I. Nghiên cứu endochitinase
Nghiên cứu endochitinase là trọng tâm của luận án, tập trung vào việc phân lập và nghiên cứu tính chất của enzyme này từ Bacillus thuringiensis. Endochitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân hủy chitin thành các sản phẩm hòa tan như chitooligosaccharide. Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại, đặc biệt trong nông nghiệp. Luận án đã xác định được các điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp endochitinase, bao gồm thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH và nguồn cơ chất. Kết quả nghiên cứu cho thấy Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất chế phẩm sinh học.
1.1. Phân lập và sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis
Quá trình phân lập và sàng lọc Bacillus thuringiensis được thực hiện từ các mẫu đất và thực vật tại Việt Nam. Các chủng vi khuẩn được đánh giá dựa trên khả năng sinh tổng hợp endochitinase thông qua phương pháp đo hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy 36 chủng vi khuẩn có khả năng sinh endochitinase cao, trong đó chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 nổi bật với hoạt tính enzyme mạnh. Đây là cơ sở quan trọng để nghiên cứu sâu hơn về gen mã hóa endochitinase và ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học.
1.2. Điều kiện tối ưu sinh tổng hợp endochitinase
Nghiên cứu đã xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp endochitinase, bao gồm thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH và nguồn cơ chất. Kết quả cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu là 72 giờ, nhiệt độ 30°C và pH 7.0. Nguồn cơ chất chitin dạng keo được chứng minh là hiệu quả nhất trong việc kích thích sinh tổng hợp enzyme. Những phát hiện này giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất endochitinase, mở ra tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp.
II. Tách dòng endochitinase
Tách dòng endochitinase là bước quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme này. Luận án đã thành công trong việc tách dòng gen chiA mã hóa endochitinase từ Bacillus thuringiensis và biểu hiện gen này trong Escherichia coli. Quá trình tách dòng bao gồm các bước như khuếch đại gen, thiết kế vector biểu hiện và chuyển gen vào tế bào chủ. Kết quả cho thấy endochitinase tái tổ hợp có hoạt tính cao và ổn định, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học.
2.1. Khuếch đại và thiết kế vector biểu hiện
Gen chiA được khuếch đại bằng phương pháp PCR từ DNA của Bacillus thuringiensis. Sau đó, gen được gắn vào vector pET28b(+) và chuyển vào Escherichia coli. Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot xác nhận sự biểu hiện thành công của endochitinase tái tổ hợp. Đây là bước quan trọng trong việc tạo ra nguồn enzyme ổn định và dồi dào cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính enzyme
Endochitinase tái tổ hợp được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực và đánh giá hoạt tính thông qua phương pháp đo thủy phân chitin. Kết quả cho thấy enzyme có hoạt tính cao và ổn định trong điều kiện tối ưu. Nghiên cứu cũng xác định được nhiệt độ tối ưu (40°C) và pH tối ưu (7.0) cho hoạt động của enzyme. Những phát hiện này góp phần quan trọng trong việc ứng dụng endochitinase trong nông nghiệp và công nghiệp.
III. Ứng dụng trong nông nghiệp
Ứng dụng trong nông nghiệp là mục tiêu chính của luận án, tập trung vào việc sử dụng endochitinase để kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại. Kết quả nghiên cứu cho thấy endochitinase tái tổ hợp có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, đồng thời tăng cường hiệu quả diệt côn trùng của protein tinh thể Cry. Những phát hiện này mở ra tiềm năng ứng dụng endochitinase trong sản xuất chế phẩm sinh học thế hệ mới, thân thiện với môi trường và an toàn cho sức khỏe con người.
3.1. Khả năng kháng nấm của endochitinase
Nghiên cứu đã chứng minh khả năng ức chế nấm bệnh của endochitinase tái tổ hợp. Enzyme này có thể phân hủy thành tế bào chitin của nấm, ngăn chặn sự phát triển của chúng. Kết quả thử nghiệm cho thấy endochitinase ức chế hiệu quả nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, mở ra tiềm năng ứng dụng trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng.
3.2. Tăng cường hiệu quả diệt côn trùng
Endochitinase tái tổ hợp được chứng minh có khả năng tăng cường hiệu quả diệt côn trùng của protein tinh thể Cry. Kết quả thử nghiệm trên sâu tơ và sâu khoang cho thấy sự kết hợp giữa endochitinase và Cry tạo ra hiệu quả diệt côn trùng cao hơn so với việc sử dụng riêng lẻ. Điều này góp phần phát triển các chế phẩm sinh học đa chức năng, vừa diệt côn trùng vừa kiểm soát nấm bệnh.
