MỞ ĐẦU Bệnh viêm gan vi rút C hiện nay đang là một vấn đề y tế toàn cầu. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới, tỉ lệ nhiễm HCV trên thế giới khoảng 3,1%, tương đương 170 triệu người, với số nhiễm mới 3-4 triệu người mỗi năm [10] [24] [57] .Tổng chi phí y tế dành cho chẩn đoán và điều trị cũng như phòng viêm gan vi rút C dự đoán tăng từ 30 tỷ USD vào năm 2009 lên đến hơn 85 tỷ USD vào năm 2024. Nếu không điều trị, viêm gan vi rút C diễn biến thành biến chứng xơ gan, ung thư gan và có thể dẫn đến tử vong [31] [57]. Tỉ lệ nhiễm HCV dẫn đến xơ gan là 15-20% sau 20 năm.
Tỷ lệ ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HCV chiếm khoảng 1,4-3,3% mỗi năm, trong đó, tử vong là 2,6-4% [57]. Ở Việt Nam 510% dân số nhiễm HCV [12]. Viêm gan vi rút C là một bệnh nguy hiểm vì triệu chứng lâm sàng thường không rõ ràng, 90% trường hợp không có triệu chứng, trong khi đó hậu quả của bệnh để lại thường rất nặng nề. Có 50%-80% viêm gan vi rút C chuyển thành mạn tính, 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan [4] [30].
Do đó, xác định chính xác tác nhân HCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ. Vi rút viêm gan C được phân thành 6 kiểu gen ký hiệu bằng số từ 1 đến 6 và phân ra các kiểu gen phụ ký hiệu bằng chữ a,b,c,…[52]. Ngoài xét nghiệm tìm kháng thể kháng HCV, xác định số lượng vi rút trong máu để chẩn đoán tình trạng nhiễm HCV, xác định kiểu gen trước khi điều trị có thể tiên đoán khả năng đáp ứng, xác định thời gian điều trị và dự đoán hiệu quả điều trị kháng vi rút [21] [28]. Tại Việt nam, nghiên cứu về kiểu gen HCV được tiến hành từ năm 1994 [40], tuy nhiên, từ đó đến nay, có một số nghiên cứu thực hiện trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu với nước ngoài và được thực hiện ở nước ngoài.
Ngoài ra, số lượng nghiên cứu còn rất hạn chế. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu phân loại kiểu gen dựa vào trình tự đoạn 5’ không mã hóa của bộ gen HCV. Nhưng hiện nay, việc phân loại theo hình thức này không chính xác do vi rút thuộc kiểu gen 6 của HCV có trình tự đoạn này giống với các chủng thuộc kiểu gen 1 nên có sự phân loại nhầm lẫn giữa hai kiểu gen này. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Do vậy, các tác giả đã khuyến cáo sử dụng trình tự đoạn core, E1 hoặc NS5B cho phân loại kiểu gen của HCV.
Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương là cơ sở hàng đầu về chẩn đoán, điều trị các bệnh truyền nhiễm nói chung, đặc biệt là các bệnh viêm gan trong đó có viêm gan vi rút C nói riêng. Vì vậy, nhu cầu chẩn đoán bệnh sớm và chính xác càng cấp thiết. Từ năm 2010, chúng tôi đã tiến hành triển khai kỹ thuật xác định kiểu gen HCV bằng kỹ thuật giải trình tự gen vùng core của HCV giúp chẩn đoán và điều trị bệnh. Qua hơn 1 năm triển khai chúng tôi đã thu được các kết quả nhất định.
Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định sự phân bố các genotype của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự gen ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương năm 2010-2011” với các mục tiêu sau: 1. Xác định các kiểu gen của HCV ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen HCV với một số đặc điểm về dịch tễ học và cận lâm sàng. CHƢƠNG 1 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TỔNG QUAN 1.
Vi rút viêm gan C 1. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút Vi rút viêm gan C được phát hiện năm 1989 do nhóm nghiên cứu của M. Houghto ở Chiron California Mỹ kết hợp với nhóm nghiên cứu của D. Sau nhiều năm nghiên cứu, lần đầu tiên trong lịch sử ngành Vi sinh học, một tác nhân gây bệnh mới được khám phá bằng kỹ thuật sinh học phân tử trước khi có được các hiểu biết về hình thái vi rút, cấu trúc protein, tính kháng nguyên, trước cả khi tác nhân này được nuôi cấy, phân lập thành công.
Vi rút viêm gan C là thành viên của họ Flaviviridae, là một thể hình cầu có đường kính 55-65 nm, và có các vỏ ngoài với các gai nhú nhỏ khoảng 6 nm, bao quanh một cấu trúc nucleocapsid 30-35 nm có cấu trúc đối xứng 20 mặt [5] [6] [51]. Glycoprotein vỏ Lõi RNA Vỏ 60nm Hình 1:Mô hình cấu trúc của HCV[58] 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hệ gen của HCV có kích thước khoảng 9,6 kb có chức năng như mRNA làm khuôn tổng hợp protein. HCV phân lập được từ các bệnh nhân thuộc các khu vực khác nhau trên thế giới có thể khác nhau về kích thước hệ gen. Cấu trúc RNA của HCV bao gồm hai đầu tận cùng 5’ và 3’ không mã hóa, ở giữa là vùng mã hóa cho protein cấu trúc (C, E1, E2) và protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B).
Giữa các sợi HCV riêng biệt, giữa các kiểu phụ và kiểu gen khác nhau thì độ tương đồng về trình tự 5’-NC tối thiểu hơn 90%. Vì vậy, khu vực này thường được áp dụng để xác định nhiễm HCV bằng kỹ thuật PCR. Ngược lại, trình tự của NS5B, khu vực core hoặc E1 thay đổi nhiều hơn, nhưng được coi là tiêu chuẩn vàng sử dụng để xác định và phân biệt các kiểu gen HCV [47] [50]. Gen mã hoá polyprotein Protein cấu trúc Protein không cấu trúc Glycoprotein vỏ Proteases Co-factors RNA polymerase RNA Nucleocapsid Protein Protein kháng helicase xuyên màng interferon Hình 2: RNA của HCV [58] Tương tự như tất cả vi rút khác, HCV không thể tự tái bản vì nó không có đầy đủ các nguyên liệu cần thiết.
Vì vậy, để tái bản, vi rút phải nhiễm vào tế bào vật chủ và sử dụng bộ máy sao chép của tế bào, bao gồm các enzyme và protein. Sau khi nhiễm vào tế bào vật chủ, các bước tái bản của HCV sẽ xảy ra trong tế bào chất. Hệ gen của HCV mã hoá cho tối thiểu 10 protein vi rút khác nhau, bao gồm các 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com protein cấu trúc (protein vỏ và protein lõi) giúp hình thành vỏ capsid và các protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) liên quan đến quá trình tái bản của vi rút. Các nghiên cứu gần đây đã làm sáng tỏ chức năng của nhiều protein trong số này.
Tuy nhiên, vai trò của một vài protein cũng như một số khía cạnh của quá trình tái bản vi rút và mối tương quan giữa protein vi rút và tế bào chủ vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ. Nguyên nhân của việc này là do HCV không thể gây nhiễm nhân tạo trên các dòng tế bào hiện có tại các phòng thí nghiệm trên thế giới. Đây chính là một trong những trở ngại lớn trong việc tìm hiểu cặn kẽ về vi rút này. Một điểm quan trọng nữa là vi rút này có khả năng biến thể nhanh và tạo thành rất nhiều kiểu gen và kiểu gen phụ kháng thuốc.
Do vậy, hiện nay vẫn chưa có một loại vắc xin nào có hiệu quả đối với HCV [7] [57] 1. Chu trình tái bản của HCV [42] Vi rút HCV Vi rút HCV mới Tế bào chất Tế bào Nhân gan Thể golgi Hình 3: Chu trình sống của HCV 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Gắn vào tế bào vật chủ: HCV gắn vào tế bào chủ nhờ các tương tác giữa lớp vỏ protein của vi rút (protein E1 và E2) với các phân tử là thụ thể bề mặt khảm trên màng ngoài tế bào đích. - Xâm nhập vào tế bào chủ và cởi lớp vỏ bọc, giải phóng RNA vi rút, HCV đi vào tế bào đích chủ yếu do cơ chế ẩm bào nhờ thụ thể. Khi HCV gắn lên bề mặt thụ thể, các tế bào đồng hóa thụ thể sẽ hình thành một túi màng mỏng chứa HCV.
Sau khi vào trong tế bào, HCV sẽ giải phóng hệ gen vào tế bào chất của tế bào chủ và bắt đầu quá trình tái bản. - Dịch mã hệ gen HCV thành protein vi rút: Khi được giải phóng, RNA của HCV được dùng làm khuôn để tổng hợp các protein của nó. HCV sử dụng các thành phần của tế bào chủ, đặc biệt là ribosome để tiến hành dịch mã. Quá trình này chỉ đòi hỏi một vài thành phần trong bộ máy dịch mã của tế bào chủ.
Điều đó cho phép HCV khởi động dịch mã hiệu quả ngay cả khi các điều kiện tế bào không thuận lợi. Sản phẩm đầu tiên của quá trình dịch mã là một sợi polyprotein dài khoảng 3000 axit amin có chứa tất cả 10 protein vi rút cần cho quá trình tái bản của HCV. Đây là quá trình then chốt đối với HCV vì nếu không có các protein quan trọng này sẽ không tạo được các vi rút mới. - Tái bản hệ gen HCV: Quá trình tái bản xảy ra nhờ enzyme polymerase NS5B, là một protein không thuộc nhóm cấu trúc, tổng hợp RNA trên sợi khuôn RNA gồm hai bước chính: 1) hệ gen vi rút được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi RNA âm và 2) sợi RNA âm sau đó được dùng làm khuôn để tổng hợp sợi RNA dương của HCV mới.
Hai sợi RNA mới tổng hợp có thể gắn với nhau hình thành RNA sợi đôi, trong khi đó, tế bào cho rằng RNA sợi đôi là báo hiệu nhiễm vi rút và sẽ kích hoạt hàng rào phòng thủ của tế bào để ngăn chặn quá trình tái bản và phá hủy RNA vi rút. Hơn nữa, polymerase HCV không thể đọc được từ RNA đang ở dạng sợi đôi. Vì vậy, để tránh hàng rào phòng thủ của tế bào và duy trì quá trình tái bản, HCV phải giữ cho các sợi RNA âm và dương tách rời nhau. Lúc này enzyme helicase, nằm trong vùng trình tự mã hóa cho protein không thuộc nhóm cấu trúc 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NS3, thực hiện nhiệm vụ bằng cách bám vào và tách các sợi RNA ra trong suốt quá trình tái bản hệ gen.
- Kết hợp tạo vi rút mới và giải phóng chúng ra khỏi tế bào chủ: Các hạt vi rút HCV mới bao gồm 3 thành phần chính là sợi đơn RNA hệ gen HCV, vỏ capsid và lớp vỏ bọc của vi rút.