cấy đánh giá đối kháng

Kỹ thuật đồng nuôi cấy là phương pháp trực quan và thường dùng để sàng lọc nhanh các chủng vi nấm đối kháng. Môi trường thạch PDA được sử dụng, với nấm đối kháng và nấm S. rolfsii được cấy cách nhau một khoảng cố định trên cùng đĩa petri. Sau thời gian nuôi cấy, đường kính vùng ức chế giữa hai loài nấm được đo đạc. Chủng nào tạo ra vùng ức chế lớn hơn thì có tiềm năng đối kháng cao hơn. Phương pháp này giúp loại bỏ nhanh các chủng không hiệu quả.

3.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme thủy phân

Để đánh giá cơ chế tác động, khả năng sinh enzyme cellulase và chitinase của vi nấm đối kháng được khảo sát. Môi trường thạch chứa cellulose hoặc chitin được dùng. Vi nấm được cấy vào tâm đĩa, sau thời gian nuôi cấy, thuốc thử được thêm vào để quan sát vòng phân giải. Vòng phân giải lớn cho thấy hoạt tính enzyme mạnh, liên quan trực tiếp đến khả năng phân hủy vách tế bào của nấm S. rolfsii. Đây là tiêu chí sinh hóa quan trọng trong tuyển chọn.

IV. Kết luận và ứng dụng tiềm năng của vi nấm đối kháng

Nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi nấm đối kháng có tiềm năng cao chống lại nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thối gốc lạc. Các chủng này thể hiện hiệu quả ức chế rõ rệt trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả này là cơ sở khoa học để phát triển các chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh cho cây lạc. Ứng dụng của vi nấm đối kháng không chỉ giúp giảm thiệt hại do bệnh mà còn giảm sự phụ thuộc vào thuốc hóa học, góp phần vào sản xuất nông nghiệp bền vững. Các bước tiếp theo cần tiến hành thử nghiệm trên đồng ruộng để đánh giá hiệu quả thực tế, tối ưu liều lượng và phương thức sử dụng trước khi đưa vào ứng dụng rộng rãi.

4.1. Tiềm năng phát triển chế phẩm sinh học

Các chủng vi nấm đối kháng tuyển chọn có thể được nghiên cứu để sản xuất thành chế phẩm sinh học dạng bột hoặc dạng lỏng. Chế phẩm này có thể được sử dụng để xử lý hạt giống, bón vào đất hoặc phun lên vùng gốc cây. Đây là giải pháp kiểm soát dịch bệnh thân thiện với môi trường, phù hợp với xu hướng nông nghiệp hữu cơ và bền vững. Việc thương mại hóa đòi hỏi thêm các nghiên cứu về quy trình sản xuất, bảo quản và hiệu quả trên diện rộng.

4.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và thách thức

Nghiên cứu cần được mở rộng để thử nghiệm hiệu quả của các chủng vi nấm trên đồng ruộng với nhiều giống lạc và điều kiện canh tác khác nhau. Cần đánh giá khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật bản địa trong đất. Thách thức lớn là duy trì sự sống sót và hiệu quả của vi nấm đối kháng trong điều kiện biến đổi của môi trường. Việc kết hợp nhiều chủng vi nấm hoặc kết hợp với biện pháp canh tác khác cũng là hướng nghiên cứu hứa hẹn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm thuận lợi cho việc chuyển hóa các chất hữu cơ thành khoáng chất cho cây trồng và vật nuôi. Bên cạnh đó cũng là điều kiện cho một số loại bệnh trên cây trồng phát triển. Các cây trồng bị bệnh do nhiễm vi khuẩn, virus, côn trùng, tuyến trùng và nấm bệnh gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng. Bệnh do nấm gây ra thì chiếm 80% bệnh hại ở cây trồng (Someya, 2008).

Một số loại nấm gây bệnh trên cây cũng có khả năng tạo các chất chuyển hóa bậc hai gọi là độc tố nấm. Độc tố nấm có thể lẫn vào thực phẩm của người hoặc động vật và gây ra hiện tượng nhiễm độc tố nấm. flavus tạo ra các độc tố aflatoxin, một trong những nhóm độc tố quan trọng nhất. Các afltoxin có trong các sản phẩm như lạc và ngô.

Độc tố nấm được sản sinh ra từ các sợi nấm và ngấm vào giá thể (như hạt, rơm hay trái cây) Hình 1. Aspergillus flavus hình thành bào tử trên hạt lạc bị nhiễm bệnh trên môi trường phân lập (Nguồn: Burgess L. 2009) Lạc là loại cây trồng có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ, thuộc họ đậu. Bệnh thối thân trên lạc do nấm Sclerotium rolfsii gây nên.

rolfsii là một 1 những loại nấm đất điển hình gây hại vùng rễ ở cây trồng cạn. Nguồn bệnh của nấm tồn tại chủ yếu trong đất, trong tàn dư thực vật dưới dạng sợi nấm, hạch nấm. Hiện nay, cây lạc đang được áp dụng khoa học kỹ thuật nên cho sản lượng khá cao, đóng góp vào sự phát triển của nền kinh tế. Tuy nhiên, việc phát triển và tăng sản lượng lạc gặp nhiều khó khăn, trong đó khó nhất là phòng và trị bệnh cho cây.

Biện pháp được người nông dân sử dụng chính là dùng thuốc diệt nấm hóa học để kiểm soát bệnh ở cây trồng, có khả năng kiểm soát bệnh nhanh, ít tốn công và hiệu quả cao, nhưng ảnh hưởng của việc lạm dụng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp sẽ rất nặng nề. Nguồn nước ngầm bị ô nhiễm, hệ sinh thái bị hủy hoại và con người là chuỗi cuối cùng gánh chịu hậu quả. Do đó, kết hợp các biện pháp kiểm soát dịch bệnh khác nhau được đề xuất để quản lý bền vững bệnh do nấm S. rolfsii và nấm khác gây ra của cây lạc.

Trong thời điểm này, kiểm soát sinh học có thể là giải pháp thay thế hoặc thêm vào áp dụng cho việc quản lý nấm S. (Dey và cs. 2004; Tonelli và cs. Các nghiên cứu về nấm đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii hiện nay vẫn còn khá hạn chế, nên việc tìm kiếm những chủng nấm đối kháng là cần thiết.

Nhận thấy tính cấp thiết đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi nấm có khả năng đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thối gốc lạc”. Mục đích, yêu cầu của đề tài 1. Mục đích - Phân lập và tuyển chọn được chủng vi nấm đối kháng với nấm gây bệnh thối gốc mốc trắng trên lạc. Yêu cầu - Phân lập được chủng vi nấm từ mẫu đất trồng lạc - Tuyển chọn được chủng vi nấm đối kháng nấm S.

rolfsii gây bệnh thối gốc lạc 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về cây lạc 2. Nguồn gốc Cây lạc (Arachis hypogaea L.) thuộc họ đậu và chi Arachis. Loài duy nhất đóng vai trò quan trọng về kinh tế là Arachis hypogae L., nằm trong số những loại cây quan trọng.

Có hai phân loài A. hypogaea, có kiểu phân nhánh và phân bố theo trục sinh dưỡng và sinh sản. Loài Teproo hypogaea có hai giống (hypogaea và hirusta), trong khi phân loài của Fastigiata có bốn giống (fastigiata, vulgaris, peruviana và aequatoriana) (J. Cây lạc có nguồn gốc từ Nam Mỹ và được vận chuyển xuống phía Tây bởi những người Tây Ban Nha, các dân buôn đã đưa đến quần đảo Malayan, Trung Quốc, Indonesia và cuối cùng là Madagascar (Krapovickas, 1968).

Và trong quá trình thuộc địa hóa, lạc được vận chuyển từ Nam Mỹ xuống phía phía đông – Châu Phi. Đặc điểm sinh học Cây lạc là cây hai lá mầm, có hệ rễ cọc, thân được chia ra làm nhiều đốt, lá và hoa của lạc được mọc ra từ những mắt của đốt. Rễ cái do rễ mầm của hạt lớn lên và tạo thành, rễ cái có thể đâm sâu xuống đất đến 2m. Còn rễ nhánh và rễ con tập trung phần lớn ở gần mặt đất.

Cũng như rễ của các cây họ đậu khác, rễ cây lạc có nhiều nốt sần. Các nốt sần trên rễ cây họ đậu được tạo nên do sự cộng sinh của vi khuẩn cố định đạm Rhizobium. Thân cây lạc lúc còn non có hình tròn, đến lúc già thì có cạnh và rỗng ruột. Trên thân có nhiều lông ngắn và lông tơ.

Chiều cao của thân thay đổi trong khoảng 19-80cm do khí hậu, nơi trồng. Lá cây lạc có dạng lá kép hình lông chim, mỗi lá kép thường có 4 lá chét, một số trường hợp có 3 hoặc 5 lá chét. Hình ảnh giải phẫu hình thái của cây lạc (Nguồn: Rao, 1988) Cây lạc có thể cao đến 30 - 60 cm, thân có lông, góc ốc với các nhánh xòe ra, các lá mọc xen kẽ. Cây lạc có hệ thống rễ dùng được bao phủ bởi các nốt sần ở rễ do sự cộng sinh của vi khuẩn cố định đạm.

Cây lạc đứng thứ 13 trong danh sách cây lương thực thế giới và đứng đầu danh sách cây lấy dầu cả về diện tích và sản lượng năm 2009. Cây lạc được trồng trên 23,5 triệu ha với tổng sản lượng ước tính là 35,5 triệu tấn (FAO, 2011). Hiện tại tại Trung Quốc là nước sản xuất là hàng đầu thế giới đối với thị phần khoảng 37,5%. Tổng sản lượng của thế giới, tiếp theo là Ấn Độ, Mỹ (USA), Argentina và Việt Nam.

Ấn Độ có diện tích trồng là lớn nhất, nhưng năng suất trung bình thấp, xấp xỉ chỉ 1,0 triệu tấn/ha, Mỹ có năng suất trung bình cao nhất là 3,8 tấn/ha. Tại Việt Nam, sản lượng hạt cao nhất là 0,53 triệu tấn với diện tích trồng là 249,200 ha năm 2009. Cây lạc thích hợp trồng trên những loại đất có thành phần cơ giới nhẹ và thoát nước tốt như đất cát pha, đất thịt nhẹ như đồng bằng Bắc Bộ, Trung bộ, Tây Nguyên và Nam Bộ. Các giống lạc được gieo trồng nhiều ở Việt Nam chủ yếu là các giống chín sớm, có thời gian sinh trưởng là 100-125 ngày.

Các giống lạc chín muộn với thời gian sinh trưởng trên 160 ngày, phần lớn là thuộc loại hình phân nhánh nhiều, thường được dùng để trồng xen trong các vườn trồng cây lâu năm, với mục đích chủ yếu để làm cây phủ đất. Phân loại Cây lạc có tên khoa học là Arachis hypogaea Giới (regnum): Plantae Bộ (ordo): Fabales Họ (familia): Fabaceae 2. Giá trị sử dụng Tất cả các bộ phận của cây lạc có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Phần lớn hạt lạc được sử dụng để sản xuất dầu lạc, ở Mỹ khoảng 60% các sản phẩm được chế biến, sản xuất theo nhiều cách thức khác nhau và được dùng làm thực phẩm.

Hạt, thân và lá của cây lạc cũng được sử dụng làm thức ăn cho lợn và gia súc ở một số khu vực. Arachis hypogaea là cây trồng hằng năm và là một trong số ít loài cây trồng hình thành quả dưới đất. Khô dầu lạc sau ép còn sót lại có chứa một lượng lớn nitơ, phốt pho và kali sử dụng làm phân bón. Và cũng là một nguồn protein quan trọng trong thức ăn gia súc và gia cầm có thể được sử dụng làm chất xơ nhân tạo.

Vỏ lạc được sử dụng sản xuất ván thô và các sản phẩm thay thế nút chai (Cuong N. Ngoài việc tạo ra năng suất, đem lại hiệu quả kinh tế cao thì cây lạc còn là loại cây trồng có khả năng cải tạo đất rất tốt. Khả năng cộng sinh của nhóm vi khuẩn cố định đạm sống cộng sinh ở rễ cây lạc, chúng có khả năng cố định đạm từ nguồn N2 trong không khí làm tăng hàm lượng đạm trong đất, dẫn đến tăng độ phì của đất. Bên cạnh đó cây lạc còn đem lại nhiều về giá trị kinh tế.

Lạc là một trong những loại thực phẩm cung cấp lượng dinh dưỡng cao cho con người. Theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), trong 100g hạt lạc có chứa khoảng 567 kcal, các chất béo (lipid) là 49g, chất đạm là 26g, chất xơ 9g, đường 4g; các nguyên tố khoáng như natri, kali, sắt, calci, magnesi có hàm lượng cao lần lượt là 18 mg,705 mg, 4,6 mg, 92 mg, 168mg và hàm lượng vitamin B6 trong lạc là 0,3 mg không đáng kể. Lạc là nguyên liệu quan trọng để chế biến công nghiệp thành dầu béo. Việc sử dụng lượng mỡ lấy từ động vật sẽ gây ra những ảnh hưởng không tốt đến 5 sức khỏe con người, đó lại là ưu điểm của dầu lạc khi khắc phục được nhược điểm đó.

Ngoài ra, các bộ phận khác của cây lạc còn được sử dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón cho cây trồng,… 2. Tổng quan về nấm Sclerotium rolfsii 2. Giới thiệu về nấm Nấm Sclerotium rolfsii là một trong những nấm có nguồn gốc từ đất với số lượng ký chủ lớn, hơn 500 loài. Nơi phân bố đa dạng và rộng, thường được tìm thấy ở các vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới và các vùng ôn đới khác trên thế giới (Aycock, 1966).

Nấm Sclerotium thuộc: Giới (Kingdom) :Nấm Nghành (Phylun) :Basidicmycetes Lớp (Class) :Agaricomycetes Bộ (Order) : Athelials Họ (Family) : Atheliaceaa Chi (Genus) : Athelia Số lượng lớn hạch nấm do S. rolfsii tạo ra và khả năng chúng tồn tại trong đất có thể đến vài năm; nguồn bệnh của nấm tồn tại chủ yếu trong đất, trong tàn dư thực vật dưới dạng sợi và hạch nấm. Sợi nấm của S. rolfsii tồn tại tốt nhất trong đất cát, trong khi hạch nấm tồn tại tốt nhất trong điều kiện ẩm, hiếu khí được tìm thấy ở bề mặt đất.

Năm 1892, Peter Henry Rolfs lần đầu tiên công bố mô tả về một loại bệnh mới tìm thấy trên cà chua, nơi mà một số cánh đồng ở Florida cho thấy tỷ lệ hao hụt hơn 70%. Năm 2011, nấm được Saccardo đặt tên là Sclerotium rolfsii (Grecher, 1995). Các mô tả về bệnh do S. rolfsii gây nên ở Connecticut, Louisiana, Bắc Carolina, Nhật Bản, Ceylon và Ấn Độ đã được xuất bản vào đầu những năm 1900.

Năm 1928, Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) báo cáo rằng S. rolfsii và tuyến trùng nút rễ gây ra nhiều thiệt hại ở các bang miền nam hơn bất kỳ nấm bệnh nào khác. Trong nửa đầu thế kỷ XX, sản xuất lạc bị thiệt hại từ 10-20 triệu đô la 6 hàng năm do mầm bệnh này.