BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TP. HCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Ñeà taøi: SÖÛ DUÏNG KYÕ THUAÄT RAPD – PCR TRONG NGHIEÂN CÖÙU TÍNH ÑA DAÏNG DI TRUYEÀN CUÛA MOÄT SOÁ GIOÁNG ÑIEÀU THU THAÄP TAÏI BÌNH DÖÔNG VAØ ÑOÀNG NAI LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC CHUYEÂN NGAØNH: MOÂI TRÖÔØNG – NOÂNG NGHIEÄP GVHD : TS. BUØI MINH TRÍ SVTH : LEÂ DUNG NGOÏC CHAÂU KHOÙA HOÏC : 2001 – 2005 Thaùng 03/ 2006 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TP. HCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC Ñeà taøi SÖÛ DUÏNG KYÕ THUAÄT RAPD – PCR TRONG NGHIEÂN CÖÙU TÍNH ÑA DAÏNG DI TRUYEÀN CUÛA MOÄT SOÁ GIOÁNG ÑIEÀU THU THAÄP TAÏI BÌNH DÖÔNG VAØ ÑOÀNG NAI LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC CHUYEÂN NGAØNH: MOÂI TRÖÔØNG – NOÂNG NGHIEÄP GVHD : TS.
BUØI MINH TRÍ SVTH : LEÂ DUNG NGOÏC CHAÂU KHOÙA HOÏC : 2001 – 2005 Thaùng 03/ 2006 i LÔØI CAÛM ÔN Ñeå hoaøn thaønh cuoán luaän vaên naøy, toâi ñaõ nhaän ñöôïc söï höôùng daãn taän tình, söï goùp yù, giuùp ñôõ cuûa caùc Thaày Coâ, gia ñình vaø baïn beø. Nay toâi xin ñöôïc baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán: ➢ Cha Meï ñaõ sinh thaønh, daïy doã con ñaït ñöôïc ngaøy hoâm nay. Buøi Minh Trí ñaõ heát loøng höôùng daãn, taïo moïi ñieàu kieän thuaän lôïi cho toâi hoaøn taát ñeà taøi. Phan Ñaëng Thaùi Phöông ñaõ taän tình giuùp ñôõ, goùp yù vaø ñoäng vieân trong suoát thôøi gian toâi thöïc hieän luaän vaên toát nghieäp.
➢ Caùc Thaày Coâ thuoäc boä moân Coâng ngheä Sinh hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Môû – Baùn coâng Thaønh phoá Hoà Chí Minh. ➢ Caùc anh chò nhaân vieân thuoäc Trung taâm Nghieân cöùu Noâng nghieäp Höng Loäc vaø Döï aùn ñieàu Beán Caùt. ➢ Caùc anh chò thuoäc Trung taâm Phaân tích Thí nghieäm Hoùa Sinh – Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. ➢ Caùc baïn beø thaân yeâu lôùp SH01A2 ñaõ cuøng toâi chia seû vui buoàn, thaønh coâng vaø thaát baïi trong suoát thôøi gian toâi thöïc hieän ñeà taøi.
Hoà Chí Minh, thaùng 03/ 2006 Leâ Dung Ngoïc Chaâu ii MUÏC LUÏC Noäi dung Trang Trang töïa i Lôøi caûm ôn ii Muïc luïc iii Danh saùch caùc töø vieát taét vi Danh saùch caùc baûng vii Danh saùch caùc hình viii Chöông 1: MÔÛ ÑAÀU 1 1.1 Ñaët vaán ñeà 1 1.4 Giôùi haïn ñeà taøi 2 Chöông 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 3 2.1 Giôùi thieäu chung veà caây Ñieàu 3 2.2 Ñaëc ñieåm thöïc vaät hoïc 3 2.4 Tình hình saûn xuaát Ñieàu treân theá giôùi 5 2.5 Tình hình saûn xuaát Ñieàu ôû Vieät Nam 7 2.2 Thaønh phaàn hoùa hoïc 11 2.3 Caáu truùc hoùa hoïc 12 2.4 DNA thoûa maõn caùc yeâu caàu ñoái vôùi vaät chaát di truyeàn 12 2.1 Chöùa vaø truyeàn ñaït thoâng tin di truyeàn 12 2.2 Töï sao cheùp chính xaùc 13 2.3 Coù khaû naêng bieán dò di truyeàn 13 2.4 Coù tieàm naêng cho vieäc töï söûa sai 13 2.3 Kyõ thuaät PCR (Polymerase Chain Reaction) 13 2.2 Nguyeân taéc chung 14 2.3 Caùc caáu phaàn cuûa phaûn öùng 15 2.4 Toái öu hoùa phaûn öùng PCR 15 2.5 Caùc vaán ñeà thöôøng gaëp trong phaûn öùng PCR vaø phöông 17 iii phaùp khaéc phuïc 2.6 Nhöõng öùng duïng quan troïng cuûa PCR 18 2.7 Nhöõng haïn cheá cuûa PCR 19 2.4 Kyõ thuaät RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 20 2.1 Nguyeân taéc chung 20 2.2 Caùc böôùc tieán haønh kyõ thuaät RAPD 21 2.3 Nhöõng öu ñieåm cuûa kyõ thuaät RAPD 22 2.4 Nhöõng haïn cheá cuûa kyõ thuaät RAPD 22 2.5 Nhöõng öùng duïng cuûa kyõ thuaät RAPD 22 Chöông 3: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 23 3.1 NOÄI DUNG 1: Thu thaäp moät soá gioáng Ñieàu taïi Bình Döông, 23 Ñoàng Nai 3.1 Ñieàu kieän ñieàu tra 23 3.2 Phöông tieän ñieàu tra 23 3.3 Phöông phaùp ñieàu tra 23 3.2 NOÄI DUNG 2: Taùch chieát vaø kieåm tra DNA 24 3.1 Ñieàu kieän nghieân cöùu 24 3.2 Vaät lieäu vaø duïng cuï nghieân cöùu 24 3.3 Phöông phaùp nghieân cöùu 28 3.1 Taùch chieát DNA 28 3.2 Kieåm tra DNA 29 3.3 NOÄI DUNG 3: Chaïy RAPD – PCR 30 3.1 Ñieàu kieän nghieân cöùu 30 3.2 Vaät lieäu vaø duïng cuï nghieân cöùu 30 3.3 Phöông phaùp nghieân cöùu 31 3.4 NOÄI DUNG 4: Phaân tích keát quaû 32 Chöông 4: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN 33 4.1 NOÄI DUNG 1: Thu thaäp moät soá gioáng Ñieàu taïi Bình Döông, 33 Ñoàng Nai 4.1 Keát quaû thu thaäp maãu laù Ñieàu 33 4.2 Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi thu thaäp maãu 34 4.2 NOÄI DUNG 2: Taùch chieát vaø kieåm tra DNA 35 4.1 Keát quaû taùch chieát vaø kieåm tra DNA 35 4.1 Ñònh tính DNA baèng phöông phaùp ñieän di treân 35 gel agarose 4.2 Ñònh löôïng DNA baèng phöông phaùp ño maät ñoä 36 quang phoå iv 4.2 Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi taùch chieát vaø kieåm tra 37 DNA 4.3 NOÄI DUNG 3: Chaïy RAPD – PCR 38 4.1 Keát quaû chaïy RAPD – PCR cho caùc nghieäm thöùc 38 4.1 Nghieäm thöùc 1 38 4.2 Nghieäm thöùc 2 39 4.3 Nghieäm thöùc 3 39 4.2 Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi chaïy RAPD – PCR 41 4.4 NOÄI DUNG 4: Phaân tích keát quaû RAPD – PCR 42 4.2 Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi phaân tích keát quaû 45 Chöông 5: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 47 5.2 ÑEÀ NGHÒ 48 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 49 PHUÏ LUÏC 1: MOÄT SOÁ HÌNH AÛNH VEÀ CAÂY ÑIEÀU GHI NHAÄN ix ÑÖÔÏC PHUÏ LUÏC 2: PHIEÁU GHI CHUÙ MAÃU ÑIEÀU xii PHUÏ LUÏC 3: MAÃU PHIEÁU ÑIEÀU TRA NOÂNG DAÂN xiii PHUÏ LUÏC 4: ÑAËC ÑIEÅM CAÙC MAÃU ÑIEÀU THU THAÄP ÑÖÔÏC xvii PHUÏ LUÏC 5: KEÁT QUAÛ ÑO OD VAØ LÖÔÏNG DNA CAÙC MAÃU LY xxii TRÍCH PHUÏ LUÏC 6: MAÕ HOÙA SOÁ LIEÄU KEÁT QUAÛ RAPD – PCR xxiii v DANH SAÙCH CAÙC TÖØ VIEÁT TAÉT PCR: Polymerase Chain Reaction RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA Primer F: Forward primer – primer xuoâi Primer R: Reverse primer – primer ngöôïc DNA: Desoxyribonucleic Acid RNA: Ribonucleic Acid A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine U: Unit bp: base pairs ng: nanogram g: gram mM: milimol/ litre µM: micromol/ litre µl: microlitre dNTP: Desoxyribonucleotide – 5 – Triphosphate ATP: Adenosine – 5’ – Triphosphate Ta: Nhieät ñoä baét caëp cuûa primer vaø DNA trong phaûn öùng PCR Tm: Nhieät ñoä noùng chaûy cuûa primer OD: Optical Density CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetate TE: Tris – HCl – Ethylene Diamine Tetra Acetate TAE: Tris – Acetate – Ethylene Diamine Tetra Acetate EB: Extraction Buffer (CTAB, NaCl, Tris – HCl, EDTA, 2 – mercaptroethanol) vi DANH SAÙCH CAÙC BAÛNG Baûng Trang Baûng 2.1: Saûn löôïng nhaân haït Ñieàu cuûa theá giôùi nieân vuï 1997 vaø 7 2000 – 2001 Baûng 2.2: Tình hình phaùt trieån saûn xuaát Ñieàu taïi Vieät Nam döï kieán 9 ñeán 2010 Baûng 3.1: Caùch pha vaø taùc duïng cuûa caùc hoùa chaát ñeå taùch chieát DNA 25 Baûng 3.2: Thaønh phaàn vaø caùch pha dòch trích EB 28 Baûng 3.3: Thaønh phaàn vaø caùch pha dung dòch TE 1 X 28 Baûng 3.4: Chuaån bò pha cocktail cho 1 phaûn öùng 31 Baûng 3.5: Thieát laäp chu trình nhieät cho maùy PCR 32 Baûng 3.6: Boá trí thí nghieäm trong phaûn öùng RAPD – PCR 32 vii DANH SAÙCH CAÙC HÌNH Hình Trang Hình 2.1: Phaân boá dieän tích troàng Ñieàu ôû Vieät Nam naêm 1997 8 Hình 2.2: Nguyeân lyù kyõ thuaät PCR 15 Hình 2.3: Nguyeân lyù kyõ thuaät RAPD 21 Hình 4.1: Keát quaû ly trích DNA cuûa caùc maãu Ñieàu thu thaäp taïi Bình 35 Döông Hình 4.2: Keát quaû pha loaõng DNA cuûa caùc maãu Ñieàu thu thaäp taïi 36 Bình Döông Hình 4.3: Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR vôùi nghieäm thöùc 1 38 Hình 4.4: Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR vôùi nghieäm thöùc 2 39 Hình 4.5: Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR vôùi nghieäm thöùc 3 40 Hình 4.6: Keát quaû ñieän di saûn phaåm PCR vôùi nghieäm thöùc 3 coù 41 Ladder Hình 4.7: Keát quaû RAPD – PCR xöû lyù treân phaàn meàm Quantity One 42 Hình 4.8: Keát quaû phaân tích tính ña daïng di truyeàn döôùi daïng soá lieäu 43 NTSYS cuûa moät soá gioáng Ñieàu thu thaäp ôû Bình Döông vaø Ñoàng Nai Hình 4.9: Keát quaû phaân tích tính ña daïng di truyeàn döôùi daïng caây di 44 truyeàn cuûa moät soá gioáng Ñieàu thu thaäp ôû Bình Döông vaø Ñoàng Nai Hình 4.10: Gioáng Ñieàu MH 4/ 5 3 naêm tuoåi troàng taïi traïi gioáng thuoäc ix Döï aùn Ñieàu Beán Caùt – Bình Döông Hình 4.11: Gioáng Ñieàu PN1 3 naêm tuoåi troàng taïi traïi gioáng thuoäc Döï ix aùn Ñieàu Beán Caùt – Bình Döông Hình 4.12: Ñoït non cuûa gioáng Ñieàu CH1 x Hình 4.13: Ñoït non cuûa gioáng Ñieàu LG1 x Hình 4.14: Choài hoa 3 ngaøy tuoåi vaø choài hoa saép nôû cuûa gioáng Ñieàu x CH1 Hình 4.15: Choài hoa 20 ngaøy tuoåi vaø traùi non 5 tuaàn tuoåi cuûa gioáng x Ñieàu TL Sirichai 25 Hình 4.16: Hoa ñöïc vaø hoa löôõng tính cuûa gioáng Ñieàu TL Sirichai 25 xi Hình 4.17: Maøu saéc traùi cuûa gioáng Ñieàu PN1 (maøu vaøng) vaø LG1 xi (maøu ñoû) viii Chöông 1 MÔÛ ÑAÀU 1.1 ÑAËT VAÁN ÑEÀ Trong thaäp nieân 80, caây Ñieàu (Anacardium occidentale L.) chæ ñöôïc xem laø caây troàng xoùa ñoùi giaûm ngheøo, chuû yeáu duøng ñeå phuû xanh ñaát ñoài troïc. Hieän nay, caây Ñieàu ñaõ trôû thaønh caây troàng mang laïi kim ngaïch xuaát khaåu lôùn cho ñaát nöôùc. Döï baùo kim ngaïch xuaát khaåu nhaân Ñieàu vaø caùc saûn phaåm töø Ñieàu coù theå ñaït 1 tyû ñoâ la Myõ trong vaøi naêm tôùi [11]. Naêm 1999, dieän tích caây Ñieàu chæ coù 150.000 ha vôùi naêng suaát thaáp hôn 5 taï haït thoâ/ ha.
Ñeán nay, dieän tích caây Ñieàu ñaõ ñaït 400.000 ha, naêng suaát bình quaân 11 taï/ ha [15]. Tuy nhieân, so vôùi moät soá nöôùc trong khu vöïc thì caây Ñieàu cuûa nöôùc ta coù naêng suaát vaø chaát löôïng chöa cao. Chính vì vaäy, Boä Noâng nghieäp vaø Phaùt trieån Noâng thoân trieån khai ñeà aùn gioáng Ñieàu giai ñoaïn 2006 – 2010, phaán ñaáu moãi naêm thay theá, caûi taïo khoaûng 20 % dieän tích Ñieàu hieän coù ñeå ñaûm baûo ñeán 2010 khoâng coøn gioáng Ñieàu naêng suaát, chaát löôïng thaáp [9]. Vì vaäy, vieäc baûo toàn vaø phoå bieán moät soá gioáng Ñieàu coù naêng suaát vaø chaát löôïng vöôït troäi laø moät vieäc laøm caáp thieát.
Trong ñoù, vieäc ñaùnh giaù möùc ñoä ña daïng di truyeàn cuûa quaàn theå Ñieàu laø raát quan troïng, nhaèm laøm tieàn ñeà cho coâng taùc tuyeån choïn vaø lai taïo gioáng sau naøy. Ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä ña daïng di truyeàn cuûa quaàn theå, ngöôøi ta coù theå söû duïng nhieàu kyõ thuaät phaân töû khaùc nhau. Tuy nhieân, ñoái vôùi nhöõng ñoái töôïng chöa coù nhieàu thoâng tin veà boä gene, ngöôøi ta thöôøng coù xu höôùng söû duïng kyõ thuaät RAPD – PCR (vì kyõ thuaät naøy coù nhöõng öu ñieåm nhö: ñôn giaûn, deã thöïc hieän, chi phí thaáp…).