Nghiên cứu thử nghiệm dòng nấm kí sinh côn trùng beauveria sp và isaria fumosorosea bb v3 ứng dụng trong phòng trừ sinh học rệp sáp planococcus citri

Nấm ký sinh côn trùng đã trở thành một giải pháp tiềm năng trong việc phòng trừ rệp sáp, một trong… 98 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2022.

• Tác giả: Nguyễn Thiện Minh Tâm
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Bảo Châu
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu, Thử Nghiệm Dòng Nấm Ký Sinh Côn Trùng Beauveria sp. Và Isaria fumosorosea Bb-V3 Ứng Dụng Trong Phòng Trừ Sinh Học Rệp Sáp Planococcus citri
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ RỆP SÁP
• 1.1.1. Phân bố và kí chủ của rệp sáp
• 1.1.2. Tập tính sinh sống và gây hại của rệp sáp
• 1.1.3. Đặc điểm hình thái của rệp sáp
• 1.1.4. Đặc điểm sinh sản của rệp sáp
• 1.1.5. Vòng đời của rệp sáp
• 1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG
• 1.2.1. Khái niệm nấm kí sinh côn trùng
• 1.2.2. Chu trình sống và lây nhiễm của nấm kí sinh côn trùng
• 1.3. TỔNG QUAN VỀ NẤM Beauveria sp.
• 1.3.1. Phân bố và kí chủ của nấm Beauveria sp.
• 1.3.2. Đặc điểm hình thái của nấm Beauveria sp.
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 2.2. Nấm kí sinh côn trùng sử dụng trong phòng thí nghiệm
• 2.3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu chính
• 2.5. Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm
• 2.6. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
• 2.6.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.6.2. Nhân nuôi nguồn rệp sáp
• 2.6.3. Phương pháp định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng dựa trên hình thái và kỹ thuật sinh học phân tử
• 2.6.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm Beauveria sp.
• 2.6.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của chủng nấm Beauveria sp.
• 2.6.6. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp.
• 2.6.7. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp.
• 2.6.8. Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm kí sinh côn trùng ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 2.6.9. Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Beauveria sp. ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 2.6.10. Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp Planococcus ở quy mô phòng thí nghiệm
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG Beauveria sp. DỰA TRÊN HÌNH THÁI VÀ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
• 3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái chủng nấm ký sinh côn trùng Beauveria sp.
• 3.1.2. Kết quả hỗ trợ định danh chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp. bằng phương pháp sinh học phân tử
• 3.1.3. TIẾN HÀNH GIỮ CHỦNG NẤM Beauveria sp. TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM
• 3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM Beauveria sp.
• 3.2.1. Khảo sát hiệu lực gây chết của dịch chiết chủng nấm ký sinh côn trùng ở mật độ bào tử khác nhau đối với rệp sáp gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng đã trở thành một giải pháp tiềm năng trong việc phòng trừ rệp sáp, một trong những loài gây hại nghiêm trọng cho cây trồng. Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng các dòng nấm như Beauveria sp. và Isaria fumosorosea Bb-V3 trong việc kiểm soát rệp sáp Planococcus citri. Việc sử dụng nấm ký sinh không chỉ giúp giảm thiểu tác động của thuốc hóa học mà còn bảo vệ môi trường.

1.1. Khái niệm về nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng là nhóm nấm gây bệnh cho côn trùng, có khả năng tiêu diệt chúng. Chúng được phân loại thành nhiều nhóm khác nhau dựa trên cách thức ký sinh và tác động đến vật chủ.

1.2. Tình hình rệp sáp gây hại hiện nay

Rệp sáp Planococcus citri đang gia tăng số lượng và gây hại nghiêm trọng cho nhiều loại cây trồng, đặc biệt là cây ăn trái. Việc kiểm soát chúng là một thách thức lớn cho nông dân.

II. Vấn đề và thách thức trong phòng trừ rệp sáp

Sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ rệp sáp mang lại hiệu quả nhanh chóng nhưng cũng gây ra nhiều vấn đề như kháng thuốc và ô nhiễm môi trường. Nông dân cần tìm kiếm các biện pháp thay thế bền vững hơn.

2.1. Tác động của thuốc hóa học đến môi trường

Việc lạm dụng thuốc hóa học không chỉ gây ô nhiễm đất và nước mà còn ảnh hưởng đến các sinh vật có ích trong hệ sinh thái.

2.2. Kháng thuốc và sự phát triển của rệp sáp

Rệp sáp có khả năng phát triển kháng thuốc, làm giảm hiệu quả của các biện pháp phòng trừ truyền thống, dẫn đến sự cần thiết phải tìm kiếm các giải pháp sinh học.

III. Phương pháp nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng

Nghiên cứu này áp dụng các phương pháp sinh học phân tử và khảo sát điều kiện nuôi cấy để đánh giá hiệu quả của nấm ký sinh trong việc kiểm soát rệp sáp. Các yếu tố như pH, nguồn dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy được xem xét kỹ lưỡng.

3.1. Phương pháp nuôi cấy nấm ký sinh

Nấm ký sinh được nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau để xác định sự phát triển và khả năng gây hại của chúng đối với rệp sáp.

3.2. Đánh giá hiệu quả của nấm ký sinh

Các thí nghiệm được thực hiện để đánh giá hiệu quả gây chết của dịch chiết từ nấm ký sinh đối với rệp sáp ở các mật độ bào tử khác nhau.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm ký sinh côn trùng có khả năng kiểm soát rệp sáp hiệu quả. Các dòng nấm như Beauveria sp. và Isaria fumosorosea Bb-V3 đã chứng minh được tiềm năng trong việc thay thế thuốc hóa học.

4.1. Hiệu quả của nấm Beauveria sp.

Nấm Beauveria sp. cho thấy khả năng gây chết cao đối với rệp sáp, với tỷ lệ chết lên đến 80% trong điều kiện thí nghiệm.

4.2. Ứng dụng nấm Isaria fumosorosea Bb V3

Nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 cũng cho kết quả khả quan, mở ra hướng đi mới trong việc kiểm soát rệp sáp một cách bền vững.

V. Kết luận và triển vọng tương lai

Nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ rệp sáp đã mở ra nhiều cơ hội mới cho nông nghiệp bền vững. Việc áp dụng các biện pháp sinh học sẽ giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và nâng cao hiệu quả sản xuất.

5.1. Tương lai của nấm ký sinh trong nông nghiệp

Nấm ký sinh côn trùng có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm sinh học, giúp nông dân kiểm soát sâu hại một cách hiệu quả và bền vững.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các dòng nấm khác và điều kiện môi trường để tối ưu hóa hiệu quả phòng trừ rệp sáp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn

Sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam, đặc biệt là nhóm cây ăn trái và cây công nghiệp, thường xuyên chịu áp lực lớn từ các đối tượng sâu hại chân đốt. Theo thống kê đến năm 2013, trên cây ăn quả có múi đã ghi nhận 265 loài sâu hại; trên cây nhãn và cây xoài lần lượt ghi nhận 129 và 123 loài (Phạm Văn Lầm, 2013). Trong đó, rệp sáp (Planococcus citri) là một trong những dịch hại nghiêm trọng, phân bố rộng trên nhóm cây có múi (Citrus) và các vùng sản xuất cà phê trọng điểm ở Tây Nguyên như Lâm Đồng, làm suy giảm đáng kể năng suất và chất lượng nông sản (Phạm Thị Vượng, 2008).

Thực tế canh tác hiện nay vẫn phụ thuộc chủ yếu vào biện pháp sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học nhờ ưu điểm tác động nhanh và dễ sử dụng. Tuy nhiên, việc lạm dụng hóa chất đã dẫn đến nhiều hệ lụy tiêu cực: gia tăng tính kháng thuốc ở côn trùng, tiêu diệt thiên địch tự nhiên, phá vỡ cân bằng sinh thái, gây ô nhiễm đất, nước, không khí và để lại dư lượng độc hại.

Trước thực trạng đó, nghiên cứu phát triển các chế phẩm sinh học từ nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi - EPF) mở ra hướng kiểm soát sinh học bền vững. Các loài thuộc chi Beauveria và chi Isaria (I. fumosorosea) đã được chứng minh có phổ ký sinh rộng, khả năng lây nhiễm tự nhiên qua lớp biểu bì (cuticle), không gây tính kháng thuốc và có thể duy trì mật độ trong quần thể sâu hại ngoài đồng ruộng. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn, đề tài "Nghiên cứu, thử nghiệm dòng nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp. và Isaria fumosorosea Bb-V3 ứng dụng trong phòng trừ sinh học rệp sáp Planococcus citri" được thực hiện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Khóa luận xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Định danh dòng nấm ký sinh côn trùng thu thập được dựa trên đặc điểm hình thái và kỹ thuật sinh học phân tử.
2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, pH, thời gian) lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm Beauveria sp.
3. Đánh giá khả năng kiểm soát côn trùng gây hại của dịch chiết từ chủng nấm ký sinh Beauveria sp. và Isaria fumosorosea Bb-V3 đối với rệp sáp Planococcus citri trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Các nhiệm vụ/nội dung nghiên cứu chi tiết bao gồm:

1. Phân lập, định danh hình thái và sinh học phân tử chủng nấm Beauveria sp.
2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng (các loại môi trường thạch khác nhau) đến sự phát triển của nấm.
3. Khảo sát ảnh hưởng của các mức pH khác nhau lên sự phát triển của nấm.
4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến đường kính khuẩn lạc và mật độ sinh bào tử.
5. Đánh giá hiệu lực gây chết của dịch bào tử nấm Beauveria sp. ở các nồng độ khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri.
6. Đánh giá hiệu lực gây chết của dịch bào tử nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 ở các nồng độ khác nhau đối với rệp sáp Planococcus citri.
7. So sánh hiệu lực gây chết giữa hai chủng nấm ký sinh côn trùng đối với rệp sáp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm ký sinh côn trùng Beauveria sp. phân lập từ thực địa, chủng nấm Isaria fumosorosea Bb-V3 và đối tượng khảo nghiệm là rệp sáp Planococcus citri.
• Phạm vi không gian:
  • Địa điểm thực nghiệm: Phòng thí nghiệm Động vật học và Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP.HCM (Cơ sở 3: số 68 Lê Thị Trung, P. Phú Lợi, TP. Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương).
  • Địa điểm thu mẫu nấm: Mẫu tằm bị nấm ký sinh tại vườn dâu huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng.
  • Địa điểm thu mẫu rệp sáp: Vườn chuối tại huyện Dầu Tiếng và vườn na tại TP. Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được triển khai thực hiện từ tháng 06/2022 đến tháng 08/2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

• Đặc điểm sinh học của rệp sáp (Planococcus citri): Thuộc bộ Hemiptera, họ Pseudococcidae. Ký chủ trên hơn 70 họ thực vật. Con đực sống khoảng 27 ngày qua 4 giai đoạn tuổi ấu trùng (instar); con cái sống trung bình 87,6 - 115 ngày qua 3 tuổi ấu trùng, đẻ từ 200 - 400 trứng (trung bình 300 trứng) với tỷ lệ nở trên 80%.
• Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng (EPF): Xâm nhập qua lớp biểu bì cutin thông qua hệ enzyme ngoại bào (protease, chitinase, lipase, cellulase), tiếp tục phát triển hệ sợi nấm trong xoang máu, phá hủy nội quan và tiết độc tố gây chết vật chủ. Sau khi côn trùng chết, nấm chuyển sang pha hoại sinh, mọc sợi đâm xuyên ra ngoài và sinh bào tử đính (conidia) để tiếp tục phát tán (Thomas & Read, 2007; Phạm Văn Lầm, 2000; Tạ Kim Chỉnh, 1994).
• Phân loại nấm chi Beauveria: Bào tử đơn bào trong suốt, dạng hình cầu hoặc hình trứng, cuống sinh bào tử mọc zíc zắc hoặc cong gập (Barnett & Barry, 1972; Võ Thị Thu Oanh, 2010).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Phương pháp thu thập và nhân nuôi rệp sáp: Rệp sáp thu ngoài tự nhiên được nhân sinh khối trong phòng thí nghiệm trên giá thể quả bí đỏ đặt trong hộp nhựa đục lỗ thông khí, duy trì vệ sinh để tránh nhiễm nấm mốc hoại sinh.
• Phương pháp định danh hình thái vi nấm: Quan sát đại thể (màu sắc, cấu trúc bề mặt, đường kính khuẩn lạc sau 3-15 ngày trên môi trường PDA) và vi thể (hình thái sợi nấm, cuống sinh bào tử, kích thước bào tử) bằng kỹ thuật nuôi cấy trên lam kính (microculture) với PDA bán lỏng, nhuộm Lactophenol Cotton Blue (LPCB) và soi dưới kính hiển vi quang học Olympus ở độ phóng đại x40 và x1000.
• Phương pháp định danh sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số bằng bộ kít GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit.
  • Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen vùng ITS với cặp mồi chuyên biệt ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). Thể tích phản ứng 25 µL (gồm 12 µL Master mix, 2 µL DNA mẫu, 1,2 µL mồi xuôi, 1,2 µL mồi ngược, 8,6 µL nước cất).
  • Phân tích sản phẩm PCR qua điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X ở hiệu điện thế 70V trong 40 phút.
  • Giải trình tự gen, đối chiếu dữ liệu tương đồng trên NCBI bằng công cụ BLAST/CLUSTAL và thiết lập cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA X (sử dụng thuật toán Neighbor-Joining - NJ với giá trị bootstrap 1000 lần lặp, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood).
• Phương pháp giữ giống nấm: Nhân nuôi và bảo quản thuần chủng trên cơ chất hạt lúa bổ sung dịch D-glucose (0,5 kg lúa ngâm 6-8 giờ, hấp cách thủy 3 giờ, phối trộn 8g D-glucose trong 100 mL nước cất, chia bình serum, hấp khử trùng 121°C/1 atm trong 20 phút) và lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối.
• Bố trí thí nghiệm khảo sát sinh học (bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên - CRD):
  • Khảo sát dinh dưỡng: 3 nghiệm thức môi trường thạch gồm PDA, SDAY, SDAY1 (lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa), nuôi tối ở nhiệt độ phòng, đo đường kính khuẩn lạc ở các mốc 6, 8, 10, 12 ngày sau khi cấy (NSKC).
  • Khảo sát pH: 6 mức pH gồm 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 trên môi trường tối ưu, đo đường kính khuẩn lạc sau 12 NSKC.
  • Khảo sát thời gian và mật độ bào tử: Theo dõi tốc độ phát triển đường kính khuẩn lạc (công thức tính đường kính trung bình $d = \frac{d_1 + d_2}{2}$) và xác định mật độ bào tử/mL bằng buồng đếm hồng cầu Thoma theo công thức: $$\text{Số tế bào/mL} = \frac{a \times 4000 \times 1000}{H}$$ (trong đó: $a$ là số tế bào trung bình trong một ô nhỏ, $H$ là độ pha loãng).
• Thí nghiệm đánh giá hiệu lực diệt rệp sáp: Bố trí 20 con rệp/nghiệm thức, lặp lại 3 lần. Các nghiệm thức gồm: đối chứng (phun nước cất), NT1 ($10^7$ bào tử/mL), NT2 ($10^8$ bào tử/mL), NT3 ($10^9$ bào tử/mL). Hiệu lực gây chết hiệu chỉnh (%) được tính theo công thức Abbott (1925): $$E (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$$ (trong đó: $C$ là số rệp sống ở lô đối chứng, $T$ là số rệp sống ở lô xử lý).
• Phương pháp xử lý thống kê: Số liệu thu thập được xử lý sơ bộ trên Microsoft Excel, phân tích phương sai một nhân tố (One-Way ANOVA) và kiểm định so sánh phân hạng trung bình LSD bằng phần mềm STATGRAPHICS Plus.

Thành phần môi trường dinh dưỡng sử dụng trong nghiên cứu

Thành phần	Đơn vị tính	Môi trường SDAY	Môi trường SDAY1	Môi trường PDA
Glucose	g	40	40	20
Peptone	g	10	10	-
Yeast extract	g	10	2	-
Khoai tây	g	-	-	200
Agar	g	20	20	20
Nước cất	mL	1000	1000	1000

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 hệ thống hóa toàn bộ các cơ sở lý luận và các công trình nghiên cứu liên quan trong và ngoài nước:

• Phân tích chi tiết đặc điểm sinh học, phân loại, tập tính gây hại, khả năng cộng sinh với kiến và vòng đời biến thái của rệp sáp Planococcus citri.
• Trình bày định nghĩa, phân loại nấm ký sinh côn trùng theo Pu & Li (1996), Samson et al. (1988), phân tích chi tiết chu trình sống và 3 giai đoạn xâm nhiễm cơ học kết hợp enzyme phá hủy lớp vỏ cutin (Protease, Chitinase, Lipase...).
• Tổng quan về chi nấm Beauveria, hình thái khuẩn lạc và bào tử trần hình zíc zắc đặc trưng, khả năng tồn tại nội sinh tự nhiên và nhân tạo trên cây trồng (ngô, khoai tây, cà chua, chuối...).
• Điểm luận các nghiên cứu sản xuất chế phẩm thương mại từ nấm côn trùng trên thế giới (Beauverin, Paecilomyces...) và tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm trắng Beauveria, nấm xanh Metarhizium tại Việt Nam từ thập niên 1970 đến nay (Tạ Kim Chỉnh, Phạm Thị Thùy, Trịnh Văn Hạnh, Phạm Văn Nhạ...).

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:

• Nguồn gốc vật liệu: mẫu nấm phân lập từ tằm dâu tại Bảo Lâm (Lâm Đồng), mẫu rệp sáp thu thập tại Dầu Tiếng và Thủ Dầu Một (Bình Dương).
• Danh mục hóa chất, thuốc nhuộm (Lactophenol Cotton Blue), thiết bị phân tích và môi trường nuôi cấy (PDA, SDAY, SDAY1).
• Thiết lập quy trình 7 bước giữ giống nấm trên giá thể hạt lúa bổ sung glucose.
• Thiết kế các bước thực nghiệm định danh hình thái, quy trình tách chiết DNA, chạy PCR mồi ITS1/ITS4, điện di agarose 1% và dựng cây phả hệ bằng MEGA X.
• Mô tả bố trí các thí nghiệm sinh học khảo sát dinh dưỡng, pH, thời gian nuôi cấy và các công thức toán học đo đếm mật độ bào tử (buồng đếm Thoma), hiệu lực trừ rệp (công thức Abbott).

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Đặc điểm hình thái chủng nấm phân lập: Khuẩn lạc trên môi trường PDA có dạng phấn trắng, mặt dưới màu kem đến vàng nhạt. Sợi nấm phát triển dày đặc; tế bào sinh bào tử đính mọc thành đám dạng zíc zắc hoặc cong gập từ sợi nấm. Bào tử đính là đơn bào trong suốt, không vách ngăn, dạng hình cầu hoặc hình trứng, kích thước đo được dao động từ 1,40 - 3,80 × 1,44 - 3,80 µm (mẫu đo hiển vi đạt 2,24 - 2,28 × 2,23 - 2,24 µm), tỷ lệ chiều dài/chiều rộng nhỏ hơn 2 µm, hoàn toàn phù hợp với các mô tả phân loại loài Beauveria bassiana của Barnett & Barry (1972) và Võ Thị Thu Oanh (2010).
• Kết quả phân tích sinh học phân tử: Phản ứng PCR với cặp mồi ITS1-ITS4 cho sản phẩm khuếch đại hiển thị một băng đơn sắc nét trên gel agarose 1% với kích thước phân tử khoảng 600 bp. Cây phát sinh loài xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining (thuật toán NJ, giá trị bootstrap 1000 lần lặp) trên phần mềm MEGA X khi so sánh với 9 trình tự tham chiếu trên GenBank (NCBI) xác định chủng nấm phân lập (ký hiệu mẫu X/Bb-T4) có mối quan hệ di truyền gần gũi và tương đồng với loài Beauveria bassiana, phân tách rõ ràng với các chi Paecilomyces, Rhizomucor, Geotrichum, Neurospora, Penicillium và nhóm ngoại (Bacillus clausii).
• Đặc điểm sinh học và hiệu lực sinh học: Đánh giá sự phát triển đường kính khuẩn lạc qua các mốc thời gian 6, 8, 10, 12 ngày; theo dõi đáp ứng ở các dải pH (đặc biệt tại pH 6,0 - 6,5) và đo lường mật độ bào tử; xác định hiệu lực gây chết của dịch bào tử nấm Beauveria sp. và Isaria fumosorosea Bb-V3 ở 3 mức nồng độ ($10^7, 10^8, 10^9$ bào tử/mL) đối với rệp sáp Planococcus citri.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

1. Phân lập và định danh thành công chủng nấm ký sinh: Từ nguồn mẫu sâu tằm nhiễm bệnh tại Lâm Đồng, tác giả đã làm thuần và định danh chính xác chủng nấm trắng thuộc loài Beauveria bassiana dựa trên sự tương thích giữa đặc điểm hình thái vi học (cuống sinh bào tử zíc zắc, bào tử đơn bào kích thước 1,40 - 3,80 × 1,44 - 3,80 µm) và phân tích sinh học phân tử đoạn gen ITS (kích thước sản phẩm PCR khoảng 600 bp, cây phát sinh NJ bootstrap 1000).
2. Xây dựng quy trình nhân giữ giống hiệu quả: Thiết lập thành công phương pháp giữ giống thuần chủng trên giá thể lúa phối trộn dịch D-glucose trong điều kiện nhiệt độ phòng.
3. Xác định các thông số sinh học tối ưu: Thu thập đầy đủ số liệu thực nghiệm về động thái phát triển đường kính khuẩn lạc, khả năng thích ứng pH (5,0 - 7,5) và quy luật tích lũy mật độ bào tử theo thời gian nuôi cấy của chủng nấm.
4. Đánh giá hiệu lực trừ rệp sáp Planococcus citri: Xác định được hiệu lực diệt rệp của hai dòng nấm Beauveria sp. và Isaria fumosorosea Bb-V3 ở các nồng độ dịch bào tử $10^7, 10^8, 10^9$ bào tử/mL qua các mốc thời gian sau khi phun, chứng minh tiềm năng diệt rệp sáp trong phòng thí nghiệm thông qua công thức tính toán Abbott.

Đề xuất và giải pháp của tác giả

• Ứng dụng dòng nấm ký sinh Beauveria sp. bản địa và Isaria fumosorosea Bb-V3 như một giải pháp thay thế an toàn cho thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong quản lý rệp sáp hại cây ăn trái và cây công nghiệp.
• Tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi cấy bán công nghiệp để nâng cao năng suất sinh bào tử đính phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học.

Đóng góp của khóa luận

• Bổ sung một chủng nấm ký sinh côn trùng bản địa (Beauveria bassiana) có nguồn gốc từ Lâm Đồng vào bộ sưu tập giống vi sinh vật phục vụ nghiên cứu phòng trừ sinh học.
• Cung cấp dẫn liệu khoa học hoàn chỉnh từ định danh hình thái, sinh học phân tử đến thử nghiệm hoạt lực đối kháng sinh học trên đối tượng rệp sáp Planococcus citri.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Toàn bộ các thử nghiệm đánh giá hiệu lực gây chết của nấm ký sinh mới chỉ được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm trên giá thể nhân tạo (bí đỏ/chuối), chưa đánh giá được đầy đủ tác động của các yếu tố ngoại cảnh thực tế (ánh sáng mặt trời, tia UV, biến động nhiệt độ và ẩm độ đồng ruộng).
• Thời gian nghiên cứu ngắn (khoảng 3 tháng, từ tháng 06/2022 đến tháng 08/2022), chưa mở rộng khảo nghiệm trên các giai đoạn phát triển khác nhau của cây trồng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng thử nghiệm hiệu lực phòng trừ sinh học của chế phẩm nấm Beauveria sp. và Isaria fumosorosea Bb-V3 đối với rệp sáp Planococcus citri ở quy mô nhà lưới và ngoài vườn cây ăn quả/vườn cà phê thực tế.
• Nghiên cứu công nghệ lên men lỏng kết hợp lên men xốp quy mô lớn và thử nghiệm các chất phụ gia, chất bám dính nhằm kéo dài thời gian bảo quản và nâng cao độ bền của bào tử nấm ngoài tự nhiên.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo: Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn giá trị cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Nông nghiệp, Bảo vệ Thực vật và Vi sinh vật học ứng dụng.
• Nội dung có giá trị ứng dụng cao:
  • Quy trình chi tiết về tách chiết DNA nấm sợi và kỹ thuật PCR định danh phân tử nấm ký sinh bằng cặp mồi ITS1/ITS4.
  • Phương pháp nuôi cấy vi thể trên lam kính để quan sát cơ quan sinh sản của nấm sợi.
  • Kỹ thuật nhân nuôi rệp sáp nhân tạo và phương pháp bố trí thí nghiệm thử nghiệm hoạt lực sinh học (CRD), phương pháp đếm bào tử bằng buồng đếm Thoma và công thức xử lý số liệu Abbott.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng nấm Beauveria sp. trong nghiên cứu được phân lập từ nguồn mẫu nào và ở đâu?

Chủng nấm Beauveria sp. được tác giả phân lập từ mẫu sâu tằm bị nấm ký sinh tấn công ngoài tự nhiên tại một vườn dâu ở huyện Bảo Lâm, tỉnh Lâm Đồng.

2. Kỹ thuật sinh học phân tử nào đã được sử dụng để định danh chủng nấm và kết quả ra sao?

Tác giả sử dụng kỹ thuật tách chiết DNA bằng bộ kít GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS bằng cặp mồi chuyên biệt ITS1 và ITS4 (cho sản phẩm điện di có kích thước khoảng 600 bp), sau đó giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài trên phần mềm MEGA X bằng thuật toán Neighbor-Joining (bootstrap 1000 lần). Kết quả khẳng định mẫu nấm phân lập tương đồng với loài Beauveria bassiana.

3. Quy trình giữ giống chủng nấm Beauveria sp. trong phòng thí nghiệm được thực hiện trên cơ chất gì?

Giống nấm thuần được giữ trên cơ chất hạt lúa bổ sung glucose: 0,5 kg lúa ngâm nước 6-8 giờ, hấp cách thủy 3 giờ, phối trộn cùng dung dịch 8g D-glucose trong 100 mL nước cất, chia vào các bình serum nhỏ, hấp vô trùng ở 121°C (1 atm) trong 20 phút, cấy nấm và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng trong bóng tối.

4. Rệp sáp Planococcus citri được nhân nuôi trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp nào?

Nguồn rệp sáp thu thập từ các vườn chuối ở Dầu Tiếng và vườn na ở Thủ Dầu Một (Bình Dương) được nhân nuôi bằng cách thả cho rệp ký sinh trên vỏ ngoài của trái bí đỏ sạch đặt trong các hộp nhựa có đục lỗ thông khí, định kỳ theo dõi và vệ sinh để tránh nhiễm mốc gây hại.

5. Khóa luận đánh giá hiệu lực gây chết rệp sáp bằng công thức toán học nào?

Hiệu lực gây chết hiệu chỉnh của dịch chiết nấm đối với rệp sáp được tính theo công thức Abbott (1925): $$E (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$$ (trong đó $E$ là tỷ lệ rệp chết hiệu chỉnh, $C$ là số cá thể rệp sống ở lô đối chứng phun nước, $T$ là số cá thể rệp sống ở lô thí nghiệm xử lý nồng độ bào tử).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thiện Minh Tâm đã phân lập, định danh thành công chủng nấm ký sinh côn trùng bản địa Beauveria bassiana bằng hình thái và chỉ thị phân tử ITS, đồng thời thiết lập quy trình nuôi giữ giống ổn định trên cơ chất hạt lúa. Nghiên cứu đã xác định các đặc tính sinh học quan trọng về môi trường dinh dưỡng, pH, thời gian sinh bào tử và chứng minh hoạt lực gây chết rệp sáp Planococcus citri của dịch bào tử Beauveria sp. cùng Isaria fumosorosea Bb-V3 ở quy mô phòng thí nghiệm. Đề tài cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc, đóng góp thêm nguồn vi sinh vật hữu ích hướng tới phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ sâu bệnh bền vững trong nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây trồng nói chung và cây ăn trái nói riêng ở Việt Nam bị rất nhiều loài sâu hại tấn công. Chẳng hạn, đến năm 2013, trên các loại cây ăn quả có múi ở nước ta đã ghi nhận được 265 loài chân đốt là sâu hại; trên cây nhãn, cây xoài tương ứng có 129 và 123 loài sâu hại,…(Phạm Văn Lầm, 2013). Trong đó, một trong những loại gây hại cây ăn quả khá nghiêm trọng đó là rệp sáp (Planococcus citri). Sự gây hại do rệp sáp gây ra trên nhóm cây có múi (Citrus) đã được ghi nhận tại nhiều nơi trên thế giới (Smith et al., 1970) và tại Việt Nam (Nguyễn Thị Chắc và ctv.

Trong những năm gần đây, rệp sáp phát triển mạnh, gây hại nghiêm trọng nhiều vùng sản xuất cà phê ở Tây Nguyên trong đó có tỉnh Lâm Đồng, làm giảng đáng kể năng suất, chất lượng cà phê ( Phạm Thị vượng, 2008). Để phòng trừ rệp sáp và các loại sâu hại khác trên rau và cây ăn quả, người nông dân chủ yếu dựa vào biện pháp sử dụng thuốc hóa học. Thực tế cho thấy các biện pháp phun thuốc bảo vệ thực vật đem lại hiệu quả phòng trừ cao, giải quyết nhanh những trận dịch lớn, sử dụng đơn giản, thuận tiện.Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc hóa học vừa gây lãng phí trong sản xuất, làm tăng khả năng kháng thuốc và hơn cả là việc quá lạm dụng sẽ tác động rất xấu đến môi trường xung quanh, gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí cũng như ảnh hưởng đến các sinh vật xung quanh, kẻ thù tự nhiên của sâu hại bị thuốc hóa học tiêu diệt, phá vỡ cân bằng sinh học trong tự nhiên. Trong những năm gần đây, nấm kí sinh côn trùng đã được phát triển ở nhiều quốc gia xem như tác nhân phòng trừ sinh học côn trùng với hơn 100 sản phẩm thuốc trừ sâu vi sinh đã được thương mại hóa vào năm 2006 (Jaronski, 2010).

Đi tiên phong trong phòng trừ sinh học của nấm kí sinh côn trùng chủ yếu có 2 loài B. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy các loài nấm chi Isaria cũng có nhiều triển vọng để phòng trừ sâu hại nông nghiệp. Hiện nay, một số loài nấm chi Isaria được sử dụng trong phòng trừ sinh học cây trồng như I. Các loài nấm này được nghiên cứu và ứng dụng vào phòng trừ một số đối tượng sâu hại thuộc bộ Lepidoptera, SVTH: Nguyễn Thiện Minh Tâm 14 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS.

Nguyễn Ngọc Bảo Châu Hemiptera, Diptera, Cleoptera, Hymenoptera,…ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Brazil, Thái Lan và cho kết quả tốt. Nấm kí sinh côn trùng chưa tạo ra tính kháng thuốc và có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại sâu khác nhau, ngoài ra nấm kí sinh côn trùng không chỉ tiêu diệt trực tiếp sâu hại vào thời kì phá hoại mà còn tích lũy trên đồng ruộng truyền cho thế hệ tiếp theo (Lê Anh Tuấn, 2013). Từ đó cho thấy triển vọng sử dụng nấm kí sinh côn trùng có hoạt lực mạnh như là một chiến lược kiểm soát sâu bệnh hại thay thế. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU, THỬ NGHIỆM DÒNG NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG Beauveria sp.

VÀ Isaria fumosorosea Bb-V3 ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC RỆP SÁP Planococcus citri”. ❖ Mục tiêu: − Định danh các dòng nấm kí sinh côn trùng vừa tìm được dựa trên hình thái và bằng kĩ thuật sinh học phân tử. − Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp. − Nghiên cứu khả năng kiểm soát côn trùng gây hại của dịch chiết từ chủng nấm kí sinh côn trùng Beauveria sp.