Đặt vấn đề Tình hình chăn nuôi gia cầm, đặc biệt là chăn nuôi gà ở Việt Nam phát triển nhanh chóng trong những năm qua. Năm 2005 lƣợng tiêu thụ là 322 ngàn tấn đến năm 2015 tiêu thụ 862 ngàn tấn, sau 10 năm lƣợng tiêu thụ tăng đến 267,7%. Năm 2016, đàn gia cầm cả nƣớc đạt 356,72 triệu con và cuối năm 2017 có 385,46 triệu con. Theo nhƣ kế hoạch phát triển của cục chăn nuôi, đến năm 2020, số lƣợng đàn gia cầm ƣớc tính khoảng 397,9 triệu con.
Do đó sau quá trình giết mổ và sản xuất thịt gà, nguồn phụ phẩm nhƣ: xƣơng, sụn, đặc biệt là sụn ức gà rất lớn và bán ra thị trƣờng với giá rẻ. Mặt khác thành phần sụn ức gà lại chứa nhiều hợp chất quý nhƣ glycosaminoglycans, trong đó có hợp chất chondroitin sulfate có chức năng tái tạo các mô sụn và xƣơng, nuôi dƣỡng tế bào giác mạc mắt … Qua đó cho thấy: sụn ức gà là nguyên liệu đầy tiềm năng để trích ly và thu nhận Chondroitin Sulfate. Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về tách chiết, tinh sạch chondroitin sulfate từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau trong đó có sụn gà. Sản phẩm bột CS đƣợc ứng dụng rộng rãi trong ngành dƣợc phẩm, thực phẩm chức năng, giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh về xƣơng khớp.
Tuy nhiên, ở nƣớc ta mới chỉ có một nghiên cứu duy nhất thu nhận CS từ sụn cá đuối, cá nhám. Trƣớc thực trạng này, tiến hành nghiên cứu đƣa ra quy trình thu nhận và tinh sạch CS là cần thiết. Do đó, đề tài luận văn “Trích ly – Tinh sạch Chondroitin Sulfate từ sụn ức gà bằng phƣơng pháp hóa học và hóa sinh” đã đƣợc nghiên cứu nhằm góp phần giải quyết vấn đề đầu ra và giúp nâng cao giá trị gia tăng cho phụ phẩm của ngành chăn nuôi – giết mổ gia cầm nói chung và gà nói riêng. Không những mang lại doanh thu cho các công ty gia cầm, đặc biệt là giúp cho ngƣời nông dân có thêm nguồn thu nhập mà còn tạo ra một sản phẩm có lợi cho sức khỏe của ngƣời tiêu dùng với giá thành hợp lý, hỗ trợ thêm cho ngành y tế trong việc điều trị các bệnh về xƣơng khớp.
Bên cạnh đó cũng giải quyết đƣợc vấn đề ô nhiễm môi trƣờng từ nguồn phụ phẩm.2 Mục tiêu nghiên cứu - Tìm đƣợc điều kiện xử lý màng thịt bám bên ngoài sụn tốt nhất bằng các phƣơng pháp: hóa học, hóa sinh và vật lý. - Khảo sát các quá trình thu nhận CS thô bằng phƣơng pháp vật lý và hóa sinh. Sau đó tiến hành tối ƣu hóa điều kện thu nhận CS thô tốt nhất. 1 - Khảo sát quá trình tinh sạch và thu nhận CS bằng phƣơng pháp lọc màng và hóa học.
Tối ƣu hóa các yếu tố của quá trình thu nhận CS tinh sạch. - Đánh giá chất lƣợng của sản phẩm CS.3 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu này đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm B10: thiết bị lọc màng, siêu âm,bể điều nhiệt … - Đối tƣợng nghiên cứu là sụn ức gà mua tại Công ty TNHH Phạm Tôn. - Enzyme Alcalase sử dụng cho nghiên cứu là sản phẩm của Công ty Brenntag.4 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu này tập trung vào các nội dung sau: - Tổng quan tài liệu về CS, chức năng sinh học và các phƣơng pháp thu nhận. - Tổng quan về nguyên liệu sụn ức gà và enzyme dùng trong thủy phân.
- Tổng quan về siêu âm, lọc màng, tinh sạch bằng phƣơng pháp hóa học. - Phân tích một số thành phần hóa học cơ bản của sụn ức gà. - Xác định hoạt độ enzyme Alcalase. - Khảo sát phƣơng pháp xử lý nguyên liệu sụn: NaOH; enzyme Alcalase và Chần.
- Thiết lập quy trình công nghệ trích ly và thu nhận CS thô từ sụn ức gà bằng phƣơng pháp siêu âm và thủy phân. Tối ƣu hóa các yếu tố trong phƣơng pháp thu nhận CS thô tốt nhất. - Thiết lập quy trình tinh sạch CS bằng phƣơng pháp lọc màng và phƣơng pháp hóa học. Tối ƣu hóa phƣơng pháp thu nhận CS tinh tốt nhất.
- Phân tích và đánh giá CS thu đƣợc.5 Ứng dụng - Từ kết quả nghiên cứu thu đƣợc, đƣa ra quy trình trích ly và thu nhận Chondroitin Sulfate từ sụn ức gà. - Xây dựng đƣợc mô hình tối ƣu hóa, các thông số kỹ thuật của quy trình sản xuất. 2 - Bƣớc tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo để đƣa vào sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh về xƣơng khớp tại Việt Nam mà không cần phải nhập nguyên liệu từ nƣớc ngoài. 3 2 Chương 2: Tổng quan 2.1 Tổng quan về Chondroitin sulfate 2.1 Đặc điểm và cấu trúc của CS Chondroitin sulfate (CS) là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide, gồm các monome là các đơn vị disaccharide chứa nhóm: glucuronic acid (GlcA) và N- acetyl-galactosamine (GalNAc) liên kết với nhau bởi liên kết glucoside (GlcA β (1→3) GalNAc) (hình 2.1) tạo thành Chondroitin sulfate glycosaminoglycans (CS-GAGs) không phân nhánh.
Một chuỗi CS-GAGs có thể chứa từ 20 – 40 đơn vị disaccharide và các disaccharide liên kết với nhau bởi liên kết 1 →4 glycoside[1], [2] Mỗi nhóm OH của CS-GAGs đƣợc thay thế bởi nhóm sulphate (SO42-) tại vị trí carbon C4 hoặc C6 của GalNAc và vị trí carbon C2 hoặc C3 của GlcA sẽ tạo ra các đồng phân của CS (hình 2.1: Cấu trúc hóa học của CS Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42-) gốc đƣờng với các nhóm carboxyl (COO-) của gốc đƣờng acid làm cho phân tử chondroitin có điện tích âm rất cao, dễ dàng liên kết cộng hóa trị với các protein trong proteoglycan (PG). Trong các nghiên cứu của Kato (1994) và Bernfield (1999) đã cho thấy CS thƣờng gắn với các protein bằng liên kết o- glycosid tạo thành một PG, là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide. [24] Chuỗi CS đƣợc gắn với nhóm – OH của gốc serine ở một số protein. Sự gắn kết chuỗi GAGs bắt đầu với bốn gốc đƣờng đơn theo phƣơng thức cố định bởi liên kết tetra – saccharide: xylose – galactose – galactose – glucuronic acid (Xyl – Gal – Gal – GlcA) (hình 2.2) trong đó xylose đƣợc gắn với protein trong mạng lƣới nội bào, còn các phân tử đƣờng khác đƣợc gắn trong hệ Golgi.2: Cấu tạo hóa học của CS CS ƣa nƣớc vì thế hàm lƣợng nƣớc trong mô sụn cao.
Các điều kiện thủy phân cũng có thể làm giảm trọng lƣợng phân tử trung bình của sản phẩm thu đƣợc. Mỗi phân tử đƣờng có thể bị sulfate hóa 1, 2 lần hoặc không bị sulfate hóa. Đa phần nhóm OH ở vị trí cacbon 4 và 6 của GalNac đƣợc sulfate hóa. Quá trình này nhờ các enzyme sulfotransferase đặc hiệu.
Việc sulfate hóa ở các vị trí carbon khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của CS.2 Phân loại CS Chondroitin có 3 loại chính A, B và C, chúng đƣợc đặc trƣng bởi số lƣợng và vị trí gắn sulfate trong nhóm dissacharide của chuỗi polysaccharide [5],[9], [32]. - Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4) có nhiều ở mô sụn, có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit. - Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế acid glucuronic, thƣờng có nhiều ở da, gan, vân tim, thành mạch. Vị trí bị sulfate hóa ở C-4 của GlcNac và C-5 của glucuronic acid bị epime hóa thành iduronic acid.
- Chondroitin sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (Chondroitin-6-sulfate, CS6).3: Các đồng phân của CS Ngoài ra còn có Chondroitin sulfate D và E. Phân loại CS đƣợc tóm tắt trong bảng sau: Bảng 2.1: Bảng phân loại CS Tên Vị trí bị sulphate hóa Tên phân loại Cacbon 4 của đƣờng N- Chondroitin-4-sulphate Chondroitin sulfate A acetyl-D-galactosamine (CS4) (GalNAc) Chondroitin sulfate B Cacbon 4 của GalNAc-L- Chondroitin-4-sulphate (Dermetan sulphate) iduronic acid (CS4) Chondroitin-6-sulphate Chondroitin sulfate C Cacbon 6 của GalNAc (CS6) Cacbon 2 của glucuronic Chondroitin-2,6-sulfate Chondroitin sulfate D acid and 6 của GalNAc (C2,S6) Cacbon 4 và 6 của Chondroitin-4,6-sulfate Chondroitin sulfate E GalNAc (C4,S6) Số lƣợng đồng phân của CS đƣợc tìm thấy rất nhiều. Điều này cho thấy rằng, cấu trúc chuỗi CS không mang tính ngẫu nhiên và những chuỗi CS có thể chứa những thông tin sinh học, cấu trúc phân tử đặc biệt ảnh hƣởng đến chu trình sinh học của cơ thể theo Robert M. Lauder và các cộng sự (2009).3 Nguồn gốc CS phân bố khắp cơ thể ngƣời, động vật có vú, động vật không xƣơng sống và trong một số loài vi khuẩn.
Tại các mô khớp, CS chiếm khoảng 20%, một số lƣợng tuy không lớn nhƣng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự bền chắc và đàn hồi của mô sụn. Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tại giác mạc CS chiếm khoảng 20%.[10] 6 Nguồn gốc của CS trên thị trƣờng hiện tại đƣợc chiết xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu nhƣ: phụ phẩm của heo (lỗ tai và mõm heo), sụn cá mập (xƣơng sọ, xƣơng sống và vây), ống khí quản bò, sụn bò. và có thể dùng CS từ sụn khí quản động vật (khí quản gà, vịt.) để thay thế cho sụn cá mập, giảm giá thành nhƣng vẫn đảm bảo chất lƣợng của sản phẩm. Trong các nghiên cứu khoa học đã đƣa ra hàm lƣợng CS của một số nguyên liệu.
Sụn từ xƣơng hàm cá sấu và sụn ức gà là những nguyên liệu chứa nhiều CS, lần lƣợt là 14,84% và 14,08% tính theo trọng lƣợng sụn khô [10]. Theo một nghiên cứu khác của Luo và cộng sự (2002) thì hàm lƣợng CS từ sụn ức gà chiếm 16,8% [23]. Hàm lƣợng CS từ các sụn khác nhƣ: sụn xƣơng ức cá sấu 11,55%, sụn khí quản cá sấu 9,51%, sụn vây cá mập 9,6%, sụn sƣờn cá sấu 5,56%, và sụn cá đuối 5,27% (tính theo chất khô) [10]. Hàm lƣợng CS trong khí quản vịt đƣợc nghiên cứu là khoảng từ 9,7% đến 10,6% theo hàm lƣợng chất khô [46] Hình 2.4: Một số nguồn nguyên liệu thu nhận CS CS trong mô động vật liên kết chặt chẽ với protein trong dạng phức proteoglycan cho nên việc đầu tiên là phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc làm yếu các liên kết giữa CS – Protein và phân hủy protein để giải phóng CS.
[24] 7 Tùy vào nguồn gốc xuất xứ mà CS có cấu trúc hóa học khác nhau, mỗi cấu trúc hóa học của mạch polyme khác nhau có chức năng sinh học khác nhau. Một trong những yếu tố quyết định đến giá trị của CS đó là chất lƣợng và sự công nhận của các cơ quan có thẩm quyền. Một số sản phẩm có thể chứa hàm lƣợng CS ít hơn so với quy định đã đăng ký nhƣng không nhỏ hơn 10%, do đó cần phải tiến hành kiểm tra chất lƣợng và nguồn gốc của CS trong các sản phẩm thƣơng mại.