Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của giống điều tại Bình Dương và Đồng Nai bằng RAPD-PCR

Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của giống điều tại Bình Dương và Đồng Nai là một lĩnh vực quan trọng trong nông… 75 trang · Trường Đại Học Mở - Bình Dương.

• Tác giả: Lê Dung Ngọc Châu
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Minh Trí
• Trường học: Trường Đại Học Mở - Bình Dương
• Chuyên ngành: Môi Trường - Nông Nghiệp
• Đề tài: Nghiên Cứu Tính Đa Dạng Di Truyền Của Giống Điều Tại Bình Dương Và Đồng Nai Bằng Kỹ Thuật RAPD - PCR
• Loại tài liệu: Luận Văn Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2001 - 2005
• Địa điểm: Hoà Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.2. MỤC ĐÍCH
• 1.3. YÊU CẦU
• 1.4. GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY ĐIỀU
• 2.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC
• 2.3. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT ĐIỀU TRÊN THẾ GIỚI
• 2.4. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT ĐIỀU Ở VIỆT NAM
• 2.5. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
• 2.6. KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
• 2.7. KỸ THUẬT RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. NỘI DUNG 1: THU THẬP MỘT SỐ GIỐNG ĐIỀU TẠI BÌNH DƯƠNG, ĐỒNG NAI
• 3.1.1. Điều kiện điều tra
• 3.1.2. Phương tiện điều tra
• 3.1.3. Phương pháp điều tra
• 3.2. NỘI DUNG 2: TÁCH CHIẾT VÀ KIỂM TRA DNA
• 3.2.1. Điều kiện nghiên cứu
• 3.2.2. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
• 3.2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3. NỘI DUNG 3: CHẠY RAPD – PCR
• 3.3.1. Điều kiện nghiên cứu
• 3.3.2. Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu
• 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4. NỘI DUNG 4: PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. NỘI DUNG 1: THU THẬP MỘT SỐ GIỐNG ĐIỀU TẠI BÌNH DƯƠNG, ĐỒNG NAI
• 4.1.1. Kết quả thu thập mẫu lá Điều
• 4.1.2. Những vấn đề cần lưu ý khi thu thập mẫu
• 4.2. NỘI DUNG 2: TÁCH CHIẾT VÀ KIỂM TRA DNA
• 4.2.1. Kết quả tách chiết và kiểm tra DNA
• 4.2.1.1. Định tính DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose
• 4.2.1.2. Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ quang phổ
• 4.2.2. Những vấn đề cần lưu ý khi tách chiết và kiểm tra DNA
• 4.3. NỘI DUNG 3: CHẠY RAPD – PCR
• 4.3.1. Kết quả chạy RAPD – PCR cho các nghiệm thức
• 4.3.1.1. Nghiệm thức 1
• 4.3.1.2. Nghiệm thức 2
• 4.3.1.3. Nghiệm thức 3
• 4.3.2. Những vấn đề cần lưu ý khi chạy RAPD – PCR
• 4.4. NỘI DUNG 4: PHÂN TÍCH KẾT QUẢ RAPD – PCR
• 4.4.1. Những vấn đề cần lưu ý khi phân tích kết quả
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 5.1. Kết luận
• 5.2. Đề nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ CÂY ĐIỀU GHI NHẬN
• PHỤ LỤC 2: PHIẾU GHI CHÚ MẪU ĐIỀU
• PHỤ LỤC 3: MẪU PHIẾU ĐIỀU TRA NÔNG DÂN
• PHỤ LỤC 4: ĐẶC ĐIỂM CÁC MẪU ĐIỀU THU THẬP ĐƯỢC
• PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ ĐO OD VÀ LƯỢNG DNA CÁC MẪU LY
• PHỤ LỤC 6: MÃ HÓA SỐ LIỆU KẾT QUẢ RAPD – PCR

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Tính Đa Dạng Di Truyền Của Giống Điều

Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của giống điều tại Bình Dương và Đồng Nai là một lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp hiện đại. Việc bảo tồn và phát triển giống điều có giá trị kinh tế cao là cần thiết để nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm. Sử dụng kỹ thuật RAPD - PCR giúp xác định và phân tích các biến thể di truyền của giống điều, từ đó hỗ trợ cho công tác chọn giống và lai tạo.

1.1. Giới Thiệu Về Giống Điều Tại Bình Dương Và Đồng Nai

Giống điều (Anacardium occidentale L.) là cây trồng quan trọng tại Bình Dương và Đồng Nai. Nơi đây có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho sự phát triển của giống điều, góp phần vào nền kinh tế địa phương.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Tính Đa Dạng Di Truyền

Tính đa dạng di truyền giúp giống điều thích ứng với biến đổi khí hậu và dịch bệnh. Việc nghiên cứu tính đa dạng này là cần thiết để bảo tồn và phát triển giống điều bền vững.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Tính Đa Dạng Di Truyền

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền của giống điều tại Bình Dương và Đồng Nai vẫn gặp nhiều thách thức. Thiếu thông tin về di truyền và các phương pháp nghiên cứu hiện đại là một trong những vấn đề lớn.

2.1. Thiếu Thông Tin Về Di Truyền

Nhiều giống điều hiện nay chưa được nghiên cứu đầy đủ về di truyền, dẫn đến khó khăn trong việc xác định các đặc điểm di truyền quan trọng.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Ứng Dụng Kỹ Thuật Mới

Việc áp dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu di truyền còn hạn chế do thiếu trang thiết bị và kiến thức chuyên môn.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tính Đa Dạng Di Truyền Bằng Kỹ Thuật RAPD PCR

Kỹ thuật RAPD - PCR là một trong những phương pháp hiệu quả để phân tích tính đa dạng di truyền. Phương pháp này cho phép phát hiện các biến thể di truyền mà không cần thông tin trước về trình tự gen.

3.1. Nguyên Tắc Cơ Bản Của Kỹ Thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD sử dụng các primer ngẫu nhiên để khuếch đại các đoạn DNA, từ đó tạo ra các băng DNA đặc trưng cho từng giống điều.

3.2. Quy Trình Thực Hiện Kỹ Thuật PCR

Quy trình PCR bao gồm các bước như chuẩn bị mẫu DNA, thêm các thành phần cần thiết và thực hiện chu trình nhiệt để khuếch đại DNA.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Tính Đa Dạng Di Truyền

Kết quả nghiên cứu tính đa dạng di truyền của giống điều có thể ứng dụng trong việc chọn giống và lai tạo. Điều này không chỉ giúp nâng cao năng suất mà còn cải thiện chất lượng sản phẩm.

4.1. Kết Quả Phân Tích DNA

Kết quả phân tích DNA cho thấy sự đa dạng di truyền giữa các giống điều, từ đó giúp xác định các giống có tiềm năng cao.

4.2. Ứng Dụng Trong Chọn Giống

Thông qua việc phân tích tính đa dạng di truyền, các nhà nghiên cứu có thể chọn lọc những giống điều có đặc tính tốt để phát triển.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Tính Đa Dạng Di Truyền

Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của giống điều tại Bình Dương và Đồng Nai là một bước quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển giống cây này. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành nông nghiệp.

5.1. Tầm Nhìn Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng các kỹ thuật hiện đại để nâng cao hiệu quả trong việc bảo tồn và phát triển giống điều.

5.2. Khuyến Nghị Đối Với Các Nhà Nghiên Cứu

Các nhà nghiên cứu cần hợp tác chặt chẽ với nông dân và các tổ chức để triển khai các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây điều (Anacardium occidentale L.) đóng vai trò chiến lược trong cơ cấu cây công nghiệp xuất khẩu của Việt Nam. Từ diện tích 150.000 ha vào năm 1999 với năng suất thô dưới 0,5 tấn/ha, ngành điều đã phát triển vượt bậc lên quy mô hơn 400.000 ha với năng suất bình quân 1,1 tấn/ha, mang lại kim ngạch xuất khẩu hướng tới mốc 1 tỷ USD. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất của sản xuất điều trong nước là tính bất đồng đều về mặt di truyền, tỷ lệ giống thoái hóa còn cao và chất lượng nhân chưa ổn định. Theo định hướng của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn giai đoạn 2006–2010, toàn ngành đặt mục tiêu cải tạo và thay thế khoảng 20% diện tích vườn điều kém hiệu quả mỗi năm nhằm nâng cao năng lực cạnh tranh quốc tế.

Vấn đề cốt lõi đặt ra là sự thiếu hụt các dữ liệu phân loại di truyền ở mức độ phân tử, dẫn đến công tác chọn dòng và lai tạo giống chủ yếu dựa vào đánh giá hình thái vốn dễ bị biến động bởi điều kiện ngoại cảnh. Đề tài tập trung vào mục tiêu xây dựng quy trình chuẩn xác định tính đa dạng di truyền của cây điều bằng kỹ thuật RAPD-PCR, đồng thời đánh giá tương quan di truyền giữa các giống đang canh tác phổ biến. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên 36 mẫu lá thu thập tại hai vùng sinh thái trọng điểm là Bình Dương và Đồng Nai từ tháng 7/2005 đến tháng 12/2005. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc cung cấp cơ sở khoa học để bảo tồn nguồn gen quý, hỗ trợ chọn tạo các giống điều đạt năng suất mục tiêu từ 2,16 đến 2,72 tấn/ha với tỷ lệ nhân trên 30%.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng thuyết di truyền phân tử, khởi đầu từ mô hình cấu trúc không gian xoắn kép của phân tử DNA do Watson và Crick công bố năm 1953. Phân tử DNA đóng vai trò là vật chất lưu trữ và truyền đạt thông tin di truyền thông qua trật tự sắp xếp của bốn loại nucleotide adenine, thymine, guanine và cytosine. Khi các biến dị di truyền xảy ra, sự thay đổi trong cấu trúc nucleotide sẽ tạo nên tính đa hình di truyền giữa các cá thể và quần thể sinh vật.

Về mặt công nghệ sinh học, đề tài vận dụng nguyên lý phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction do Kary Mullis phát minh năm 1985 nhằm khuếch đại in vitro các đoạn trình tự DNA đặc hiệu qua các chu kỳ biến tính, bắt cặp và kéo dài. Trên cơ sở đó, kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) được ứng dụng như một hệ chỉ thị phân tử trội. Kỹ thuật này sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên ngắn khoảng 10 nucleotide để bắt cặp và khuếch đại các vùng genome bổ sung mà không đòi hỏi phải biết trước toàn bộ trình tự nucleotide của loài. Các khái niệm cốt lõi bao gồm tính đa hình DNA, nhiệt độ nóng chảy của primer, nhiệt độ bắt cặp tối ưu và hệ số biến dị di truyền được sử dụng xuyên suốt để phân tích mức độ đồng nhất hoặc phân ly giữa các dòng giống.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vật liệu nghiên cứu bao gồm 36 mẫu lá điều sinh trưởng khỏe mạnh được thu thập từ Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc tại Đồng Nai (6 mẫu) và Dự án Điều Bến Cát tại Bình Dương (30 mẫu). Phương pháp chọn mẫu phân tầng được áp dụng kết hợp điều tra thực địa nông học và phỏng vấn trực tiếp nông dân theo mẫu phiếu chuẩn hóa. Quá trình lấy mẫu thu thập đồng thời cả lá non, lá bánh tẻ và lá già, được xử lý bảo quản nghiêm ngặt ở nhiệt độ âm 20 độ C trước khi đưa vào phân tích.

Quy trình tách chiết DNA tổng số được tiến hành dựa trên phương pháp CTAB cải tiến theo Doyle và Doyle (1988) qua 12 bước xử lý hóa sinh, sử dụng dịch chiết EB kết hợp chất chống oxy hóa 2-mercaptoethanol và enzyme RNase nhằm loại bỏ hoàn toàn protein, polysaccharide và RNA tạp nhiễm. Dịch nổi sau ly tâm 14.000 vòng/phút được kết tủa bằng isopropanol lạnh và tinh sạch bằng ethanol. Việc định tính chất lượng DNA được thực hiện qua điện di trên gel agarose nồng độ 0,8% dưới hiệu điện thế 100V, cường độ dòng 250mA, nhuộm ethidium bromide và chụp bản gel bằng hệ thống GelDoc. Định lượng nồng độ và độ tinh sạch DNA được tiến hành bằng máy đo mật độ quang phổ kế ở bước sóng 260 nm và 280 nm.

Phản ứng RAPD-PCR được bố trí theo 3 nghiệm thức thực nghiệm nhằm khảo sát nồng độ tối ưu của DNA khuôn, enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm MgCl2 và primer ngẫu nhiên số 11 (trình tự 5’-GAGACGCACA-3’). Chu trình nhiệt máy PCR gồm 37 vòng khuếch đại với nhiệt độ bắt cặp 33 độ C. Dữ liệu quang học của các vạch DNA được giải mã thành ma trận nhị phân có vạch (1) và không vạch (0) thông qua phần mềm Quantity One, sau đó chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bản 2.0 để tính toán khoảng cách di truyền và thiết lập sơ đồ cây phát sinh. Lý do lựa chọn phương pháp phân tích này là tính linh hoạt cao, chi phí hợp lý và khả năng phát hiện đa hình tốt đối với cây trồng chưa giải mã toàn bộ genome.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm đã mang lại những phát hiện quan trọng về mặt di truyền học và nông học đối với tập đoàn giống điều khảo sát:

Thứ nhất, hiệu suất ly trích DNA tổng số bằng phương pháp CTAB cải tiến đạt mức rất cao với 35/36 mẫu đạt yêu cầu kỹ thuật, tương ứng tỷ lệ thành công 97,2%. Kết quả đo quang phổ cho thấy nồng độ DNA trung bình đạt khoảng 98 ng/µl. Về độ tinh sạch, có 20/35 mẫu (chiếm 57,2%) đạt chất lượng xuất sắc với tỷ số hấp thụ quang phổ OD260/OD280 dao động trong khoảng tối ưu từ 1,8 đến 2,2; và 15/35 mẫu (chiếm 42,8%) đạt chất lượng trung bình với tỷ số OD từ 1,5 đến 1,8.

Thứ hai, đặc tính nông sinh học của 36 mẫu thu thập được phân định rõ ràng theo 3 nhóm nguồn gốc: 10 mẫu thuộc nhóm giống xác nhận và khu vực hóa (chiếm 27,8%), 4 mẫu thuộc nhóm giống khảo nghiệm (chiếm 11,1%) và 22 mẫu thuộc nhóm vườn tập đoàn giống giữ nguồn (chiếm 61,1%). Các giống khu vực hóa và khảo nghiệm thể hiện năng lực sinh trưởng mạnh 100%, tỷ lệ đậu quả cao 100%, thời gian ra hoa tập trung, kích cỡ hạt trung bình đạt 136,5 đến 150,4 hạt/kg, tỷ lệ nhân đạt 28,4% đến 33,3%, và năng suất thương phẩm bình quân đạt 2,16 đến 2,72 tấn/ha.

Thứ ba, nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công điều kiện phản ứng RAPD-PCR ở nghiệm thức thứ 3 với thành phần gia tăng MgCl2 25 mM lên 3 µl, primer 11 nồng độ 10 pM lên 1 µl và dNTPs 10 mM lên 0,5 µl trong tổng thể tích 25 µl. Nghiệm thức này tạo ra số lượng vạch khuếch đại phong phú, độ sáng rõ nét và độ lặp lại vượt trội so với nghiệm thức 1 và 2.

Thứ tư, kết quả phân tích chỉ thị phân tử cho thấy sự phân hóa di truyền rõ rệt giữa các mẫu điều thu thập tại Hưng Lộc (Đồng Nai) so với các mẫu tại Bến Cát (Bình Dương). Ngược lại, 22 mẫu thuộc vườn tập đoàn giống tại Bến Cát thể hiện mức độ tương đồng di truyền rất cao khi phổ vạch DNA không có sự phân ly lớn.

Thảo luận kết quả

Sự sai khác di truyền rõ nét giữa các mẫu điều Đồng Nai và Bình Dương có thể giải thích từ đặc tính thụ phấn chéo bắt buộc của cây điều trong tự nhiên, nơi hoa đực chiếm đa số và hoa lưỡng tính chỉ chiếm khoảng 14%. Việc di chuyển phấn hoa nhờ côn trùng qua nhiều thế hệ tại các tiểu vùng khí hậu khác biệt đã định hình nên các biến dị di truyền đặc thù. Ngược lại, mức độ tương đồng di truyền cao trong vườn tập đoàn Bến Cát phản ánh thực trạng các cá thể này có thể bắt nguồn từ cùng một dòng bố mẹ hoặc trải qua quá trình tuyển chọn nhân tạo cục bộ dẫn đến nền tảng di truyền bị thu hẹp.

So sánh với các nghiên cứu sinh học phân tử trên cây công nghiệp dài ngày như cà phê và chè, việc điều chỉnh nồng độ ion Mg2+ trong khoảng từ 0,5 mM đến 2,5 mM đóng vai trò quyết định đến hoạt tính của enzyme Taq polymerase và độ ổn định của liên kết mồi. Kết quả từ đề tài hoàn toàn tương thích với các công bố khoa học quốc tế về việc kiểm soát hiện tượng mồi dimer và hạn chế các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu.

Dữ liệu di truyền của đề tài được mô hình hóa trực quan thông qua bảng ma trận khoảng cách tương đồng và biểu đồ cây di truyền (dendrogram) xuất từ phần mềm NTSYS 2.0. Biểu đồ này phân tách tập đoàn điều thành các nhánh phát sinh rõ rệt, cho phép các nhà khoa học nhanh chóng nhận diện các cặp lai có khoảng cách di truyền xa nhất nhằm khai thác tối đa ưu thế lai F1 trong các chương trình chọn giống tiếp theo.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát triển bền vững chuỗi giá trị ngành điều và hiện đại hóa công tác tạo giống, đề tài đề xuất 4 nhóm giải pháp trọng tâm:

1. Chuẩn hóa quy trình nhân giống vô tính: Tiến hành nhân giống bằng phương pháp ghép chồi đối với 10 dòng điều đã được khu vực hóa có tỷ lệ nhân trên 30% và năng suất ổn định trên 2,5 tấn/ha (như PN1, LG1, MH4/5), phấn đấu cung ứng đủ giống chuẩn cho 100% diện tích trồng mới trong vòng 12 tháng tới dưới sự điều phối của Trung tâm Khuyến nông Quốc gia.
2. Nâng cấp hệ thống chỉ thị phân tử: Đẩy mạnh ứng dụng kết hợp 15 đến 20 primer ngẫu nhiên mới hoặc tích hợp thêm chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeats) và ISSR nhằm nâng độ tin cậy của bản đồ di truyền lên trên 95% trong giai đoạn nghiên cứu 2006–2008 do các Viện nghiên cứu chuyên ngành chủ trì.
3. Triển khai tái canh và cải tạo vườn điều: Thực hiện kế hoạch thay thế 20% diện tích vườn điều già cỗi, năng suất dưới 1 tấn/ha mỗi năm theo đúng lộ trình của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, ưu tiên phân bổ ngân sách hỗ trợ cây giống chất lượng cao cho các nông hộ tại Bình Dương, Đồng Nai và Bình Phước.
4. Xây dựng ngân hàng dữ liệu gen điều số hóa: Thành lập hệ thống lưu trữ nguồn gen và mã hóa mẫu DNA đạt chuẩn quốc tế ở điều kiện âm 20 độ C cho toàn bộ 36 giống điều hiện có, hoàn thành việc lập hồ sơ kiểu gen điện tử trước năm 2010 do Sở Khoa học và Công nghệ phối hợp cùng các trường đại học thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho 4 nhóm đối tượng:

1. Nhà khoa học và cán bộ nghiên cứu công nghệ sinh học: Nắm bắt chi tiết quy trình 12 bước tách chiết DNA từ mô thực vật chứa nhiều hợp chất thứ sinh (polyphenol, tannin) bằng dung dịch đệm CTAB và kỹ thuật tối ưu hóa hóa chất cocktail cho phản ứng PCR với mồi 10-mer.
2. Chuyên gia chọn tạo và nhân giống cây trồng: Tiếp cận các chỉ số nông học chi tiết (năng suất 2,16–2,72 tấn/ha, tỷ lệ nhân 28,4–33,3%, cỡ hạt 136,5–150,4 hạt/kg) làm cơ sở thiết kế các tổ hợp lai hữu tính có độ ưu thế lai cao.
3. Giảng viên, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Nông nghiệp - Sinh học: Sử dụng tài liệu như một cẩm nang mẫu mực về phương pháp mã hóa nhị phân dữ liệu điện di gel, ứng dụng phần mềm Quantity One và NTSYS 2.0 trong xây dựng cây phát sinh phân loài học thuật.
4. Các ban quản lý nông trường và doanh nghiệp sản xuất nông nghiệp: Ứng dụng tiêu chuẩn phân loại giống và đánh giá độ thuần di truyền để đưa ra quyết định đầu tư vùng nguyên liệu tập trung, đảm bảo đồng đều năng suất và phẩm chất xuất khẩu.

Câu hỏi thường gặp

Ưu điểm chính của việc sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu cây điều là gì? Kỹ thuật RAPD-PCR không đòi hỏi phải biết trước trình tự bộ gen của cây điều, thao tác thực hiện tương đối nhanh chóng, tiết kiệm chi phí hóa chất so với giải trình tự gen trực tiếp nhưng vẫn tạo ra số lượng chỉ thị đa hình phong phú thông qua mồi ngẫu nhiên 10 nucleotide.

Tỷ lệ tách chiết DNA thành công và độ tinh sạch đạt được trong nghiên cứu là bao nhiêu? Quy trình CTAB cải tiến đạt tỷ lệ tách chiết thành công 97,2% trên tổng số 36 mẫu lá. Trong đó, 57,2% số mẫu đạt độ tinh sạch cao với tỷ số hấp thụ quang phổ OD260/OD280 từ 1,8 đến 2,2 và nồng độ DNA trung bình đạt khoảng 98 ng/µl.

Nghiệm thức PCR nào được xác định là tối ưu cho việc tạo vạch điện di rõ nét? Nghiệm thức 3 là tối ưu nhất khi tăng thể tích MgCl2 25 mM lên 3 µl, primer 11 nồng độ 10 pM lên 1 µl và dNTPs 10 mM lên 0,5 µl trong phản ứng 25 µl, vận hành qua 37 chu kỳ nhiệt với nhiệt độ bắt cặp mồi tại 33 độ C.

Tính đa dạng di truyền của tập đoàn giống điều tại Bến Cát (Bình Dương) được đánh giá như thế nào? Kết quả điện di cho thấy 22 mẫu thuộc vườn tập đoàn Bến Cát có phổ vạch DNA rất tương đồng, chứng tỏ mức độ đa dạng di truyền trong nội bộ tập đoàn này tương đối hẹp, đòi hỏi phải du nhập thêm các nguồn gen mới từ các địa phương khác.

Những chỉ tiêu nông học nổi bật nào đã được ghi nhận ở các giống điều khu vực hóa? Các giống điều khu vực hóa đạt 100% tỷ lệ sinh trưởng mạnh, tỷ lệ đậu quả cao, tỷ lệ quả đỏ chiếm 93%, năng suất hạt khô đạt bình quân 2,16 đến 2,72 tấn/ha và tỷ lệ nhân dao động từ 28,4% đến 33,3%.

Kết luận

• Đề tài đã xây dựng thành công quy trình chuẩn hóa kỹ thuật RAPD-PCR ứng dụng trong phân tích di truyền phân tử trên cây điều (Anacardium occidentale L.).
• Đánh giá toàn diện 36 mẫu giống tại Bình Dương và Đồng Nai, đạt tỷ lệ tách chiết DNA thành công 97,2% với nồng độ bình quân 98 ng/µl.
• Xác định nghiệm thức tối ưu hóa thành phần phản ứng PCR (nghiệm thức 3) kết hợp chu kỳ nhiệt 37 vòng giúp tối đa hóa độ phân giải vạch điện di.
• Làm rõ cấu trúc phân hóa di truyền giữa quần thể điều Đồng Nai và Bình Dương, đồng thời phát hiện sự thu hẹp biến dị của tập đoàn giống Bến Cát.
• Đóng góp dữ liệu khoa học thiết thực hỗ trợ đề án cải tạo 20% diện tích giống điều năng suất thấp hàng năm giai đoạn 2006–2010.

Các cơ quan quản lý nông nghiệp, viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất cần khẩn trương khai thác nguồn dữ liệu kiểu gen này để chuẩn hóa hệ thống vườn giống đầu dòng, đẩy mạnh nhân giống vô tính nhằm nâng cao giá trị kim ngạch xuất khẩu bền vững cho ngành điều Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TP. HCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Ñeà taøi: SÖÛ DUÏNG KYÕ THUAÄT RAPD – PCR TRONG NGHIEÂN CÖÙU TÍNH ÑA DAÏNG DI TRUYEÀN CUÛA MOÄT SOÁ GIOÁNG ÑIEÀU THU THAÄP TAÏI BÌNH DÖÔNG VAØ ÑOÀNG NAI LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC CHUYEÂN NGAØNH: MOÂI TRÖÔØNG – NOÂNG NGHIEÄP GVHD : TS. BUØI MINH TRÍ SVTH : LEÂ DUNG NGOÏC CHAÂU KHOÙA HOÏC : 2001 – 2005 Thaùng 03/ 2006 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TP. HCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Ñeà taøi SÖÛ DUÏNG KYÕ THUAÄT RAPD – PCR TRONG NGHIEÂN CÖÙU TÍNH ÑA DAÏNG DI TRUYEÀN CUÛA MOÄT SOÁ GIOÁNG ÑIEÀU THU THAÄP TAÏI BÌNH DÖÔNG VAØ ÑOÀNG NAI LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC CHUYEÂN NGAØNH: MOÂI TRÖÔØNG – NOÂNG NGHIEÄP GVHD : TS.

BUØI MINH TRÍ SVTH : LEÂ DUNG NGOÏC CHAÂU KHOÙA HOÏC : 2001 – 2005 Thaùng 03/ 2006 i LÔØI CAÛM ÔN Ñeå hoaøn thaønh cuoán luaän vaên naøy, toâi ñaõ nhaän ñöôïc söï höôùng daãn taän tình, söï goùp yù, giuùp ñôõ cuûa caùc Thaày Coâ, gia ñình vaø baïn beø. Nay toâi xin ñöôïc baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán: ➢ Cha Meï ñaõ sinh thaønh, daïy doã con ñaït ñöôïc ngaøy hoâm nay. Buøi Minh Trí ñaõ heát loøng höôùng daãn, taïo moïi ñieàu kieän thuaän lôïi cho toâi hoaøn taát ñeà taøi. Phan Ñaëng Thaùi Phöông ñaõ taän tình giuùp ñôõ, goùp yù vaø ñoäng vieân trong suoát thôøi gian toâi thöïc hieän luaän vaên toát nghieäp.

➢ Caùc Thaày Coâ thuoäc boä moân Coâng ngheä Sinh hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Môû – Baùn coâng Thaønh phoá Hoà Chí Minh. ➢ Caùc anh chò nhaân vieân thuoäc Trung taâm Nghieân cöùu Noâng nghieäp Höng Loäc vaø Döï aùn ñieàu Beán Caùt. ➢ Caùc anh chò thuoäc Trung taâm Phaân tích Thí nghieäm Hoùa Sinh – Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. ➢ Caùc baïn beø thaân yeâu lôùp SH01A2 ñaõ cuøng toâi chia seû vui buoàn, thaønh coâng vaø thaát baïi trong suoát thôøi gian toâi thöïc hieän ñeà taøi.

Hoà Chí Minh, thaùng 03/ 2006 Leâ Dung Ngoïc Chaâu ii MUÏC LUÏC Noäi dung Trang Trang töïa i Lôøi caûm ôn ii Muïc luïc iii Danh saùch caùc töø vieát taét vi Danh saùch caùc baûng vii Danh saùch caùc hình viii Chöông 1: MÔÛ ÑAÀU 1 1.1 Ñaët vaán ñeà 1 1.4 Giôùi haïn ñeà taøi 2 Chöông 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 3 2.1 Giôùi thieäu chung veà caây Ñieàu 3 2.2 Ñaëc ñieåm thöïc vaät hoïc 3 2.4 Tình hình saûn xuaát Ñieàu treân theá giôùi 5 2.5 Tình hình saûn xuaát Ñieàu ôû Vieät Nam 7 2.2 Thaønh phaàn hoùa hoïc 11 2.3 Caáu truùc hoùa hoïc 12 2.4 DNA thoûa maõn caùc yeâu caàu ñoái vôùi vaät chaát di truyeàn 12 2.1 Chöùa vaø truyeàn ñaït thoâng tin di truyeàn 12 2.2 Töï sao cheùp chính xaùc 13 2.3 Coù khaû naêng bieán dò di truyeàn 13 2.4 Coù tieàm naêng cho vieäc töï söûa sai 13 2.3 Kyõ thuaät PCR (Polymerase Chain Reaction) 13 2.2 Nguyeân taéc chung 14 2.3 Caùc caáu phaàn cuûa phaûn öùng 15 2.4 Toái öu hoùa phaûn öùng PCR 15 2.5 Caùc vaán ñeà thöôøng gaëp trong phaûn öùng PCR vaø phöông 17 iii phaùp khaéc phuïc 2.6 Nhöõng öùng duïng quan troïng cuûa PCR 18 2.7 Nhöõng haïn cheá cuûa PCR 19 2.4 Kyõ thuaät RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 20 2.1 Nguyeân taéc chung 20 2.2 Caùc böôùc tieán haønh kyõ thuaät RAPD 21 2.3 Nhöõng öu ñieåm cuûa kyõ thuaät RAPD 22 2.4 Nhöõng haïn cheá cuûa kyõ thuaät RAPD 22 2.5 Nhöõng öùng duïng cuûa kyõ thuaät RAPD 22 Chöông 3: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 23 3.1 NOÄI DUNG 1: Thu thaäp moät soá gioáng Ñieàu taïi Bình Döông, 23 Ñoàng Nai 3.1 Ñieàu kieän ñieàu tra 23 3.2 Phöông tieän ñieàu tra 23 3.3 Phöông phaùp ñieàu tra 23 3.2 NOÄI DUNG 2: Taùch chieát vaø kieåm tra DNA 24 3.1 Ñieàu kieän nghieân cöùu 24 3.2 Vaät lieäu vaø duïng cuï nghieân cöùu 24 3.3 Phöông phaùp nghieân cöùu 28 3.1 Taùch chieát DNA 28 3.2 Kieåm tra DNA 29 3.3 NOÄI DUNG 3: Chaïy RAPD – PCR 30 3.1 Ñieàu kieän nghieân cöùu 30 3.2 Vaät lieäu vaø duïng cuï nghieân cöùu 30 3.3 Phöông phaùp nghieân cöùu 31 3.4 NOÄI DUNG 4: Phaân tích keát quaû 32 Chöông 4: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN 33 4.1 NOÄI DUNG 1: Thu thaäp moät soá gioáng Ñieàu taïi Bình Döông, 33 Ñoàng Nai 4.1 Keát quaû thu thaäp maãu laù Ñieàu 33 4.2 Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi thu thaäp maãu 34 4.2 NOÄI DUNG 2: Taùch chieát vaø kieåm tra DNA 35 4.1 Keát quaû taùch chieát vaø kieåm tra DNA 35 4.1 Ñònh tính DNA baèng phöông phaùp ñieän di treân 35 gel agarose 4.2 Ñònh löôïng DNA baèng phöông phaùp ño maät ñoä 36 quang phoå iv 4.2 Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi taùch chieát vaø kieåm tra 37 DNA 4.3 NOÄI DUNG 3: Chaïy RAPD – PCR 38 4.1 Keát quaû chaïy RAPD – PCR cho caùc nghieäm thöùc 38 4.1 Nghieäm thöùc 1 38 4.2 Nghieäm thöùc 2 39 4.3 Nghieäm thöùc 3 39 4.2 Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi chaïy RAPD – PCR 41 4.4 NOÄI DUNG 4: Phaân tích keát quaû RAPD – PCR 42 4.2 Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi phaân tích keát quaû 45 Chöông 5: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 47 5.2 ÑEÀ NGHÒ 48 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 49 PHUÏ LUÏC 1: MOÄT SOÁ HÌNH AÛNH VEÀ CAÂY ÑIEÀU GHI NHAÄN ix ÑÖÔÏC PHUÏ LUÏC 2: PHIEÁU GHI CHUÙ MAÃU ÑIEÀU xii PHUÏ LUÏC 3: MAÃU PHIEÁU ÑIEÀU TRA NOÂNG DAÂN xiii PHUÏ LUÏC 4: ÑAËC ÑIEÅM CAÙC MAÃU ÑIEÀU THU THAÄP ÑÖÔÏC xvii PHUÏ LUÏC 5: KEÁT QUAÛ ÑO OD VAØ LÖÔÏNG DNA CAÙC MAÃU LY xxii TRÍCH PHUÏ LUÏC 6: MAÕ HOÙA SOÁ LIEÄU KEÁT QUAÛ RAPD – PCR xxiii v DANH SAÙCH CAÙC TÖØ VIEÁT TAÉT PCR: Polymerase Chain Reaction RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA Primer F: Forward primer – primer xuoâi Primer R: Reverse primer – primer ngöôïc DNA: Desoxyribonucleic Acid RNA: Ribonucleic Acid A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine U: Unit bp: base pairs ng: nanogram g: gram mM: milimol/ litre µM: micromol/ litre µl: microlitre dNTP: Desoxyribonucleotide – 5 – Triphosphate ATP: Adenosine – 5’ – Triphosphate Ta: Nhieät ñoä baét caëp cuûa primer vaø DNA trong phaûn öùng PCR Tm: Nhieät ñoä noùng chaûy cuûa primer OD: Optical Density CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetate TE: Tris – HCl – Ethylene Diamine Tetra Acetate TAE: Tris – Acetate – Ethylene Diamine Tetra Acetate EB: Extraction Buffer (CTAB, NaCl, Tris – HCl, EDTA, 2 – mercaptroethanol) vi DANH SAÙCH CAÙC BAÛNG Baûng Trang Baûng 2.1: Saûn löôïng nhaân haït Ñieàu cuûa theá giôùi nieân vuï 1997 vaø 7 2000 – 2001 Baûng 2.2: Tình hình phaùt trieån saûn xuaát Ñieàu taïi Vieät Nam döï kieán 9 ñeán 2010 Baûng 3.1: Caùch pha vaø taùc duïng cuûa caùc hoùa chaát ñeå taùch chieát DNA 25 Baûng 3.2: Thaønh phaàn vaø caùch pha dòch trích EB 28 Baûng 3.3: Thaønh phaàn vaø caùch pha dung dòch TE 1 X 28 Baûng 3.4: Chuaån bò pha cocktail cho 1 phaûn öùng 31 Baûng 3.5: Thieát laäp chu trình nhieät cho maùy PCR 32 Baûng 3.6: Boá trí thí nghieäm trong phaûn öùng RAPD – PCR 32 vii DANH SAÙCH CAÙC HÌNH Hình Trang Hình 2.1: Phaân boá dieän tích troàng Ñieàu ôû Vieät Nam naêm 1997 8 Hình 2.2: Nguyeân lyù kyõ thuaät PCR 15 Hình 2.3: Nguyeân lyù kyõ thuaät RAPD 21 Hình 4.1: Keát quaû ly trích DNA cuûa caùc maãu Ñieàu thu thaäp taïi Bình 35 Döông Hình 4.2: Keát quaû pha loaõng DNA cuûa caùc maãu Ñieàu thu thaäp taïi 36 Bình Döông Hình 4.3: Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR vôùi nghieäm thöùc 1 38 Hình 4.4: Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR vôùi nghieäm thöùc 2 39 Hình 4.5: Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR vôùi nghieäm thöùc 3 40 Hình 4.6: Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR vôùi nghieäm thöùc 3 coù 41 Ladder Hình 4.7: Keát quaû RAPD – PCR xöû lyù treân phaàn meàm Quantity One 42 Hình 4.8: Keát quaû phaân tích tính ña daïng di truyeàn döôùi daïng soá lieäu 43 NTSYS cuûa moät soá gioáng Ñieàu thu thaäp ôû Bình Döông vaø Ñoàng Nai Hình 4.9: Keát quaû phaân tích tính ña daïng di truyeàn döôùi daïng caây di 44 truyeàn cuûa moät soá gioáng Ñieàu thu thaäp ôû Bình Döông vaø Ñoàng Nai Hình 4.10: Gioáng Ñieàu MH 4/ 5 3 naêm tuoåi troàng taïi traïi gioáng thuoäc ix Döï aùn Ñieàu Beán Caùt – Bình Döông Hình 4.11: Gioáng Ñieàu PN1 3 naêm tuoåi troàng taïi traïi gioáng thuoäc Döï ix aùn Ñieàu Beán Caùt – Bình Döông Hình 4.12: Ñoït non cuûa gioáng Ñieàu CH1 x Hình 4.13: Ñoït non cuûa gioáng Ñieàu LG1 x Hình 4.14: Choài hoa 3 ngaøy tuoåi vaø choài hoa saép nôû cuûa gioáng Ñieàu x CH1 Hình 4.15: Choài hoa 20 ngaøy tuoåi vaø traùi non 5 tuaàn tuoåi cuûa gioáng x Ñieàu TL Sirichai 25 Hình 4.16: Hoa ñöïc vaø hoa löôõng tính cuûa gioáng Ñieàu TL Sirichai 25 xi Hình 4.17: Maøu saéc traùi cuûa gioáng Ñieàu PN1 (maøu vaøng) vaø LG1 xi (maøu ñoû) viii Chöông 1 MÔÛ ÑAÀU 1.1 ÑAËT VAÁN ÑEÀ Trong thaäp nieân 80, caây Ñieàu (Anacardium occidentale L.) chæ ñöôïc xem laø caây troàng xoùa ñoùi giaûm ngheøo, chuû yeáu duøng ñeå phuû xanh ñaát ñoài troïc. Hieän nay, caây Ñieàu ñaõ trôû thaønh caây troàng mang laïi kim ngaïch xuaát khaåu lôùn cho ñaát nöôùc. Döï baùo kim ngaïch xuaát khaåu nhaân Ñieàu vaø caùc saûn phaåm töø Ñieàu coù theå ñaït 1 tyû ñoâ la Myõ trong vaøi naêm tôùi [11]. Naêm 1999, dieän tích caây Ñieàu chæ coù 150.000 ha vôùi naêng suaát thaáp hôn 5 taï haït thoâ/ ha.

Ñeán nay, dieän tích caây Ñieàu ñaõ ñaït 400.000 ha, naêng suaát bình quaân 11 taï/ ha [15]. Tuy nhieân, so vôùi moät soá nöôùc trong khu vöïc thì caây Ñieàu cuûa nöôùc ta coù naêng suaát vaø chaát löôïng chöa cao. Chính vì vaäy, Boä Noâng nghieäp vaø Phaùt trieån Noâng thoân trieån khai ñeà aùn gioáng Ñieàu giai ñoaïn 2006 – 2010, phaán ñaáu moãi naêm thay theá, caûi taïo khoaûng 20 % dieän tích Ñieàu hieän coù ñeå ñaûm baûo ñeán 2010 khoâng coøn gioáng Ñieàu naêng suaát, chaát löôïng thaáp [9]. Vì vaäy, vieäc baûo toàn vaø phoå bieán moät soá gioáng Ñieàu coù naêng suaát vaø chaát löôïng vöôït troäi laø moät vieäc laøm caáp thieát.

Trong ñoù, vieäc ñaùnh giaù möùc ñoä ña daïng di truyeàn cuûa quaàn theå Ñieàu laø raát quan troïng, nhaèm laøm tieàn ñeà cho coâng taùc tuyeån choïn vaø lai taïo gioáng sau naøy. Ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä ña daïng di truyeàn cuûa quaàn theå, ngöôøi ta coù theå söû duïng nhieàu kyõ thuaät phaân töû khaùc nhau. Tuy nhieân, ñoái vôùi nhöõng ñoái töôïng chöa coù nhieàu thoâng tin veà boä gene, ngöôøi ta thöôøng coù xu höôùng söû duïng kyõ thuaät RAPD – PCR (vì kyõ thuaät naøy coù nhöõng öu ñieåm nhö: ñôn giaûn, deã thöïc hieän, chi phí thaáp…).