Luận án tiến sĩ tách dòng biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ bacillus thuringiensis phân lập ở việt nam

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tách dòng biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ bacillus thuringiensis phân lập ở, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng

• Tác giả: Trịnh Thị Thu Hà
• Người hướng dẫn: Ngô Đình Bính
• Trường học: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Nghiên cứu endochitinase

Nghiên cứu endochitinase là trọng tâm của luận án, tập trung vào việc phân lập và nghiên cứu tính chất của enzyme này từ Bacillus thuringiensis. Endochitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân hủy chitin thành các sản phẩm hòa tan như chitooligosaccharide. Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại, đặc biệt trong nông nghiệp. Luận án đã xác định được các điều kiện tối ưu để sinh tổng hợp endochitinase, bao gồm thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH và nguồn cơ chất. Kết quả nghiên cứu cho thấy Bacillus thuringiensis phân lập tại Việt Nam có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất chế phẩm sinh học.

1.1. Phân lập và sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis

Quá trình phân lập và sàng lọc Bacillus thuringiensis được thực hiện từ các mẫu đất và thực vật tại Việt Nam. Các chủng vi khuẩn được đánh giá dựa trên khả năng sinh tổng hợp endochitinase thông qua phương pháp đo hoạt tính enzyme. Kết quả cho thấy 36 chủng vi khuẩn có khả năng sinh endochitinase cao, trong đó chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 nổi bật với hoạt tính enzyme mạnh. Đây là cơ sở quan trọng để nghiên cứu sâu hơn về gen mã hóa endochitinase và ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học.

1.2. Điều kiện tối ưu sinh tổng hợp endochitinase

Nghiên cứu đã xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp endochitinase, bao gồm thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH và nguồn cơ chất. Kết quả cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu là 72 giờ, nhiệt độ 30°C và pH 7.0. Nguồn cơ chất chitin dạng keo được chứng minh là hiệu quả nhất trong việc kích thích sinh tổng hợp enzyme. Những phát hiện này giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất endochitinase, mở ra tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp.

II. Tách dòng endochitinase

Tách dòng endochitinase là bước quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme này. Luận án đã thành công trong việc tách dòng gen chiA mã hóa endochitinase từ Bacillus thuringiensis và biểu hiện gen này trong Escherichia coli. Quá trình tách dòng bao gồm các bước như khuếch đại gen, thiết kế vector biểu hiện và chuyển gen vào tế bào chủ. Kết quả cho thấy endochitinase tái tổ hợp có hoạt tính cao và ổn định, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học.

2.1. Khuếch đại và thiết kế vector biểu hiện

Gen chiA được khuếch đại bằng phương pháp PCR từ DNA của Bacillus thuringiensis. Sau đó, gen được gắn vào vector pET28b(+) và chuyển vào Escherichia coli. Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot xác nhận sự biểu hiện thành công của endochitinase tái tổ hợp. Đây là bước quan trọng trong việc tạo ra nguồn enzyme ổn định và dồi dào cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.2. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính enzyme

Endochitinase tái tổ hợp được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực và đánh giá hoạt tính thông qua phương pháp đo thủy phân chitin. Kết quả cho thấy enzyme có hoạt tính cao và ổn định trong điều kiện tối ưu. Nghiên cứu cũng xác định được nhiệt độ tối ưu (40°C) và pH tối ưu (7.0) cho hoạt động của enzyme. Những phát hiện này góp phần quan trọng trong việc ứng dụng endochitinase trong nông nghiệp và công nghiệp.

III. Ứng dụng trong nông nghiệp

Ứng dụng trong nông nghiệp là mục tiêu chính của luận án, tập trung vào việc sử dụng endochitinase để kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại. Kết quả nghiên cứu cho thấy endochitinase tái tổ hợp có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, đồng thời tăng cường hiệu quả diệt côn trùng của protein tinh thể Cry. Những phát hiện này mở ra tiềm năng ứng dụng endochitinase trong sản xuất chế phẩm sinh học thế hệ mới, thân thiện với môi trường và an toàn cho sức khỏe con người.

3.1. Khả năng kháng nấm của endochitinase

Nghiên cứu đã chứng minh khả năng ức chế nấm bệnh của endochitinase tái tổ hợp. Enzyme này có thể phân hủy thành tế bào chitin của nấm, ngăn chặn sự phát triển của chúng. Kết quả thử nghiệm cho thấy endochitinase ức chế hiệu quả nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, mở ra tiềm năng ứng dụng trong việc kiểm soát bệnh hại cây trồng.

3.2. Tăng cường hiệu quả diệt côn trùng

Endochitinase tái tổ hợp được chứng minh có khả năng tăng cường hiệu quả diệt côn trùng của protein tinh thể Cry. Kết quả thử nghiệm trên sâu tơ và sâu khoang cho thấy sự kết hợp giữa endochitinase và Cry tạo ra hiệu quả diệt côn trùng cao hơn so với việc sử dụng riêng lẻ. Điều này góp phần phát triển các chế phẩm sinh học đa chức năng, vừa diệt côn trùng vừa kiểm soát nấm bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU…………………………………………………………. 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1. Vi khu n Bacillus thuringiensis………………………………… 5 1. S phát tri n và ng ng c chitin s t.

thuringi nsis tr n th gi i 7 1. Cấu trúc c chitin s …………………………………………………. C ch ho t ộng c chitin s ………………………………………. Các y u t nh h ng n ho t t nh c chitin s ………………….

Các y u t nh h ng n quá tr nh sinh t ng h p chitin s. Hệ i u hiện Esch richi co i. Một s y u t nh h ng n quá tr nh n m n t ng h p chitin s tái t h p………………………………………………………………… 29 1. Thu h i và tinh s ch chitin s tái t h p…………………………….

Ứng d ng c a chitinase. Trong nông nghiệp và o vệ môi tr ng. Ứng d ng trong công nghiệp. Ứng d ng trong y c.

Ứng d ng trong c tính sinh kh i nấm. Ứng d ng trong công nghệ sinh học. Sơ lƣ c về tình hình sâu bệnh hại cây trồng……………………. 36 iv Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.

Vật liệu nghiên cứu. Ch ng gi ng và p smi ………………………………………………… 39 2. Môi tr ng nuôi cấy……………………………………………………… 40 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.

Ph ng pháp vi sinh. Ph ng pháp hó sinh. Ph ng pháp sinh học phân tử. T i u i u kiện i u hiện th o ph ng pháp mặt áp ng.

Nghiên c u tính chất hóa lý c a chitinase tái t h p. Ph ng pháp thử nghiệm. 57 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3. Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……………………………………………… 58 3.

Ph n p vi khu n. Phân lo i i loài các ch ng B. Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki……………………………………………………….

Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 65 3. Sàng ọc ho t t nh kháng nấm c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 66 3.

Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var. Th i gian nuôi cấy……………………………………………………… 67 3. Nhiệt ộ nuôi cấy………………………………………………………. pH môi tr ng nuôi cấy……………………………………………….

Môi tr ng thay th ……………………………………………………. Nhân d ng gen chiA mã h a chitinase từ ch ng vi khu n B.4 Biểu hiện gen chiA trong vi khu n E. Thi t k vector bi u hiện gen chiA trong vi khu n E. Bi u hiện chiA tái t h p trong E.

Nghiên c u i u kiện bi u hiện gen chiA c a ch ng tái t h p……. T i u kh năng i u hiện rChi ằng ph ng pháp mặt áp ng………………………………………………………………………. Ki m tra s t ng th ch giữa mô hình và th c nghiệm. Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………….

Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 90 3. Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt………………………………………… 90 3. pH t i u và ộ b n pH…………………………………………………. Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 92 3.

Ảnh h ng c a chất t y rử ……………………………………………. Ảnh h ng c a dung môi hữu c ………………………………………. Động học c a ph n ng nzym ………………………………………. S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitin s …………………….

Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p……………………… 95 3. Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p…. Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p……. 97 Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 99 4.

Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……………………………………………. Ph n p vi khu n. Phân lo i i loài kurstaki các ch ng B. Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng.

thuringi nsis s rov r kurst ki…………………………………………………………. Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng. thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………. Sàng lọc ho t tính kháng nấm c các ch ng.

thuringi nsis serovar kurst ki………………………………………………………. Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var. Th i gi n nuôi cấy………………………………………………………. Nhiệt ộ nuôi cấy………………………………………………………… 103 4.

pH môi tr ng nuôi cấy…………………………………………………. Môi tr ng thay th ……………………………………………………. Phân tích trình t gen chiA và cấu trúc mô phỏng c a protein ChiA ………………………………. Biểu hiện rChiA trong vi khu n E.

Bi u hiện rChiA trong vi khu n………………………………………… 108 4. T i u i u kiện bi u hiện………………………………………………. T i u kh năng i u hiện rChiA bằng ph ng pháp mặt áp ng……………………………………………………………………… 112 vii 4. Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………… 113 4.

Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 114 4. Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt………………………………………… 114 4. pH t i u và ộ b n pH………………………………………………… 115 4. Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 115 4.

Ảnh h ng c chất t y rử. Ảnh h ng c a dung môi hữu c. Động học c a ph n ng enzym. S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitinase.

Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p. Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p. Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p. 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

122 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 123 TÓM TẮT KẾT QUẢ LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH. 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO………. 130 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ch viết tắt Ch viết ầy Bp Base pair BSA Bovine serum albumin – albumin huyết thanh bò BT Chế phẩm Bacillus thuringiensis Bt Bacillus thuringiensis Btk Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Colloidal chitin Chitin dạng keo cs Cộng sự chiA Gen mã hóa chitinase ĐC Đối chứng dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribo Nucleotide 5‟- Triphosphate DNS 3,5 - dinitrosalicylic E.

coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid EtBr Ethidium Bromide g/l Gam/lít GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)2 Diacetyl-chitobiose (GlcNAc)3 Triacetyl-chitotriose (GlcNAc)4 Tetraacetyl-chitotetraose IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside – chất cảm ứng Kana Kanamycine kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria –Bertani – môi trường nuôi cấy vi khuẩn MTCS Môi trường cơ sở OD Optical density - mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi ix PDA Môi trường khoai tây rChiA Chitinase tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulphate Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium SDS-PAGE doecyl sulfat Sol Solution – dung dịch TAE Tris acetic acid EDTA TE Tris EDTA U Unit - đơn vị v/p Vòng/phút X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside x DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Thành phần các môi trường nuôi cấy………………………… 40 Bảng 2. Thành phần và nồng độ các loại dung dịch…………………. Kết quả phân lập và kết quả xác định hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập………………………………………… 60 Bảng 3.

Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh………………… 62 Bảng 3. Hoạt tính thủy phân chitin của các chủng Btk………………. Hoạt tính kháng nấm của các chủng sinh chitinase…………. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino acid……….

Sinh trưởng của tế bào và hoạt tính enzym ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau………………………………………………. Kết quả của 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng…………. Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase………………… 85 Bảng 3. Kết quả kiểm tra giữa mô hình và thực nghiệm……………… 88 Bảng 3.

Kết quả tinh sạch chitinase tái tổ hợp………………………. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính enzym của rChiA……………………………………………. Các thông số động học của rChiA với các cơ chất khác nhau. Nồng độ gây chết 50% (LC50) của protein tinh thể Cry và rChiA………………………………………………………….

98 xi DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đồ cấu tạo tế bào Bt……………………………………. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên tiêm mao H……………………………. Cấu trúc không gian họ chitinase 19….

Sự tương đồng vùng xúc tác của chiA74 với chitinase của các loài khác…………………. Cơ chế hoạt động của enzym chitinase ở Trichoderma. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller…………………………………. Đồ thị đường chuẩn hàm lượng BSA theo Bradford……… 45 Hình 2.

Bản đồ 7 vùng địa lý của Việt Nam………………………. Khuẩn lạc vi khuẩn Bt trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy…………………………………………………… 59 Hình 3. Hình dạng tinh thể dưới kính hiển vi của một số chủng Bt. Hình ảnh ngưng kết của Bt với huyết thanh đ c hiệu 4D4.

Hình ảnh sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của một số chủng Bt (A) và hoạt tính chitinase của 11 chủng Bt có đường kính vòng phân giải ≥ 25mm (B)…. Kết quả sàng lọc gen chiA t các chủng Btk phân lập ở Hà Nội……………………………………. Ảnh kháng nấm R. oxysporum (B) của các chủng Btk………………………………………………….

Ảnh hưởng của thời gian (A) và nhiệt độ nuôi cấy (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase…………………………. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất (A) và nồng độ cơ chất (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase……………………… 68 Hình 3. Ảnh hưởng của pH môi trường (A) và nguồn các bon (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase……………………… 69 xii Hình 3. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ lên khả năng sinh tổng hợp chitinase…………………………………………………… 70 Hình 3.

Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen chiA t các dòng khuẩn lạc trắng (A) và điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết t các khuẩn lạc dòng pGEM-Teasy/MSS1.1 trên gel 1% agarose (B)……………………………………. So sánh trình tự nucleotide đoạn gen chiA của chủng B.1 với trình tự EF581163. So sánh trình tự amino acid của chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 với trình tự có mã số ABQ65137.2 trên ngân hàng dữ liệu……………………… 73 Hình 3.

Cấu trúc 3 vùng của protein ChiA………………………… 74 Hình 3. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen chiA……… 75 Hình 3. Điện di đồ gen chiA (A) và vector pET28b(+) tinh sạch (B) 76 Hình 3. Kết quả PCR khuẩn lạc các dòng biến nạp mang gen chiA với c p mồi đ c hiệu (A) và cắt vector tái tổ hợp pET28b/chiA với EcoRI và XhoI (B)……………….

Phổ điện di protein trên gel SDS-PAGE ……. Phân tích Western blot (A) và kết quả kiểm tra hoạt tính chitinase của dịch chiết protein tái tổ hợp trên đĩa thạch (B)…………. Phổ điện di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau……………………………………………….