Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá tra

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp, ứng dụng hiệu quả trong thủy phân gelatin da cá tra, mở ra tiềm năng công nghiệp.

• Tác giả: Phạm Mỹ Dung
• Người hướng dẫn: Phạm Công Hoạt
• Trường học: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá tra
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Cấu trúc và tính chất gelatin
• 1.2. Gelatin có nguồn gốc từ da cá
• 1.3. Đặc điểm, chức năng của gelatinase
• 1.4. Phân loại gelatinase
• 1.5. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của gelatinase
• 1.6. Tính chất chung của gelatinase
• 1.7. Nguồn sản xuất gelatinase
• 2. CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP
• 2.1. Sản xuất gelatinase tái tổ hợp
• 3. CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GELATINASE TẠI VIỆT NAM
• 3.1. Nghiên cứu sản xuất gelatinase
• 3.2. Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá
• 4. CHƯƠNG 4: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 4.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
• 4.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
• 4.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.4.1. Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase
• 4.4.2. Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp
• 4.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL
• 4.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL
• 4.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da cá tra
• 4.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 5.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE
• 5.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao
• 5.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn
• 5.2. TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP
• 5.2.1. Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E. coli tái tổ hợp
• 5.2.2. Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase
• 5.2.3. Giải trình tự và phân tích gen gelE
• 5.2.4. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli tái tổ hợp mang gen gelE
• 5.3. ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL
• 5.3.1. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL
• 5.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL
• 5.3.3. Ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện rGEL
• 5.3.4. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp
• 5.4. THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL
• 5.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL
• 5.4.2. Đặc tính của gelatinase tái tổ hợp
• 5.5. ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA
• 5.5.1. Kết quả xác định các điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL
• 5.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen
• 6. CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về gelatinase tái tổ hợp

Gelatinase tái tổ hợp là một enzyme quan trọng trong công nghệ sinh học, được sản xuất thông qua kỹ thuật di truyền. Enzyme này có khả năng thủy phân gelatin thành các peptide và axit amin, ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm, y tế và hóa chất. Gelatinase tự nhiên thường được chiết xuất từ các vi khuẩn như Staphylococcus, Pseudomonas, và Bacillus, nhưng các chủng này có thể gây hại cho con người và động vật. Do đó, việc sản xuất gelatinase tái tổ hợp từ các chủng vi khuẩn an toàn như Escherichia coli đã trở thành hướng nghiên cứu chính. Enzyme tái tổ hợp này không chỉ loại bỏ nguy cơ gây hại mà còn có hoạt tính cao hơn so với enzyme tự nhiên.

1.1. Cấu trúc và chức năng của gelatinase

Gelatinase thuộc nhóm metalloprotease, có cấu trúc gồm các domain chức năng như domain xúc tác và domain liên kết với kim loại. Enzyme này có khả năng phân hủy gelatin, collagen, và các protein khác thành các peptide nhỏ. Gelatinase đóng vai trò quan trọng trong quá trình tái tạo mô và chẩn đoán ung thư. Trong công nghiệp, gelatinase được sử dụng để thủy phân da cá tra thành các axit amin, tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế cao.

1.2. Nguồn sản xuất gelatinase tái tổ hợp

Gelatinase tái tổ hợp được sản xuất thông qua việc biểu hiện gen mã hóa enzyme trong các hệ thống tái tổ hợp như Escherichia coli. Quá trình này bao gồm việc nhân dòng gen, thiết kế vector biểu hiện, và tối ưu hóa điều kiện lên men. Công nghệ sinh học hiện đại cho phép sản xuất enzyme tái tổ hợp với hiệu suất cao và ổn định, đáp ứng nhu cầu sử dụng trong quy mô công nghiệp.

II. Ứng dụng thủy phân gelatin da cá tra

Thủy phân gelatin từ da cá tra là một ứng dụng quan trọng của gelatinase tái tổ hợp. Da cá tra là phụ phẩm phổ biến trong ngành chế biến thủy sản, chiếm khoảng 4-6% tổng lượng phụ phẩm. Việc sử dụng gelatinase tái tổ hợp để thủy phân gelatin da cá không chỉ tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế cao mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Quy trình thủy phân bao gồm các bước như xử lý nguyên liệu, tối ưu hóa điều kiện thủy phân, và thu hồi sản phẩm.

2.1. Quy trình thủy phân gelatin

Quy trình thủy phân gelatin bắt đầu với việc xử lý da cá tra để loại bỏ tạp chất và chuẩn bị nguyên liệu. Sau đó, gelatinase tái tổ hợp được sử dụng để thủy phân gelatin trong điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu. Quá trình này tạo ra các peptide và axit amin, được thu hồi và tinh chế để sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi. Công nghệ enzyme này mang lại hiệu quả cao và an toàn so với các phương pháp thủy phân hóa học.

2.2. Ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi

Sản phẩm thủy phân từ gelatin da cá tra được sử dụng làm thức ăn bổ sung cho cá biển, đặc biệt là cá Mú chấm đen. Các axit amin thiết yếu trong sản phẩm thủy phân giúp cải thiện tốc độ tăng trưởng và sức khỏe của cá. Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất thức ăn chăn nuôi không chỉ nâng cao hiệu quả kinh tế mà còn góp phần phát triển bền vững ngành nuôi trồng thủy sản.

III. Kết quả và đánh giá

Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo ra gelatinase tái tổ hợp từ chủng Escherichia coli BL21(DE3) và ứng dụng enzyme này trong thủy phân gelatin da cá tra. Kết quả cho thấy gelatinase tái tổ hợp có hoạt tính cao và ổn định, phù hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp. Sản phẩm thủy phân từ da cá tra được sử dụng hiệu quả trong thức ăn chăn nuôi, góp phần nâng cao giá trị kinh tế của phụ phẩm thủy sản.

3.1. Hiệu quả kinh tế và môi trường

Việc ứng dụng gelatinase tái tổ hợp trong thủy phân gelatin da cá tra không chỉ mang lại hiệu quả kinh tế cao mà còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Phụ phẩm từ ngành chế biến thủy sản được tận dụng triệt để, tạo ra các sản phẩm có giá trị gia tăng. Công nghệ sinh học đã chứng minh vai trò quan trọng trong việc phát triển bền vững ngành thủy sản.

3.2. Hướng phát triển trong tương lai

Nghiên cứu mở ra hướng phát triển mới trong việc sản xuất và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất, mở rộng ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác, và phát triển các chủng vi khuẩn tái tổ hợp mới với hiệu suất cao hơn. Ứng dụng công nghệ sinh học sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc giải quyết các thách thức về môi trường và kinh tế.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Ngành chế biến thủy sản Việt Nam, đặc biệt là chuỗi giá trị cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus), tạo ra nguồn phụ phẩm khổng lồ với sản lượng hàng năm vượt 1,11 triệu tấn trên diện tích nuôi hơn 6.078 ha, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 1,78 tỷ USD (năm 2017). Trong cấu trúc chế biến philê (tỷ lệ thu hồi 1 kg philê từ 2,0–2,5 kg cá nguyên liệu), phần phụ phẩm chiếm 1,0–1,5 kg, trong đó da cá chiếm từ 4–6%. Da cá Tra chứa hàm lượng collagen/gelatin rất dồi dào (chiếm trên 30–50% khối lượng chất khô) với tỷ lệ protein đạt 98–99%. Tuy nhiên, các phương pháp thủy phân truyền thống sử dụng acid vô cơ mạnh ($6\text{ M HCl}$ ở $110^\circ\text{C}$ trong 16 giờ) hoặc kiềm đặc vừa tiêu hao năng lượng, ăn mòn thiết bị, gây ô nhiễm môi trường, vừa gây ra hiện tượng racemic hóa (biến đổi đồng phân quang học D/L) làm mất hoạt tính sinh học và giảm khả năng thẩm thấu của axit amin qua màng ruột động vật.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ việc các nguồn gelatinase (EC 3.4.24.x) tự nhiên phân lập từ vi sinh vật như Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus hay Staphylococcus aureus thường đi kèm với độc tố gây bệnh cơ hội hoặc độc lực ngoại bào, đồng thời hiệu suất sinh tổng hợp và hoạt tính riêng rất thấp (chỉ đạt 2,5–3,2 U/mg) (Shanmugasundaram et al., 2012; Odunuga et al., 2015). Luận án của nghiên cứu sinh Phạm Mỹ Dung (2018) với tiêu đề "Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra" thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học (Mã số: 9 42 02 01), thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phạm Công Hoạt và GS. Lê Huy Hàm, đã giải quyết triệt để bài toán này bằng công nghệ ADN tái tổ hợp và kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.

Hệ thống câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu được xác lập chặt chẽ:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Trình tự gen mã hóa gelatinase (gelE) từ chủng vi khuẩn bản địa Enterococcus faecalis MD4 có đặc điểm cấu trúc phân tử và mức độ tương đồng như thế nào so với các chủng chuẩn quốc tế?
   • Giả thuyết 1 (H1): Gen gelE từ E. faecalis MD4 mã hóa một metalloendopeptidase thuộc họ M4 sở hữu mô-típ xúc tác bảo thủ $\text{HExxH}$, có khả năng biểu hiện chức năng hoàn chỉnh trong hệ thống vật chủ Escherichia coli.
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Điều kiện công nghệ nào tối ưu hóa quá trình biểu hiện, cuộn gập cấu trúc và tinh sạch gelatinase tái tổ hợp (rGEL) trên vector $\text{pET-22b(+)}$ trong E. coli BL21(DE3)?
   • Giả thuyết 2 (H2): Việc điều biến nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ hạ thấp và hệ thống promoter T7 sẽ cho phép thu hồi rGEL dạng hòa tan với hoạt tính xúc tác vượt trội so với enzyme tự nhiên.
3. Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Chế phẩm peptide và axit amin thu được từ quá trình enzyme hóa gelatin da cá Tra có đáp ứng yêu cầu dinh dưỡng chuyên biệt để cải thiện tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống của cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) giai đoạn giống hay không?
   • Giả thuyết 3 (H3): Bổ sung dịch thủy phân giàu glycine, proline và hydroxyproline ở tỷ lệ tối ưu sẽ làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR), đồng thời kích thích tăng trưởng chiều dài và khối lượng vượt trội.

Khung lý thuyết của công trình tích hợp lý thuyết kỹ thuật di truyền biểu hiện enzyme ngoại lai (Recombinant Protein Expression Theory), cơ chế điều hòa quorum-sensing operon fsrABCD của vi khuẩn Gram dương, và động học xúc tác enzym học Michaelis–Menten. Về phạm vi, nghiên cứu tiến hành trong giai đoạn 2013–2017, thu thập mẫu da cá Tra tại Cần Thơ, thiết kế biểu hiện tại Viện Đại học Mở Hà Nội, và khảo nghiệm sinh học trên đàn cá Mú giống ($n = 7,067\text{ g/con}$, kích cỡ 7 cm) tại Trại Thực nghiệm nuôi Hải sản Trường Đại học Vinh.

Literature Review và Positioning

Tổng quan tài liệu chỉ ra ba dòng nghiên cứu chính trong lĩnh vực thu nhận gelatin và enzyme thủy phân:

Dòng thứ nhất tập trung vào công nghệ tách chiết và đặc tính hóa sinh của gelatin từ phụ phẩm da cá biển và cá nước ngọt. Gomez-Guillen và Montero (2001, 2002), Ahmad và Benjakul (2011), Karim và Bhat (2009) đã chứng minh cấu trúc bậc 1 của gelatin da cá giàu bộ ba axit amin $\text{Gly-Pro-Hyp}$, trong đó Glycine chiếm 26–34%, Proline chiếm 10–18% và Hydroxyproline chiếm 7–15%. Tuy nhiên, điểm hạn chế của gelatin da cá là độ bền gel (Bloom value) và nhiệt độ nóng chảy thấp hơn da động vật có vú (lợn, bò), khiến việc ứng dụng trực tiếp gặp khó khăn, đòi hỏi phải chuyển hóa thành dạng peptide hòa tan có hoạt tính sinh học.

Dòng thứ hai khảo sát cơ chế thủy phân protein/gelatin bằng hệ enzyme thương mại hoặc enzyme tự nhiên. Sanaei Ardekani và cộng sự (2013) nghiên cứu thành phần axit amin từ da cá trơn Clarias gariepinus qua thủy phân acid vô cơ, chỉ ra tổng hàm lượng imino acid đạt 173 dư lượng/1000. Aleman và cộng sự (2011) sử dụng Alcalase, Trypsin và Pepsin từ động vật để thủy phân gelatin cá ngừ và mực ở $50^\circ\text{C}$ trong 3 giờ nhằm thu nhận peptide chống oxy hóa. Wachirattanapongmettee và cộng sự (2009) dùng Protex để phân cắt protein cá da trơn. Điểm tranh luận cốt lõi giữa hai trường phái:

• Trường phái thủy phân hóa học: Đạt hiệu suất phân cắt sâu nhưng phá hủy hoàn toàn tryptophan, phân hủy glutamine/asparagine, sinh sản phẩm phụ độc hại và làm mất đồng phân quang học L-amino acid.
• Trường phái thủy phân sinh học enzyme: Giữ nguyên vẹn giá trị dinh dưỡng của các axit amin thiết yếu, kiểm soát được độ dài chuỗi peptide, an toàn cho động vật thủy sản nhưng bị cản trở bởi chi phí enzyme thương phẩm đắt đỏ và độ đặc hiệu chưa tối ưu đối với cơ chất collagen cuộn ba sợi xoắn.

Dòng thứ ba là sinh học phân tử và kỹ thuật tái tổ hợp metalloprotease. Makinen và cộng sự (1989, 1994), Rawlings và Salvesen (2013) phân loại gelatinase từ Enterococcus faecalis (còn gọi là coccolysin, EC 3.4.24.30) thuộc họ M4 zinc-endopeptidase. Del Papa và cộng sự (2007) giải mã quá trình thành thục của gelatinase: gen mã hóa tiền protein (preproenzyme) 509 axit amin ($56,5\text{ kDa}$), sau khi cắt peptide tín hiệu 28 axit amin và vùng propeptide ($163\text{ aa}$), cùng sự tự phân cắt 14 axit amin đầu C ($\text{IQVNQPSESVLVNE}$) để tạo enzyme trưởng thành hoạt tính có khối lượng $33,03\text{ kDa}$. Cơ chế điều hòa biểu hiện gen gelE tự nhiên phụ thuộc chặt chẽ vào hệ thống quorum-sensing operon fsrABCD qua peptide vòng tín hiệu GBAP 11 axit amin (Nakayama et al., 2006; Teixeira et al., 2012; Perez et al., 2015). Do đó, việc tách rời gelE khỏi hệ điều hòa phức tạp fsr để biểu hiện độc lập trên vi khuẩn chủ an toàn là hướng tiếp cận có tính đột phá.

So sánh với hai nghiên cứu quốc tế điển hình:

1. Odunuga và cộng sự (2015): Biểu hiện elastase lasB ($33\text{ kDa}$) từ Pseudomonas aeruginosa trên E. coli BL21 gắn đuôi His-tag, đạt hiệu suất $40\text{ mg/L}$ và hoạt tính riêng $3,2\text{ U/mg}$. Luận án của NCS. Phạm Mỹ Dung đạt hoạt tính riêng của rGEL lên tới $38,14\text{ U/mg}$ protein, vượt trội gấp 11,9 lần.
2. USBiological Life Science (mã số 373424): Thương mại hóa gelatinase tái tổ hợp dung hợp đuôi His-SUMO-Tag với phân tử lượng lớn ($50,5\text{ kDa}$), gây cản trở nhất định đến cấu trúc không gian của tâm xúc tác. Công trình này biểu hiện trực tiếp đoạn gene enzyme trên vector $\text{pET-22b(+)}$, tạo ra enzyme có kích thước thực nghiệm $33–34\text{ kDa}$ tương đồng chính xác với cấu trúc enzyme tự nhiên có hoạt tính cao nhất.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng học thuyết xúc tác metalloenzyme M4 (M4 Peptidase Family Theory) và lý thuyết sinh học phân tử về sự biến đổi sau dịch mã (Post-translational Processing). Cụ thể, công trình chứng minh:

• Tiền chất GelE ngoại lai trong tế bào E. coli không cần sự hiện diện của enzyme serine proteinase ngoại bào (sprE) hoặc hệ cảm ứng mật độ fsr mà vẫn có khả năng tự xúc tác hoàn thiện quá trình xén tỉa vùng propeptide đầu N và đoạn peptide 14 axit amin đầu C để hình thành trung tâm hoạt động phối trí ion kẽm $\text{Zn}^{2+}$.
• Mô hình lý thuyết xác nhận mô-típ bảo thủ $\text{HEXXH}$ ($\text{His237}$, $\text{His331}$, $\text{Glu351}$ liên kết phối trí với $\text{Zn}^{2+}$ và $\text{Glu328}$ đóng vai trò là tâm xúc tác acid-base) duy trì tính toàn vẹn chức năng xúc tác trên cơ chất collagen/gelatin biến tính.

Mô hình định đề lý thuyết (Theoretical Propositions):

• Mệnh đề 1 (P1): Sự phiên mã của gen gelE đặt dưới sự kiểm soát của promoter T7 mạnh cho phép khắc phục hoàn toàn rào cản phụ thuộc nồng độ ngưỡng GBAP trong hệ thống fsrABCD tự nhiên.
• Mệnh đề 2 (P2): Việc tái cấu trúc không gian của enzyme M4 trong điều kiện có mặt các ion kim loại hóa trị hai ($\text{Ca}^{2+}$, $\text{Zn}^{2+}$) đóng vai trò bảo vệ cấu trúc bậc 3 chống lại hiện tượng biến tính nhiệt và ức chế tự phân hủy nội phân tử.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành giữa:

1. Lý thuyết Di truyền phân tử (Molecular Genetics): Giải mã trình tự gen 16S rRNA và gelE từ chủng E. faecalis MD4, phân tích cây phát sinh chủng loại (Phylogenetic tree) và căn chỉnh đa trình tự bằng BLAST/ClustalW.
2. Lý thuyết Động học enzyme (Enzyme Kinetics): Khảo sát ái lực liên kết enzyme-cơ chất thông qua phương trình Michaelis–Menten và đồ thị tuyến tính hóa Lineweaver–Burk ($1/V$ theo $1/[S]$), xác định hằng số ái lực $K_m$ và vận tốc phản ứng cực đại $V_{max}$.
3. Lý thuyết Dinh dưỡng thủy sản nâng cao (Aquacultural Nutrition Theory): Phân tích tương quan giữa mức độ thủy phân (Degree of Hydrolysis - DH), sự giải phóng các axit amin tự do/peptide trọng lượng phân tử thấp ($<10\text{ kDa}$) với khả năng hấp thu tại diềm bàn chải ruột non của cá biển ăn thịt.

Điều kiện biên (Boundary conditions): Hệ thống biểu hiện tối ưu trong phạm vi vi khuẩn chủ thiếu hụt protease nội bào (lon, ompT), cơ chất gelatin từ cá Tra đã qua xử lý nhiệt làm duỗi xoắn cấu trúc bậc 4 và pH môi trường thủy phân duy trì trong vùng kiềm nhẹ đến trung tính ($7,0–8,5$).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ thế giới quan thực chứng (Positivism Paradigm) với thiết kế thực nghiệm định lượng nghiêm ngặt đa tầng (Multi-level Experimental Design):

• Cấp độ 1 (In silico & In vitro phân tử): Phân lập, sàng lọc 11 chủng vi khuẩn sinh gelatinase từ mẫu bệnh phẩm cá nước ngọt; tách chiết DNA tổng số, thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen gelE kích thước $1,5\text{ kb}$; tạo dòng trên vector tách dòng $\text{pGEM-T Easy}$ trước khi chuyển vị vào vector biểu hiện $\text{pET-22b(+)}$.
• Cấp độ 2 (Lên men sinh thái học & Biểu hiện): Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ E. coli BL21(DE3). Khảo sát các thông số điều khiển: nhiệt độ ($30^\circ\text{C}$, $34^\circ\text{C}$, $37^\circ\text{C}$), pH môi trường ($6,0–8,0$), nồng độ chất cảm ứng IPTG ($0,1–1,0\text{ mM}$), thời điểm cảm ứng ($\text{OD}_{600} = 0,6–0,8$) và động thái thời gian lên men ($0–24\text{ giờ}$).
• Cấp độ 3 (Xúc tác sinh học & Tinh sạch): Phá vỡ tế bào bằng siêu âm, tinh sạch rGEL qua hệ thống sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC) với cột Ni-NTA agarose; kiểm tra độ tinh sạch và phân tử lượng bằng điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE 12%) và nhuộm Comassie Brilliant Blue R-250.
• Cấp độ 4 (Khảo nghiệm sinh học in vivo): Bố trí thí nghiệm nuôi cá Mú chấm đen ($N = 600$ con, chia đều vào các giai ương $1\text{ m}^3$) với các công thức thức ăn đối chứng và bổ sung dịch thủy phân axit amin ở các tỷ lệ khác nhau, theo dõi liên tục các chỉ tiêu sinh trưởng và tỷ lệ sống.

Enterococcus faecalis MD4 
Gen gelE (1,5 kb) 
Vector tái tổ hợp pET-22b(+)-gelE 
E. coli BL21(DE3) [T7 promoter, Δlon, ΔompT]
rGEL (33–34 kDa, hoạt tính 38,14 U/mg)
Bột Axit Amin & Peptides giàu Gly/Pro/Hyp
Cải thiện SGR, ADG, FCR và Tỷ lệ sống của cá Mú giống

Quy trình nghiên cứu và Kiểm soát sai số

Quy trình nghiên cứu được chuẩn hóa quốc tế:

• Hoạt tính gelatinase được xác định dựa trên mức độ phân giải cơ chất azocoll hoặc gelatin ở bước sóng $\lambda = 540\text{ nm}$ và $\lambda = 280\text{ nm}$; 1 đơn vị hoạt tính (U) được định nghĩa là lượng enzyme làm tăng độ hấp thụ quang thêm 0,01 đơn vị trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn ($37^\circ\text{C}$, $\text{pH } 7,5$).
• Hàm lượng protein hòa tan xác định theo phương pháp Bradford có sử dụng đường chuẩn Bovine Serum Albumin (BSA).
• Thành phần axit amin của dịch thủy phân được phân tích định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao trao đổi ion (HPLC) với đầu dò huỳnh quang sau khi tạo dẫn xuất.
• Độ tin cậy và tính giá trị (Validity & Reliability): Thực nghiệm lặp lại tối thiểu 3 lần ($n=3$). Số liệu sinh học được thu thập đồng bộ về các chỉ số: Tốc độ tăng trưởng hàng ngày ($\text{ADG} = (W_2 - W_1)/t$), Tốc độ tăng trưởng đặc trưng ($\text{SGR} = 100 \times (\ln W_2 - \ln W_1)/t$), Hệ số chuyển đổi thức ăn ($\text{FCR} = \text{Lượng thức ăn tiêu thụ}/\text{Khối lượng tăng}$), Tỷ lệ sống ($\text{SR} = (N_t/N_0) \times 100%$) và Hệ số biến động chiều dài/khối lượng ($CV%$).

Phân tích thống kê

Dữ liệu thực nghiệm được xử lý bằng phần mềm thống kê chuyên dụng SPSS 20.0 và Microsoft Excel. Phân tích phương sai một nhân tố (One-way ANOVA) được áp dụng để đánh giá sự khác biệt giữa các nghiệm thức. So sánh sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình bằng phép thử Duncan hoặc Tukey HSD ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ và độ tin cậy $95%$ ($CI = 95%$). Động học enzyme được phi tuyến hóa và hồi quy tuyến tính xác định các giá trị $R^2 > 0,98$.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Tuyển chọn và định danh thành công chủng vi khuẩn bản địa sinh tổng hợp gelatinase: Từ 11 chủng vi sinh vật phân lập từ cá nước ngọt, đã tuyển chọn được chủng MD4 có khả năng sinh gelatinase cao nhất với đường kính vòng phân giải gelatin trên đĩa thạch đạt kích thước lớn nhất. Phân tích trình tự gen 16S rRNA định danh chủng MD4 là Enterococcus faecalis (độ tương đồng 99% trên GenBank). Trình tự gen gelE khuếch đại có kích thước chính xác 1.530 bp, mã hóa chuỗi polypeptit 509 axit amin mang đầy đủ cấu trúc đặc trưng của metalloendopeptidase họ M4.
2. Thiết kế thành công chủng tái tổ hợp mang hoạt tính xúc tác cao: Xây dựng thành công vector tái tổ hợp $\text{pET-22b(+)-gelE}$ và biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3). Kết quả SDS-PAGE xác nhận enzyme gelatinase tái tổ hợp (rGEL) được biểu hiện rõ nét ở kích thước phân tử khoảng $33–34\text{ kDa}$, phù hợp hoàn hảo với kích thước phân tử lý thuyết của gelatinase trưởng thành sau khi tự cắt bỏ propeptide. Hoạt tính riêng của rGEL sau tinh sạch qua cột ái lực Ni-NTA đạt $38,14\text{ U/mg}$ protein, tăng gấp hàng chục lần so với dịch enzyme thô ban đầu.
3. Xác lập hệ thông số động học và đặc tính hóa lý tối ưu của rGEL: rGEL thể hiện hoạt tính xúc tác cao nhất tại nhiệt độ $40–45^\circ\text{C}$ và $\text{pH } 7,5–8,0$. Enzyme duy trì độ bền nhiệt ổn định (giữ $>90%$ hoạt tính sau 2 giờ ở $40^\circ\text{C}$) và bền trong dải pH rộng từ $6,0–9,0$. Hoạt tính rGEL được kích hoạt mạnh mẽ bởi ion $\text{Ca}^{2+}$ và $\text{Zn}^{2+}$, nhưng bị ức chế hoàn toàn bởi chất tạo phức chelator kim loại EDTA ($10\text{ mM}$ làm mất $>95%$ hoạt tính) và các chất khử mạnh như DTT, $\beta$-mercaptoethanol, khẳng định bản chất metalloprotease phụ thuộc kẽm. Đồ thị Lineweaver–Burk xác định enzyme có ái lực cơ chất gelatin rất cao.
4. Hiệu quả thủy phân triệt để gelatin da cá Tra thành bột axit amin: Quá trình thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL ở điều kiện tỷ lệ enzyme/cơ chất ($\text{E/S}$) thích hợp, nhiệt độ $45^\circ\text{C}$, thời gian 4–6 giờ đạt hiệu suất phân cắt cao mà không cần bổ sung acid/kiềm độc hại. Dịch thủy phân sấy khô chứa hàm lượng toàn phần cân đối các axit amin thiết yếu và không thiết yếu, đặc biệt chiếm tỷ lệ áp đảo là Glycine, Alanine, Proline, Hydroxyproline, Glutamic acid và Arginine, không xuất hiện các sản phẩm phân hủy biến tính.
5. Cải thiện vượt bậc hiệu quả nuôi ương cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus): Khảo nghiệm in vivo trên cá Mú giống chỉ ra việc bổ sung chế phẩm axit amin thủy phân từ gelatin da cá Tra vào thức ăn công nghiệp tạo ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$):
   • Tốc độ tăng trưởng khối lượng ($\text{ADG}_W$) và chiều dài ($\text{ADG}_L$) tăng từ 18,5% đến 27,3% so với lô đối chứng không bổ sung.
   • Hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) giảm đáng kể từ mức $1,65–1,72$ xuống $1,28–1,35$.
   • Tỷ lệ sống của cá Mú giống đạt trên 88–92% (cao hơn lô đối chứng 15,4%), đồng thời giảm rõ rệt hệ số biến động kích cỡ cá ($CV%$), hạn chế tối đa hiện tượng ăn lẫn nhau (cannibalism) vốn là nguyên nhân chính gây tổn thất trong ương cá Mú giống.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Bổ sung dẫn liệu khoa học mới vào cơ sở dữ liệu GenBank về nguồn gen gelE của vi khuẩn bản địa Việt Nam; làm sáng tỏ cơ chế tự hoạt hóa nội tại của protease họ M4 khi biểu hiện ngoại lai trong tế bào E. coli.
• Về mặt phương pháp luận: Cung cấp quy trình công nghệ khép kín từ thiết kế dòng tế bào tái tổ hợp, công nghệ lên men mật độ cao, tinh sạch enzyme đến quy trình thủy phân sinh học cơ chất collagen/gelatin không ô nhiễm.
• Về mặt thực tiễn: Giải quyết tận gốc vấn đề ô nhiễm môi trường do phụ phẩm chế biến cá Tra tại Đồng bằng sông Cửu Long, biến phụ phẩm giá trị thấp (da cá) thành sản phẩm thương mại giá trị cao (axit amin/peptide hoạt tính sinh học).
• Về mặt chính sách và kinh tế: Đóng góp trực tiếp vào chiến lược phát triển kinh tế tuần hoàn (Circular Bioeconomy) trong ngành thủy sản Việt Nam, giảm áp lực phụ thuộc vào nguồn bột cá và chế phẩm axit amin nhập khẩu đắt tiền.

Limitations và Future Research

Nghiên cứu thẳng thắn thừa nhận một số giới hạn khoa học:

1. Quy mô thực nghiệm: Quá trình lên men biểu hiện rGEL và thủy phân da cá mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot nhỏ (bình tam giác và thiết bị lên men $5–10\text{ lít}$), chưa khảo sát trên hệ thống bioreactor công nghiệp quy mô hàng nghìn lít.
2. Cơ chế peptide hoạt tính: Luận án tập trung đánh giá hàm lượng tổng số các axit amin tự do và tốc độ tăng trưởng của cá Mú, chưa tiến hành phân đoạn chi tiết khối lượng phân tử peptide ($<1\text{ kDa}$, $1–3\text{ kDa}$, $3–5\text{ kDa}$) để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn hoặc điều hòa miễn dịch chuyên biệt.
3. Thời gian khảo nghiệm sinh học: Thí nghiệm trên cá Mú chấm đen mới tập trung vào giai đoạn cá giống (ương nuôi $7\text{ cm}$), chưa theo dõi suốt chu kỳ nuôi thương phẩm kéo dài đến kích cỡ thương phẩm xuất bán.

Chương trình nghiên cứu tiếp theo (Future Research Agenda):

• Tối ưu hóa điều kiện lên men rGEL ở quy mô công nghiệp (Fed-batch fermentation) sử dụng môi trường rỉ mật hoặc phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ nhằm hạ giá thành sản xuất enzyme.
• Nghiên cứu cố định enzyme (Enzyme Immobilization) rGEL trên các chất mang polymer sinh học (chitosan, alginate, hạt nano từ tính) để tái sử dụng enzyme nhiều chu kỳ trong các phản ứng thủy phân liên tục.
• Khảo sát mở rộng hoạt tính của peptide da cá Tra thủy phân trên các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao khác như tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), tôm sú (Penaeus monodon), cá Chẽm (Lates calcarifer).
• Đánh giá khả năng ứng dụng rGEL trong công nghiệp dược mỹ phẩm (sản xuất collagen thủy phân chống lão hóa da) và y học tái tạo mô.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các hướng nghiên cứu công nghệ sinh học enzyme và kỹ thuật di truyền vi sinh vật tại Việt Nam; tạo tiền đề cho các công bố quốc tế thuộc danh mục ISI/Scopus về sinh tổng hợp protease tái tổ hợp.
• Chuyển đổi công nghiệp: Định hình chuỗi giá trị gia tăng khép kín cho các tập đoàn chế biến thủy sản lớn (như Vĩnh Hoàn, Nam Việt, Minh Phú), chuyển đổi mô hình từ xả thải sang tinh chế sinh học (Biorefinery).
• Lợi ích xã hội và môi trường: Giảm phát thải hàng chục nghìn tấn chất thải hữu cơ mỗi năm vào lưu vực sông Tiền và sông Hậu, giảm thiểu mùi hôi và nguy cơ ô nhiễm nguồn nước mặt; hỗ trợ phát triển nghề nuôi biển bền vững thông qua việc nâng cao chất lượng con giống cá Mú.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Giới học thuật: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chuẩn hóa về dòng hóa gen, biểu hiện plasmid pET và các kỹ thuật phân tích hóa sinh enzyme chuẩn mực.
• Doanh nghiệp chế biến thủy sản & Thức ăn chăn nuôi: Nhận chuyển giao quy trình công nghệ thủy phân phụ phẩm bằng enzyme an toàn, tối ưu hóa chi phí sản xuất thức ăn thủy sản cao cấp.
• Cơ sở sản xuất giống thủy sản: Ứng dụng giải pháp dinh dưỡng axit amin tự nhiên giúp tăng tỷ lệ sống cá giống từ $70%$ lên $>88%$, gia tăng lợi nhuận kinh tế trực tiếp trên mỗi mẻ ương.
• Cơ quan quản lý nhà nước (Bộ Nông nghiệp & PTNT, Bộ KH&CN): Có thêm căn cứ khoa học xác đáng để xây dựng các tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia về tái chế phụ phẩm thủy sản và chính sách nông nghiệp xanh.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của công trình là gì? Công trình đã mở rộng lý thuyết về cơ chế tự thành thục của metalloendopeptidase họ M4 khi chứng minh rằng chuỗi polypeptide tiền chất GelE từ vi khuẩn Gram dương E. faecalis có thể hoàn tất quá trình cắt bỏ chính xác 14 axit amin đầu tận cùng C ($\text{IQVNQPSESVLVNE}$) và vùng propeptide đầu N để tạo enzyme $33–34\text{ kDa}$ có hoạt tính hoàn chỉnh trong tế bào chất của vật chủ Gram âm E. coli BL21(DE3) mà không cần sự trợ giúp của hệ thống protease đặc hiệu bản địa (sprE) hay con đường liên lạc mật độ tế bào fsr.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây? So với các nghiên cứu của Odunuga et al. (2015) trên lasB hay Chuang et al. (1997) trên empV, công trình đã tối ưu hóa thành công việc gắn gen gelE không mang peptide tín hiệu tự nhiên vào vector $\text{pET-22b(+)}$, sử dụng promoter T7 cực mạnh kết hợp việc kiểm soát nhiệt độ cảm ứng IPTG tại $34^\circ\text{C}$, giúp hạn chế tối đa sự hình thành thể vùi (inclusion bodies), nâng hoạt tính riêng của enzyme sau tinh sạch lên $38,14\text{ U/mg}$, cao hơn nhiều lần so với các công bố tương đương.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong quá trình thực nghiệm là gì? Enzyme rGEL thể hiện tính ổn định nhiệt và tính bền pH vượt trội trong môi trường kiềm yếu ($\text{pH } 7,5–8,0$) ngay cả khi không có sự bổ sung liên tục của ion kẽm ngoại sinh trong đệm phản ứng, miễn là có sự hiện diện của vi lượng ion $\text{Ca}^{2+}$ đóng vai trò làm cầu nối bền hóa liên kết không gian.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (Replication Protocol) hoàn chỉnh không? Luận án trình bày chi tiết tuyệt đối tất cả các thông số tái lập: nồng độ mồi PCR, chu trình nhiệt luân chuyển, nồng độ gel agarose/polyacrylamide, thành phần môi trường nuôi cấy LB, nồng độ IPTG cảm ứng ($0,5\text{ mM}$), đệm ly giải tế bào, quy trình sắc ký Ni-NTA và tỷ lệ phối trộn cơ chất/nước trong phản ứng thủy phân da cá Tra.

5. Định hướng chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo? Xây dựng nền tảng công nghệ sinh học tổng hợp (Synthetic Biology) nhằm tái thiết kế protein (Protein Engineering) enzyme rGEL để tăng cường khả năng chịu nhiệt độ cao ($>60^\circ\text{C}$) và phát triển nhà máy sinh học tế bào (Cell Factory) sản xuất liên tục peptide collagen biển phục vụ ngành y sinh.

Kết luận

1. Phân lập và giải mã thành công trình tự gen gelE ($1.530\text{ bp}$) mã hóa enzyme gelatinase họ M4 từ chủng vi khuẩn bản địa Enterococcus faecalis MD4 tại Việt Nam.
2. Thiết kế thành công chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)[$\text{pET-22b(+)-gelE}$] có khả năng sinh tổng hợp enzyme gelatinase tái tổ hợp (rGEL) hòa tan với hoạt tính riêng đạt $38,14\text{ U/mg}$.
3. Xác định toàn diện các đặc tính động học và hóa lý của rGEL: nhiệt độ tối ưu $40–45^\circ\text{C}$, pH tối ưu $7,5–8,0$, được hoạt hóa bởi $\text{Ca}^{2+}$, $\text{Zn}^{2+}$ và ức chế hoàn toàn bởi EDTA.
4. Xây dựng quy trình thủy phân sinh học gelatin da cá Tra bằng rGEL an toàn, hiệu quả, tạo ra chế phẩm giàu peptide và axit amin thiết yếu (Glycine, Proline, Hydroxyproline, Alanine) mà không gây biến tính hay ô nhiễm môi trường.
5. Ứng dụng thành công chế phẩm axit amin vào khẩu phần ăn của cá Mú chấm đen giống (Epinephelus malabaricus), giúp tăng trưởng khối lượng/chiều dài thêm 18,5–27,3%, giảm hệ số FCR xuống 1,28 và nâng tỷ lệ sống lên $>88%$.
6. Mở ra ba hướng nghiên cứu chuyên sâu mới: công nghệ bất động hóa metalloprotease tái tổ hợp, sản xuất peptide hoạt tính sinh học phân tử thấp phục vụ dược liệu, và phát triển mô hình kinh tế sinh học tuần hoàn trong chuỗi giá trị cá Tra Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cấu trúc và tính chất gelatin Gelatin là hỗn hợp không đồng nhất các protein hòa tan trong nước có trọng lượng phân tử cao (Budavari, 1996). Theo Karim và cộng sự (2009) gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ yếu của da, xương và mô liên kết động vật.

Với trọng lượng khô cơ bản, gelatin bao gồm từ 98 đến 99% protein. Trọng lượng phân tử của gelatin lớn, dao động từ 20. Trong các dung dịch nước, gelatin là hỗn hợp các chuỗi polypeptit khác biệt bao gồm các thành phần α, x (dimers của α-chain) và γ (trimers α-chain) có khối lượng khoảng 90, 180 và 300 x 103 g/mol tương ứng (Rbii và cộng sự, 2011). Giống như collagen, gelatin có cấu trúc dạng chuỗi gồm những phân tử có kích thước nhỏ liên kết với nhau bằng liên kết hydro tạo thành mạng lưới.

Trong đó, mỗi phân tử gelatin là các chuỗi axít amin được liên kết bằng liên kết peptit. Trình tự axít amin của gelatin chủ yếu là Gly-Pro-Hyp (Poppe, 1997). Hàm lượng axít amin của gelatin tương đối cao: glycine (Gly) 26-34%; Proline (Pro) 10-18%; và hydroxy proline (Hyp) 7-15% (Veis, 1964, Poppe, 1997). Các axít amin quan trọng khác bao gồm: Alanin (Ala) 8-11%; Arginine (Arg) 8-9%; axít aspartic (Asp) 6-7%; và glutamic(Glu)10-12% (Hudson, 1994, Poppe, 1997).

Gelatin không chứa Tryptophan và chứa ít Isoleucin, Threonin và Methionin (Potter và Hotchkiss, 1998). Các tính chất quan trọng nhất của gelatin có thể được chia thành ba nhóm: i) đặc tính liên quan đến hoạt động của chất gel, ví dụ: sự hình thành gel, tăng cường kết cấu và tăng cường khả năng phụ thuộc nước, ii) Các tính chất hydrat hóa cơ bản như sưng và tan iii) các tính chất liên quan đến hoạt động bề mặt của chúng, bao gồm nhũ tương, tạo thành bọt, tính ổn định, sự bám dính, sự gắn kết, chức năng keo và khả năng tạo màng. Gelatin có nguồn gốc từ da cá Gelatin được sản xuất nhiều nhất từ da lợn (46%), da trâu, bò (29,4%), thịt lợn và xương gia súc (23,1%). Gelatin cá chiếm dưới 1,5% tổng sản lượng gelatin trong năm 2007, tỷ lệ này tăng gấp đôi vào năm 2002, cho thấy xu hướng sản xuất gelatin từ các động vật không phải là động vật có vú ngày càng gia tăng.

Gelatin từ cá loại bỏ nguy cơ lây nhiễm bệnh bò điên và có thể sử dụng cho các cộng đồng không sử dụng các sản phẩm tư gia súc như lợn, bò (Gómez-Guillén và cộng sự, 2011; Ahmad & Benjakul, 2011 ). Gelatin có nguồn gốc từ cá có thể được chiết xuất từ da và xương của cá. Phụ phẩm và chất thải trong quá trình chế biến thủy sản chiếm đến 75% tổng khối lượng nguyên liệu sản xuất gelatin từ cá (Shahidi, 1995). Khoảng 30% chất thải của da và xương có hàm lượng collagen cao có thể được sử dụng để sản xuất gelatin (Gómez-Guillén và cộng sự, 2002).

Việc chiết xuất gelatin từ da cá có thể cung cấp sản phẩm thay thế phục vụ cộng đồng Hồi giáo và nâng cao giá trị ngành sản xuất cá tuyết (Gudmundsson và Hafsteinsson, 1997;Montero và cộng sự, 1999), cá megrim (Montero và Gómez-Guillén., 2000) và cá rô phi (Grossman và Bergman., 1992; Jamilah và Harvinder. Năng suất và chất lượng gelatin bị ảnh hưởng không chỉ bởi các loài hoặc mô cá mà còn vào độ pH, nhiệt độ và thời gian trong quá trình tiền xử lý và chiết xuất (Montero và Gómez-Guillén, 2000). Da cá là sản phẩm phụ chủ yếu của ngành công nghiệp chế biến cá, gây lãng phí, ô nhiễm môi trường và có thể cung cấp một nguồn gelatin có giá trị (Badii và Howell, 2006). Da cá chứa một lượng lớn collagen.

Nagai và Suzuki (2000) công bố rằng hàm lượng collagen trong phụ phẩm da cá của cá Vược Nhật Bản, cá chẻ và cá mập lần lượt là 51,4%, 49,8% và 50,1% (khối lượng khô). Năm 2002, Gómez-Guillén và cộng sự đã công bố rằng 30% chất thải của cá ở dạng xương và da có collagen cao. Từ những năm 1960, gelatin đã được sản xuất quy mô công nghiệp sử dụng axit làm tác nhân thủy phân (Norland, 1990). Năm 1992, quy trình sản 7 xuất gelatin từ cá và đặc tính gelatin thu được đã được mô tả bởi Grossman và Bergman (1992).

Kể từ đó, gelatin cá được chiết xuất từ da và xương của nhiều cá nước lạnh khác nhau như cá tuyết,cá hồi và các loài cá nước ấm như cá ngừ, cá da trơn, cá rô phi, cá Nile, cá mập và cá biển. Gelatin được sản xuất qua ba giai đoạn: tiền xử lý nguyên liệu thô, chiết xuất gelatin và làm sạch kết hợp làm khô. Tùy thuộc vào phương pháp mà collagen được xử lý trước, hai loại gelatin có thể được sản xuất. Chất gelatin loại A (điểm đẳng điện áp ở pH 6÷9) được sản xuất từ collagen được xử lý bằng axít và gelatin loại B (điểm đẳng điện khoảng pH 5) được sản xuất từ collagen bằng phương pháp xử lý kiềm (Stainsby, 1987).

Xử lý axít là thích hợp nhất cho collagen được tìm thấy trong da lợn hoặc cá, xử lý kiềm phù hợp cho các collagen phức tạp hơn được tìm thấy trong da bò. Gelatin từ da cá đã được chiết xuất bằng một số cách khác nhau. Thông thường, da cá được xử lý trong điều kiện axit yếu trước khi chuyển qua công đoạn tạo gelatin. Gómez-Guillén và Montero (2001) đã công bố quy trình sản xuất gelatin từ da cá bao gồm các công đoạn: tiền xử lý colagen trong dung dịch axit yếu, tiếp đó trích xuất trong nước ở nhiệt độ vừa phải (45 oC) và xử lý nhiệt ở nhiệt độ trên 40oC, toàn bộ quá trình mất khoảng 24 giờ.

Theo Yang và cộng sự (2007) gelatin được tạo thành từ cá da trơn bằng cách tiền xử lý da bằng dung dịch kiềm NaOH, tiếp theo là dung dịch axít acetic, sau đó 30g da được rửa sạch, xử lý với NaOH theo tỷ lệ 1: 6 ( w/v) cho thời gian biến đổi và rửa bằng nước máy lặp lại hai lần trước khi mẫu được xử lý bằng axit acetic (1: 6 w/v). Loại bỏ nước và rửa mẫu bằng nước máy theo tỉ lệ (1: 6 w/v), bước này lặp lại ba lần. Sau các bước xử lý trên, bổ sung nước không chứa ion vào mẫu và bảo quản ở 4°C. Năm 2008, quy trình tách chiết da cá da trơn được hai nhóm nghiên cứu cùng đưa ra.

Theo quy trình đó, da cá da trơn được ngâm trong dung dịch 50- mmol /L axít acetic theo tỉ lệ 1:8 v/w ở 15 oC trong 18 giờ. Da được tiếp tục xử lý rửa bằng nước cất cho đến khi độ pH đạt 3,5÷4,0. Quá trình tách chiết 8 có sự tham gia của pepsin. Sự tách chiết gelatin được thực hiện trong nước cất ở 45oC trong 7 giờ (Nalinanon và cộng sự, 2008; Liu và cộng sự, 2008).

Theo Sanaei Ardekani và cộng sự (2013) đã công bố điều kiện tối ưu cho chiết xuất gelatin từ da cá da trơn thu được bằng cách sử dụng 0,13 mol/L NaOH và 0,09 mol/L axit axetic xử lý trong thời gian 1 giờ và tiếp theo là chiết xuất nước nóng ở 64,92°C trong 3 giờ. Và nhóm nghiên cứu này cũng công bố rằng gelatin da cá da trơn khi được thủy phân với 6 mol/L HCl ở 110ºC trong 16 giờ. Sau đó, dịch thủy phân được hòa tan trong nước khử ion và được lọc. Thành phần axit amin đã được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC).

Kết quả thành phần axit amin của gelatin da cá da trơn (Clarias gariepinus) được trình bày ở bảng 1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias gariepinus) (Sanaei Ardekani và cộng sự, 2013) Axit amin Số dư lượng/1000 Alanine 86 Arginine 78 Aspartic acid 50 Cystine 0 Glutamic acid 85 Glycine 250 Histidine 11 Hydroxyproline 58 Isoleucine 13 Leucine 22 Lysine 33 Methionine 92 Phenylalanine 16 9 Proline 115 Serine 38 Threonine 25 Tryrosine 6 Valine 22 Total 1000 Hydroxyproline + Proline 173 (Imino axit Thành phần axit amin trong gelatin của da cá da trơn (Bảng 1.1) cho thấy chủ yếu là glycine, chiếm 250 dư lượng /1000 dư lượng, sau đó là proline (115 dư lượng/1000), methionine (92 dư lượng/100), alanine (86 dư lượng/1000). Và axit imino (hydroxyprolinevà proline) của gelatin da cá da trơn chiếm 173 dư lượng trên 1000 dư lượng. Theo Kim và cộng sự (2000), khi thủy phân protein cá với các enzym thích hợp như alcalase, pronase, collagenase, pepsin, papain, protamex, bromelain, chymotrypsin và trypsin thu được các peptit hoạt tính sinh học và các axít amin.

Ưu điểm chính của enzym thủy phân protein là nó cho phép định lượng aspargine và glutamine và các thành phần có số lượng ít, thường bị phá hủy khi thủy phân protein bằng axít và kiềm. Theo Wachirattanapongmettee và cộng sự (2009) protein cá da trơn sẽ bị thủy phân hoàn toàn tạo thành các axit amin khi được trộn với với nước cất theo tỉ lệ 1: 1,5 (w / v) và bổ sung enzym protex 0,5; 1,5 hoặc 3% v/w trong thời gian 60, 120 và 180 phút. Năm 2011, Alemán và cộng sự đã thử nghiệm thủy phân gelatin từ cá ngừ, cá bơn và mực để sản xuất chất chống oxy hóa. Gelatin 2,5% được hòa tan trong dung dịch đệm phosphate (0,01 M; pH 8) và bổ sung alcalase vào với tỷ lệ enzym/cơ chất gelatin là 1:20 và thủy phân ở 50 oC trong 3 giờ.

Gelatin từ mực và cá ngừ được thủy phân bằng enzym trypsin ở 37oC và trong dung dịch nước pH 7,5 và pepsin ở 37 oC và trong dung dịch 10 nước pH 4. Sau khi thủy phân các enzym bị bất hoạt bằng cách gia nhiệt ở 90oC trong 10 phút. Quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase cho hiệu suất thủy phân cao nhất khi nồng độ cơ chất là 200 g/L, tỷ lệ E/S là 39,45 U/g protein, nhiệt độ thuỷ phân là 50oC, tại pH 7,0 và thuỷ phân trong thời gian là 3 giờ. Mức độ thuỷ phân tại điều kiện trên đạt 11,02%.

Khi thuỷ phân collagen bằng neutrase kết hợp với sóng siêu âm, với thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút, cường độ sóng siêu âm 150W/ 20ml mẫu, cho hiệu suất thủy phân là 14,92%. Sản phẩm thuỷ phân bằng enzym kết hợp sóng siêu âm có phân tử lượng thấp hơn so với khi thuỷ phân bằng enzym. Hiệu suất thủy phân neutrase thu được có phân đoạn 19 ÷ 31 kDa, còn khi kết hợp neutrase và sóng siêu âm thì thu được phân đoạn 8,5 ÷12 kDa và 12 – 18kDa. Theo nghiên cứu của Karim và Bhat (2009), Go´mez-Guille´n và cộng sự (2002); Zhou và cộng sự (2006); Sarabia và cộng sự (2000); Eastoe và Leach (1977) đã công bố thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và bì lợn cho kết quả ở bảng 1.2 cho thấy các loại axít amin chính và hàm lượng của chúng ở da cá tương đương với các thành phần trong gelatin từ da lợn.