Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Melanin và con đường tổng hợp sắc tố trong da 1. Cấu trúc của da Da bao phủ bên ngoài cơ thể người và gồm 3 loại mô: biểu bì (epidermis), chân bì (dermis) và hạ bì (hypodemis) (Hình 1. Lớp biểu bì là lớp trên cùng của da, và có 3 loại tế bào gọi là keratinocyte, melanocytes và langerhans.
Tế bào keratinocytes được làm từ keratin, khi trưởng thành sẽ mất nước và chuyển lên lớp trên cùng của biểu bì gọi là lớp sừng. Tiếp theo là tế bào melanocyte tạo nên melanin, quyết định màu da. Tế bào langerhans ngăn chăn sự xâm nhập của các vật lạ không mong muốn vào da. Điều kiện của biểu bì sẽ quyết định sự tươi và trẻ của lớp da.
Lớp giữa của da là chân bì, trong đó collagen và elastin là thành phần chính chiếm 90% của chân bì và liên kết chéo nhau để làm vững chắc da. Vì vậy, lớp chân bì có nhiệm vụ củng cố về cấu trúc và độ dẻo dai của da. Ngoài collagen và elastin, chất hyaluronic acid cũng là thành phần của lớp chân bì, và đóng vai trò giữ độ ẩm. Lớp dưới cùng của da là các mô liên kết và mỡ.
Sự mất đi của lớp dưới da này do tuổi tác và dẫn đến sự võng và nếp nhăn của da. Cấu tạo da người [51] 3 1. Sắc tố melanin, vai trò và sự tổng hợp trong tế bào 1. Sắc tố melanin và vai trò trong cơ thể Melanin là sắc tố phổ biến ở vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật.
Màu da và lông của động vật được quyết định bởi hàm lượng và sự phân bố của melanin trong cơ thể. Ở động vật, melanin được tạo ra trong các tế bào biểu bì hắc tố (melanocyte). Sắc tố melanin là yếu tố quan trọng bảo vệ cơ thể khỏi tia UV từ mặt trời, chống oxi hóa và chống ung thư da. Đối với người có da sáng màu, khả năng bị ung thư da cao gấp 30-40 lần so với người da tối màu.
Sự mất đi melanin bất thường dẫn đến mất thẩm mỹ và vấn đề da liễu ở người. Ngược lại, tổng hợp và tích tụ nhiều melanin gây rối loạn da như hiện tượng da đổi màu (tại nách, bẹnvà cổ), sạm da mặt, thâm mắt, tàn nhang, suy giảm thần kinh liên quan tới Parkinson’s và nguy cơ ung thư da [14]. Sự tổng hợp melanin trong cơ thể Tổng hợp melanin là con đường phức tạp có liên quan đến các phản ứng enzyme và phản ứng hóa học. Tế bào biểu bì tạo hắc tố tổng hợp 2 loại melanin: eumelanin (nâu và đen) và pheomelanin (đỏ và vàng).
Quá trình tổng hợp melanin được khởi đầu bằng việc oxi hóa L-tyrosine thành dopaquinone (DQ) bởi enzyme tyrosinase (TYR) và DQ sau đó được tự động chuyển hóa thành chất trung gian có màu cam là Dopa-chrome (Hình 1. Dopa-chrome phân giải thành dihydroxyindole (DHI) và dihydroxyidole- 2carboxylicacid (DHICA), bởi TRP-2 (tautomerase, DCT).Cuối cùng, các DHI và DHICA được oxi hóa tạo thành eumelanin. TRP-1 được cho là oxi hóa DHICA thành eumelanin. Song song với quá trình đó, DQ được chuyển hóa thành 5 - S- cysteinyl dopa hoặc glutothionyldopa với sự có mặt của cystein hoặc glutathione.
Sự oxi hóa tiếp theo tạo nên chất trung gian benzothiazine và cuối cùng thành pheomelanin. Mặc dù cả 3 enzyme TYR, TRP-1 và TRP-2 đều liên quan đến hình thành melanin nhưng TYR là enzym đặc biệt cần thiết cho quá trình này. Tổng hợp sắc tố xảy ra trong bào quan melanosome, dẫn đến sản xuất eumelanin (nâu và đen) và/hoặc pheomelanin (vàng và đỏ) [15] Các tế bào biểu bì melanocyte, ước tính chiếm tỉ lệ nhỏ 1/36 so với tế bào tạo keratin (keratinocyte). Bào quan melanosome trong melanocyte là nơi tổng hợp melanin và được vận chuyển tới tế bào keratinocyte ở lớp biểu bì.
Trong điều kiện sinh lý bình thường, melanin là có lợi để bảo vệ da khỏi ánh sáng mặt trời (tia UV có hại). Quá trình điều khiển tổng hợp melanin ở động vật ở nhiều mức độ khác nhau, từ mức độ gen trong quá trình phát triển phôi, mức độ tế bào thông qua tạo bào quan melanosome, mức độ dưới tế bào biểu hiện gen TYR, TRP-1, TRP-2 và khi vận chuyển sắc tố melanin từ tế bào melanocyte đến keratinocyte, nơi tạo màu [29]. Sự giảm sắc tố có thể đạt được thông qua các cơ chế khác, nhưng một đích chính là điều hòa hoạt tính enzyme TYR để hạn chế tốc độ tổng hợp melanin [18]. Ảnh hưởng tia cực tím UV làm hư hại da Tia cực tím (UV) gồm các tia: UVC có bước sóng từ 100 đến 290 nm chủ yếu được lọc bởi khí quyển; tia UVA có bước sóng từ 320 đến 400 nm và UVB với bước sóng từ 290 đến 320 nm sẽ gây sạm da và vết nhăn… tia UV sẽ dẫn đến cảm ứng các gốc tự do hoạt động (reactive oxygen species, ROS) và làm mất các enzyme chống oxi hóa.
Hậu quả, các áp lực oxi hóa này dẫn đến rối loạn ở da như 5 tăng sắc tố (điểm tối ở da), già sớm và khô. Sự tích tụ ROS dẫn đến kích thích sự hoạt động enzyme TYR và tổng hợp bất thường melanin. Yếu tố ROS đóng vai trò quan trọng để điều hòa tổng hợp melanin và việc bao vây gốc ROS sẽ giúp giảm tổng hợp melanin cảm ứng bởi tia UV [32]. Sự tăng sắc tố melanin và ảnh hưởng lên làn da Việc tổng hợp và tích tụ quá nhiều melanin dẫn đến các rối loạn về màu sắc da, bao gồm các đốm nâu, nám da, tàn nhang và tăng sắc tố sau viêm, hoặc ung thư da (Hình 1.
Enzyme TYR là enzyme quan trọng xúc tác cho hầu hết các phản ứng trong quá trình tổng hợp melanin. Do đó việc tìm ra các chất ức chế enzyme TYR là cần thiết để làm giảm tổng hợp nên melanin. Một số triệu chứng ở da do tích tụ quá nhiều melanin [52] 6 Điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tập trung vào xác định, phân lập, tổng hợp cũng như đặc tính hóa các chất ức chế enzyme mới, hoạt tính tốt cho các ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và y học [18]. Tuy nhiên, rất ít chất ức chế đạt chất lượng dùng cho thử nghiệm lâm sàng.
Tyrosinase và chất ức chế enzyme 1. Enzyme tyrosinase TYR là enzyme có cấu trúc chứa 2 ion Cu++, bao quanh bởi 3 histidine và chịu trách nhiệm hoạt động xúc tác cho các phản ứng sinh hóa (Hình 1. Cấu trúc tinh thể tyrosinase tách từ cây Junglan regia [33] Enzyme TYR đầu tiên được phân tách từ nấm lớn. Sau đó, enzyme TYR được tách và tinh sạch từ nhiều nguồn như vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật.
Phân tử lượng trung bình khoảng từ 13,4 kDa tới 128 kDa tùy nguồn gốc. Về cấu trúc, enzyme TYR chứa 3 domain: domain trung tâm, domain đuôi N và domain đuôi C. Domain trung tâm chứa 6 axit amin,và phối hợp với 2 ion Cu++ (CuA và CuB) [3]. Về chức năng, enzyme TYR xúc tác phản ứng o-hydroxylation các monophenols thành o-diphenol (hoạt tính monophenolase) và sau đó oxi hóa thành 7 o-quinone (hoạt tính diphenolase) sử dụng nguyên tử oxi.
Sau đó, o-quinone được polyme hóa thành các sắc tố nâu-đen thông qua các phản ứng enzyme và không enzyme. Hai phản ứng này của enzyme TYR là cơ sở để phát triển và ứng dụng enzyme TYR trong công nghệ sinh học, ví dụ như cảm biến sinh học để kiểm soát hàm lượng phenolic trong chất thải, nước, đất và thức ăn; trong công nghệ dược để chuyển hóa L-tyrosine thành L-DOPA, làm thuốc chữa bệnh Parkinson’s, sản xuất melanin, lignin, flavonoid hoặc tanin. Hiện nay, nguồn enzyme TYR thương mại chủ yếu được cung cấp từ vi sinh vật như nấm Agaricus bisporus và xạ khuẩn Streptomyces. Vai trò khác của TYR TYR trong phản ứng làm nâu hoa quả: Là kết quả của phản ứng oxi hóa các chất phenolic thành quinone và sau đó chất này tiếp tục bị oxi hóa và polymer hóa tự động dẫn đến tạo chất phân tử lượng cao, melanin.
Sự nâu hóa hoa quả, rau là không mong muốn. TYR để đáp ứng lại với stress và chống lại bệnh truyền nhiễm: Vì đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn, virus nên melanin và các chất trung gian là thành phần chữa vết thương và đáp ứng miễn dịch của một số ngành không xương, chân khớp, thực vật và nấm. Ở thực vật, melanin để bảo vệ thực vật khỏi côn trùng và vật gây bệnh. Ở côn trùng, TYR có tác dụng làm cứng bộ khung sau khi lột xác, thay lông hoặc bị thương.
TYR trong xử lý môi trường: Sự có mặt của phenol và chất màu trong môi trường có thể gây nên các vấn đề môi trường và sức khỏe nghiêm trọng. Vì vậy, sử dụng các enzyme có hoạt tính oxi hóa từ nấm được cho là giải pháp sinh học thân thiện để xử lý hợp chất phenol như chlorophenol, fluorophenol và catechol [19]. TYR còn làm chất cảm biến để đo hàm lượng phenol, chlorophenol và fluorophenol trong nước thải công nghiệp, sản phẩm thực phẩm và mỹ phẩm. 8 TYR trong phản ứng sinh tổng hợp: Dùng sản xuất sinh học các polymer như lignin, flavonoids, melanin và tannin, L-DOPA, là thuốc hiệu quả trong điều trị Parkinson’s và các tổn thương thần kinh [14].
Phân bố của TYR trong tự nhiên TYR phổ biến ở các loài, từ vi khuẩn đến động vật, đóng vai trò quan trọng như tạo màu da, lông ở động vật, phản ứng miễn dịch và lành vết thương ở thực vật cũng như nấm, tạo nâu ở hoa quả và rau, hệ thống bảo vệ ở động vật chân khớp, biệt hóa cơ quan và tạo bào tử ở nấm… Vi khuẩn Pseudomonas, Bacillus, Myrothecium, Miriococcum, Streptomyces cũng tổng hợp TYR. Các nấm như Neurosporacrassa, A.bisporus, Lentinulaedodes, Ascovaginospora, Trametes, A.niger sản xuất TYR và đã được nghiên cứu [17], [23]. Sự phân bố rộng rãi của tyrosinase [1] 9 1. Các chất ức chế enzym TYR Phần lớn các mỹ phẩm hoặc tác nhân trắng da sử dụng hoạt chất ức chế enzymeTYR (Hình 1.
Nhiều chất ức chế enzyme TYR hiện nay đang sử dụng như hydroquinon (HQ), arbutin, kojic acid, azelaic acid, L-ascobic acid, ellgalic acid, tranexamic acid đã và đang được sử dụng để làm trắng da nhưng lại có những hạn chế nhất định như các phản ứng phụ [40], [50]. Cấu trúc các chất ức chế TYR đã biết, được sử dụng trong mỹ phẩm [33] Chất HQ là chất từ VSV, mặc dù có công dụng ức chế enzyme TYR nhưng tiềm ẩn rủi ro đột biến lên tế bào và liên quan đến các phản ứng như viêm da, dị ứng, ban đỏ, cháy da, bạch bì, đốm nâu móng, nhược sắc, rối loạn sắc tố… Arbutin là sản phẩm thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật,có hoạt tính chống oxy hóa, tuy nhiên cấu trúc không bền vững dẫn đến giải phóng hydroquinone và bị chuyển hóa thành benzen gây độc đến tủy xương.