Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu tách chiết hoạt chất protodioscin từ cây bạch tật lê tribulus terrestris l luận văn ths

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tách chiết protodioscin từ cây bạch tật lê Tribulus terrestris, cung cấp kiến thức chuyên sâu về hoạt chất này.

• Tác giả: Vũ Quang Thắng
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Hương Sơn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu tách chiết hoạt chất protodioscin từ cây bạch tật lê (Tribulus terrestris L.)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris L. Đặc điểm hình thái, phân loại và phân bố
• 1.2. Thành phần hóa học và tác dụng dược lí của cây Bạch Tật Lê
• 1.3. Cấu trúc của Protodioscin
• 1.4. Tác dụng dược lí của Protodiscin
• 1.5. Các phương pháp tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật
• 1.5.1. Các phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật
• 1.5.2. Tách chiết Protodioscin
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch Tật Lê
• 2.3.2. Phương pháp lựa chọn phương pháp, nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch Tật Lê
• 2.3.3. Phương pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch Tật Lê
• 2.3.4. Phương pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin
• 2.3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn định lượng protodioscin
• 2.3.6. Phương pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột
• 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Lựa chọn dung môi và điều kiện chiết tổng Bạch Tật Lê
• 3.2. Lựa chọn phương pháp, nhiệt độ chiết tổng Bạch Tật Lê
• 3.3. Lựa chọn thời gian chiết tổng Bạch Tật Lê
• 3.4. Nghiên cứu chiết phân đoạn dịch chiết tổng Bạch Tật Lê
• 3.5. Nghiên cứu tách sắc ký làm giàu Protodioscin
• 3.6. Xây dựng quy trình tách chiết Protodioscin quy mô phòng thí nghiệm
• 3.7. Nghiên cứu sự thay đổi hormon sinh dục của chuột khi sử dụng dịch chiết chứa Protodioscin từ Bạch Tật Lê
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tách chiết protodioscin từ cây bạch tật lê

Cây bạch tật lê (Tribulus terrestris) đã được biết đến từ lâu với nhiều tác dụng dược lý, đặc biệt là khả năng tăng cường sinh lực và cải thiện chức năng tình dục. Nghiên cứu tách chiết hoạt chất protodioscin từ cây này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong y học hiện đại. Protodioscin, một saponin quan trọng, đã được chứng minh có tác dụng tích cực trong việc cải thiện nồng độ hormone sinh dục và tăng cường sức khỏe sinh sản. Việc tách chiết hiệu quả protodioscin từ bạch tật lê là một thách thức lớn trong nghiên cứu dược liệu.

1.1. Ảnh hưởng của protodioscin đến sức khỏe sinh sản

Nghiên cứu cho thấy protodioscin có khả năng làm tăng nồng độ testosterone tự do trong máu, từ đó cải thiện khả năng sinh sản ở nam giới. Các thí nghiệm trên động vật cho thấy sự gia tăng số lượng và khả năng di động của tinh trùng sau khi sử dụng dịch chiết chứa protodioscin.

1.2. Tầm quan trọng của cây bạch tật lê trong y học cổ truyền

Cây bạch tật lê đã được sử dụng trong y học cổ truyền của nhiều nền văn hóa, từ Trung Quốc đến Ấn Độ, với nhiều ứng dụng khác nhau. Các thành phần hóa học của cây này, đặc biệt là saponin, đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng tích cực trong việc điều trị các rối loạn sinh dục.

II. Thách thức trong việc tách chiết protodioscin từ bạch tật lê

Việc tách chiết protodioscin từ cây bạch tật lê gặp nhiều thách thức do sự đa dạng về thành phần hóa học và cấu trúc của cây. Các phương pháp tách chiết truyền thống thường không đạt hiệu quả cao, trong khi các phương pháp hiện đại đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật phức tạp. Nghiên cứu cần tìm ra phương pháp tối ưu để tăng hiệu suất tách chiết mà vẫn đảm bảo chất lượng của sản phẩm.

2.1. Các phương pháp tách chiết truyền thống và hiện đại

Các phương pháp tách chiết truyền thống như ngâm, đun sôi thường cho hiệu suất thấp và không thể tách chiết hoàn toàn các hợp chất có hoạt tính sinh học. Ngược lại, các phương pháp hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và siêu âm có thể cải thiện đáng kể hiệu suất tách chiết.

2.2. Khó khăn trong việc lựa chọn dung môi tách chiết

Lựa chọn dung môi tách chiết là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của protodioscin. Các dung môi khác nhau có khả năng hòa tan các hợp chất khác nhau, do đó cần phải nghiên cứu kỹ lưỡng để tìm ra dung môi tối ưu cho quá trình tách chiết.

III. Phương pháp tách chiết protodioscin hiệu quả từ bạch tật lê

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng phương pháp tách chiết bằng siêu âm kết hợp với dung môi ethanol có thể tối ưu hóa quá trình tách chiết protodioscin. Phương pháp này không chỉ giúp tăng hiệu suất tách chiết mà còn bảo toàn các hoạt chất sinh học có trong cây. Các yếu tố như nhiệt độ, thời gian chiết cũng cần được điều chỉnh để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Quy trình tách chiết protodioscin bằng siêu âm

Quy trình tách chiết bằng siêu âm bao gồm các bước như chuẩn bị mẫu, lựa chọn dung môi, và điều chỉnh các thông số như nhiệt độ và thời gian. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết và tăng hiệu suất tách chiết lên đáng kể.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất

Điều kiện chiết xuất như nhiệt độ và thời gian có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách chiết. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiệt độ khoảng 50-60 độ C và thời gian chiết từ 30-60 phút là tối ưu cho việc tách chiết protodioscin từ bạch tật lê.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protodioscin trong y học

Protodioscin không chỉ được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Các sản phẩm bổ sung chứa protodioscin đã được phát triển và được sử dụng rộng rãi để cải thiện sức khỏe sinh sản và tăng cường sinh lực. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng protodioscin có thể hỗ trợ điều trị một số rối loạn sinh dục và cải thiện chất lượng cuộc sống cho nam giới.

4.1. Sản phẩm bổ sung chứa protodioscin

Nhiều sản phẩm bổ sung dinh dưỡng chứa protodioscin đã được phát triển và đưa ra thị trường. Các sản phẩm này thường được quảng cáo với khả năng tăng cường sinh lực và cải thiện chức năng tình dục, thu hút sự quan tâm của người tiêu dùng.

4.2. Nghiên cứu lâm sàng về tác dụng của protodioscin

Nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng protodioscin có tác dụng tích cực trong việc cải thiện nồng độ hormone sinh dục và tăng cường khả năng sinh sản. Các thử nghiệm trên người cho thấy sự gia tăng đáng kể về số lượng và chất lượng tinh trùng sau khi sử dụng sản phẩm chứa protodioscin.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu tách chiết protodioscin

Nghiên cứu tách chiết protodioscin từ cây bạch tật lê đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các sản phẩm dược liệu an toàn và hiệu quả. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức cần được giải quyết, bao gồm việc tối ưu hóa quy trình tách chiết và nghiên cứu sâu hơn về tác dụng của protodioscin. Triển vọng trong tương lai là phát triển các sản phẩm từ bạch tật lê có thể đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tách chiết

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp tách chiết mới, hiệu quả hơn, đồng thời nghiên cứu sâu hơn về các tác dụng sinh học của protodioscin. Việc kết hợp các công nghệ hiện đại trong tách chiết có thể mang lại những kết quả khả quan.

5.2. Tương lai của sản phẩm từ bạch tật lê

Với nhu cầu ngày càng tăng về các sản phẩm tự nhiên và an toàn, bạch tật lê và protodioscin có tiềm năng lớn trong ngành dược phẩm. Các sản phẩm từ bạch tật lê có thể trở thành lựa chọn hàng đầu cho những ai tìm kiếm giải pháp cải thiện sức khỏe sinh sản.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Rối loạn chức năng sinh lý và suy giảm nồng độ nội tiết tố nam đang là vấn đề y tế phổ biến trên toàn cầu, ảnh hưởng đến khoảng 15% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản theo các báo cáo y học hiện đại. Trước nhu cầu ngày càng tăng về các hoạt chất sinh học tự nhiên có độ an toàn cao, cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris L.) nổi lên như một nguồn dược liệu quý chứa hàm lượng saponin steroid dồi dào, tiêu biểu là protodioscin. Đề tài tập trung giải quyết vấn đề tối ưu hóa quy trình trích ly và tinh sạch protodioscin – một hợp chất phân cực cao vốn dễ bị lẫn tạp chất trong quá trình tách chiết truyền thống.

Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu bao gồm: xác định hệ dung môi và điều kiện chiết xuất thích hợp nhất; xây dựng quy trình phân đoạn và làm giàu protodioscin bằng sắc ký cột; đồng thời đánh giá bước đầu tác động sinh học của dịch chiết lên hệ hormone sinh dục trên mô hình động vật thực nghiệm. Nghiên cứu được thực hiện vào năm 2018 tại Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cùng Viện Ứng dụng Công nghệ thuộc Bộ Khoa học và Công nghệ.

Ý nghĩa của luận văn được thể hiện qua các chỉ số định lượng cụ thể: xử lý thành công 2,0 kg nguyên liệu khô đạt chuẩn VietGAP, nâng cao hiệu suất chiết tổng đạt 10,5% và tinh sạch được phân đoạn cao chiết có hàm lượng protodioscin đạt 40,6%. Kết quả này tạo tiền đề khoa học vững chắc để phát triển các dòng sản phẩm dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe chuẩn hóa nguồn gốc thiên nhiên tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết chiết tách các hợp chất thiên nhiên dựa trên nguyên lý khuếch tán và độ phân cực phân tử theo định luật Fick, kết hợp mô hình hấp phụ - giải hấp trên pha tĩnh rắn. Bên cạnh đó, khung lý thuyết dược lý nội tiết về trục Hạ đồi - Tuyến yên - Tuyến sinh dục (trục HPG) được áp dụng để giải thích cơ chế tác động sinh học của saponin steroid thực vật đối với quá trình sinh tinh và sinh tổng hợp nội tiết tố.

Các khái niệm chuyên ngành cốt lõi bao gồm:

• Protodioscin: Furostanol saponin steroid có công thức hóa học $C_{51}H_{84}O_{22}$, đóng vai trò kích hoạt thụ thể androgen và tiền chất chuyển hóa thành dehydroepiandrosterone (DHEA).
• Chiết đun hồi lưu (Reflux Extraction): Phương pháp trích ly hoạt chất liên tục ở nhiệt độ sôi của dung môi giúp tăng cường sự phá vỡ vách tế bào thực vật mà không làm phân hủy cấu trúc nhiệt phân.
• Sắc ký hấp phụ Diaion HP20 và Silica gel: Kỹ thuật tách pha rắn dựa trên sự tương tác vi mô giữa phân tử phân cực và các tâm hấp phụ trên nền chất mang.
• Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ELISA: Phương pháp phân tích định lượng hormone dựa trên phản ứng kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu cao.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dược liệu sử dụng là 2,0 kg cây Bạch tật lê (gồm thân, lá, quả) thu hái vào tháng 9 tại vùng trồng đạt chuẩn VietGAP ở tỉnh Ninh Thuận. Dược liệu được làm sạch, phơi khô trong bóng râm và nghiền nhỏ thành bột mịn đồng nhất trước khi tiến hành trích ly.

Quá trình phân tích định lượng sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 kết hợp đầu dò DAD ở bước sóng UV 210 nm, cột phân tích Zorbax Eclipse XDB C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}, 5\ \mu\text{m}$). Đường chuẩn định lượng protodioscin được thiết lập với hệ số tương quan tuyến tính đạt $R^2 = 0,99998$, đảm bảo độ tin cậy tuyệt đối trong việc định lượng hoạt chất. Phương pháp HPLC được lựa chọn do tính đặc hiệu cao, khả năng tách biệt hoàn toàn peak của protodioscin khỏi các dẫn xuất saponin đồng phân khác trong dịch chiết thực vật.

Thử nghiệm in vivo đánh giá hoạt tính sinh học sử dụng cỡ mẫu gồm 40 chuột nhắt trắng đực trưởng thành khỏe mạnh, được phân bố ngẫu nhiên vào 4 lô thí nghiệm (10 cá thể/lô). Nhóm I dùng làm đối chứng, các nhóm II, III, IV được cho uống dịch chiết giàu protodioscin với các mức liều lần lượt là 2,5 mg/kg, 5,0 mg/kg và 10,0 mg/kg thể trọng mỗi ngày một lần trong thời gian can thiệp kéo dài 4 tuần. Mẫu máu được thu thập sau 24 giờ kể từ liều cuối cùng để định lượng nồng độ Testosterone, LH và FSH trên máy xét nghiệm Cobas 6000 tại cơ sở y tế chuyên khoa. Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm STATA và Microsoft Excel với 3 lần lặp lại độc lập.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng trong việc tối ưu hóa quy trình trích ly và tinh sạch protodioscin:

• Dung môi chiết xuất tối ưu: Khảo sát 4 hệ dung môi (ethanol 50%, ethanol 95%, methanol, nước cất) cho thấy ethanol 50% đạt hiệu suất chiết tổng cao nhất là 10,5% (thu được 210,22 g cao A từ 2,0 kg nguyên liệu khô). Hiệu suất này cao hơn 9,7% so với ethanol 95% (thu 191,4 g; đạt 9,57%) và cao hơn 9,6% so với dung môi methanol độc hại (thu 191,7 g; đạt 9,58%). Chiết bằng nước cất cho hiệu suất 10,25% (205,0 g) nhưng dịch chiết có độ nhớt rất cao và khó thao tác lọc.
• Điều kiện nhiệt độ và thời gian: Phương pháp đun hồi lưu ở nhiệt độ 95°C trong 2 giờ cho hiệu suất vượt trội (10,5%), cao hơn 37,6% so với phương pháp ngâm cách thủy ở 80°C trong 2 giờ (chỉ đạt 7,63%) và cao hơn 18,6% so với ngâm chiết tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ (đạt 8,85%). Quá trình chiết lặp lại 3 chu kỳ là đủ để thu hồi 98,6% tổng lượng chất hòa tan.
• Làm giàu hoạt chất qua hệ thống sắc ký 2 giai đoạn: Dịch chiết sau khi loại tạp kém phân cực bằng ethyl acetate (dịch B) được đưa qua cột hấp phụ Diaion HP20, rửa giải bằng cồn 80% thu được 18,5 g cao C. Tiếp tục tinh chế cao C qua cột Silica gel pha thường với tỷ lệ chất hấp phụ/cao chiết là 5:1, rửa giải bằng hệ dung môi ethyl acetate:ethanol (10:1) thu được 1,4 g cao chiết tinh khiết D.
• Hàm lượng protodioscin và hiệu quả sinh học: Phân tích sắc ký HPLC xác nhận hàm lượng protodioscin trong cao D đạt mức 40,6%. Thử nghiệm trên mô hình động vật sau 4 tuần ghi nhận mức gia tăng nồng độ Testosterone và LH rõ rệt ở các lô chuột sử dụng dịch chiết liều 5,0 mg/kg và 10,0 mg/kg so với nhóm đối chứng không can thiệp.

Thảo luận kết quả

Khả năng hòa tan vượt trội của ethanol 50% được giải thích bởi sự tương đồng về độ phân cực giữa hỗn hợp dung môi nước - cồn với cấu trúc phân tử của protodioscin (vốn chứa nhiều gốc phân cực glycoside gắn trên khung steroid). Hỗn hợp ethanol 50% vừa có khả năng trương nở màng tế bào thực vật, vừa giảm độ nhớt của dịch chiết, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình giải phóng hoạt chất ra ngoài môi trường.

Các dữ liệu thực nghiệm được trực quan hóa qua biểu đồ phân bố hiệu suất chiết và sắc ký đồ HPLC với peak hấp thụ đặc trưng của protodioscin xuất hiện đơn lẻ, cân đối tại thời gian lưu xác định dưới bước sóng 210 nm. Kết quả này hoàn toàn tương thích và làm sáng tỏ thêm các công bố quốc tế của Ghosh và cộng sự (2012) khi chiết xuất saponin từ Bạch tật lê ở nhiệt độ 95°C. Đồng thời, việc ứng dụng thành công cột Diaion HP20 kết hợp cột Silica gel đã giải quyết triệt để vấn đề loại bỏ muối vô cơ và đường tự do, giúp nâng độ tinh khiết của hoạt chất lên hơn 4 lần so với cao chiết thô ban đầu.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện công nghệ và đưa kết quả nghiên cứu vào ứng dụng thực tiễn sản xuất dược phẩm, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

• Nâng quy mô thử nghiệm Pilot: Triển khai thiết kế hệ thống thiết bị chiết xuất hồi lưu và cô quay chân không quy mô bán công nghiệp (xử lý 50 - 100 kg nguyên liệu khô/mẻ) trong thời gian 6 đến 12 tháng tới do Viện Ứng dụng Công nghệ chủ trì.
• Mở rộng và chuẩn hóa vùng nguyên liệu VietGAP: Phối hợp cùng Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Ninh Thuận mở rộng diện tích canh tác Bạch tật lê lên 10 - 20 hecta, kiểm soát thời điểm thu hoạch vào tháng 9 để đảm bảo hàm lượng protodioscin trong lá và quả đạt trên 1,0% khối lượng khô.
• Phát triển dạng bào chế thương mại: Doanh nghiệp dược phẩm cần đầu tư nghiên cứu công thức bào chế viên nang cứng hoặc viên nén chứa 100 - 250 mg cao chiết chuẩn hóa (chứa 40% protodioscin), hoàn thành thử nghiệm độ ổn định trong vòng 18 tháng.
• Hoàn thiện hồ sơ độc tính và lâm sàng: Tiến hành thử nghiệm độc tính bán trường diễn và thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 trên người tình nguyện trong lộ trình 24 tháng nhằm đánh giá độ an toàn toàn diện theo quy định của Bộ Y tế.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu này cung cấp nguồn dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác và có giá trị tham khảo chuyên sâu cho các nhóm đối tượng:

• Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên ngành Dược học, Hóa thực vật: Nắm bắt phương pháp tối ưu hóa thông số trích ly hoạt chất saponin, kỹ thuật vận hành sắc ký cột hấp phụ và phương pháp kiểm định HPLC.
• Chuyên viên R&D tại các nhà máy dược phẩm và thực phẩm chức năng: Ứng dụng trực tiếp quy trình công nghệ 5 bước để sản xuất các dòng sản phẩm hỗ trợ tăng cường sinh lực nam giới từ nguồn dược liệu trong nước.
• Bác sĩ chuyên khoa Nam học và Y học cổ truyền: Tham khảo bằng chứng khoa học và cơ chế dược lý của protodioscin trong việc kích thích sản sinh testosterone tự nhiên, hỗ trợ điều trị vô sinh và suy giảm chức năng sinh sản.
• Kỹ sư nông nghiệp và các hợp tác xã dược liệu: Hiểu rõ chu kỳ tích lũy hoạt chất của cây Bạch tật lê để tối ưu hóa quy trình trồng trọt, thu hái và bảo quản theo tiêu chuẩn chất lượng.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao ethanol 50% lại là dung môi tối ưu nhất để tách chiết protodioscin từ Bạch tật lê?
Protodioscin là một saponin furostanol mang chuỗi đường glycoside phân cực cao. Hỗn hợp ethanol 50% tạo ra độ phân cực trung gian lý tưởng, vừa hòa tan chọn lọc hoạt chất, vừa giúp màng tế bào thực vật trương nở tốt hơn. Thực nghiệm chứng minh dung môi này đạt hiệu suất 10,5%, cao hơn ethanol 95% (9,57%) và hạn chế hiện tượng nhớt bọt so với chiết bằng nước cất 100%.

Hoạt chất protodioscin tác động lên hệ sinh dục nam qua những cơ chế nào?
Protodioscin kích thích tuyến yên bài tiết hormone LH, từ đó thúc đẩy tế bào Leydig tăng tổng hợp Testosterone và chuyển đổi thành Dihydrotestosterone (DHT). Đồng thời, hoạt chất này kích hoạt giải phóng Nitric Oxide (NO) tại các thể hang dương vật, hỗ trợ giãn mạch, tăng cường tưới máu và cải thiện số lượng cũng như khả năng vận động của tinh trùng.

Vai trò của cột sắc ký Diaion HP20 trong quy trình tinh sạch là gì?
Cột Diaion HP20 đóng vai trò là bước tiền tinh chế cực kỳ quan trọng. Chất hấp phụ này giữ lại các phân tử saponin steroid khi rửa giải bằng nước để loại bỏ hoàn toàn các tạp chất phân cực mạnh như muối khoáng vô cơ, acid hữu cơ và đường tự do. Sau đó, dung môi ethanol 80% được sử dụng để thu hồi phân đoạn giàu saponin (cao C) một cách hiệu quả.

Cần bao nhiêu chu kỳ chiết hồi lưu để thu hồi triệt để hoạt chất từ nguyên liệu?
Kết quả định lượng cho thấy sau 3 chu kỳ đun hồi lưu ở 95°C (lần 1: 139,1 g; lần 2: 55,8 g; lần 3: 12,4 g cao), lượng hoạt chất còn lại trong bã ở lần 4 chỉ chiếm 2,92 g (khoảng 1,4% tổng lượng chất tan). Do đó, quy trình 3 chu kỳ trích ly là phương án tối ưu nhất cả về hiệu suất thu hồi lẫn chi phí năng lượng.

Dịch chiết giàu 40,6% protodioscin có tiềm năng ứng dụng công nghiệp ra sao?
Quy trình công nghệ sử dụng các dung môi thân thiện môi trường như ethanol và nước, không sử dụng hóa chất độc hại như chloroform hay methanol. Với độ tinh khiết đạt 40,6%, cao chiết này hoàn toàn đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe để làm nguyên liệu đầu vào sản xuất các dạng thuốc viên nang, viên nén chất lượng cao tương đương các sản phẩm nhập khẩu.

Kết luận

• Luận văn đã xác định thành công điều kiện trích ly tối ưu cho cây Bạch tật lê: dung môi ethanol 50%, phương pháp đun hồi lưu 95°C trong 2 giờ, lặp lại 3 chu kỳ với hiệu suất đạt 10,5%.
• Xây dựng hoàn chỉnh quy trình 5 bước tinh sạch qua cột Diaion HP20 và Silica gel, thu được cao chiết D có hàm lượng protodioscin đạt 40,6% kiểm định bằng HPLC.
• Chứng minh hoạt tính sinh học in vivo của dịch chiết trong việc làm tăng nồng độ Testosterone và LH trên mô hình chuột nhắt trắng ở liều 5,0 - 10,0 mg/kg thể trọng.
• Đóng góp nguồn dữ liệu khoa học thực nghiệm có giá trị cao, mở ra hướng khai thác bền vững nguồn dược liệu Bạch tật lê đạt chuẩn VietGAP tại vùng Duyên hải Nam Trung Bộ.
• Bước đi tiếp theo trong 12 - 24 tháng tới là nâng cấp quy trình lên quy mô bán công nghiệp và tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng. Quý độc giả, nhà khoa học và doanh nghiệp quan tâm có thể khai thác toàn văn tài liệu để ứng dụng vào công tác nghiên cứu và chuyển giao công nghệ sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch tật lê (Tribulus terrestris) là một loại thảo dƣợc đƣợc trồng quanh năm ở khu vực Địa Trung Hải và các vùng có khí hậu ấm ở Châu Âu, Châu Á, Mỹ, Châu Phi và Australia. Từ lâu, loại cây này đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền của Trung Quốc, Ấn Độ, Iraq, Bulgari, Nam Phi và Iran. Bạch tật lê có rất nhiều thành phần có hoạt chất sinh học nhƣ steroid, saponin, flavonoid, alkaloid, các acid béo không bão hòa, vitamin, tannin, acid aspartic và acid glutamic. Trong đó saponin đƣợc coi là thành phần đặc trƣng nhất của cây đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ lâu để làm tăng khả năng sinh sản ở cả động vật thí nghiệm và ngƣời.

Cây Bạch tật lê đƣợc dùng điều trị cho bệnh nhân nam giới vô sinh bởi vì có tác dụng tăng số lƣợng tinh trùng và khả năng di động tinh trùng. Bên cạnh đó, Bạch tật lê còn làm cải thiện khả năng cƣơng cứng và các hành vi tình dục ở động vật thí nghiệm. Các tác dụng trên là do Bạch tật lê có chứa thành phần protodioscin saponin tăng các hormon sinh dục ảnh hƣởng lên hệ thống sinh sản. Protodioscin làm tăng hormon sinh dục testosterone tự do trong máu, dihydrotrestosterone (DHT), dehydroepiandrosterone (DHEA) dehydroepiandrosterone sulfat (DHEA- S), đồng thời cân bằng nồng độ estrogen, progesterone và pregnenolone.

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với các mục tiêu: Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất protodioscin từ cây Bạch tật lê nhằm tìm ra hoạt chất sinh học an toàn, hiệu quả trong điều trị tăng cƣờng sinh lực ở nam giới. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris L.

Đặc điểm hình thái, phân loại và phân bố. Phân loại Chi Tribulus thuộc họ Zygophyllaceae bao gồm khoảng 20 loài trên thế giới, trong đó có ba loài: Tribulus cistoides, Tribulus terrestris, và Tribulus alatus xuất hiện phổ biến ở Ấn Độ. Trong số đó, Bạch tật lê (T. terrestris) đƣợc sử dụng nhƣ một dƣợc liệu quý nhằm hỗ trợ và cải thiện sức khỏe con ngƣời.

Bạch tật lê là một loài cây bụi, đƣợc tìm thấy ở Địa Trung Hải, cận nhiệt đới và sa mạc vùng khí hậu trên toàn thế giới nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, các quốc gia Nam Mỹ, Mexico, Tây Ban Nha, và Bulgaria [16]. Phân loại Giới: Plantae Phân giới: Phanerogams Phân ngành: Angiospermae Lớp: Dicotyledonae Phân lớp: Polypetalae Dòng: Disciflorae Bộ: Giraniales Họ: Zygophyllaceae Chi: Tribulus Loài: terrestris Linn [16] 1. Đặc điểm hình thái, sinh thái và phân bố. Trên thế giới cây Bạch tật lê đƣợc mô tả với các đặc điểm nhƣ sau: Thân thấp nhỏ, cao 10-60 cm, tối màu.

Gốc hình trụ, dài 7-18 cm đƣờng kính 0,3-0,7 cm. Lá kép mọc đối từ 5 đến 8 cặp hình elip hoặc hình trụ tuy nhiên bất đối xứng. Hoa có màu vàng. Quả có nhiều hình dạng (tròn, dẹt, năm góc) và thƣờng đƣợc bao phủ một màu vàng nhạt, có nhiều hạt.

Rễ xơ, hình trụ, thƣờng phân nhánh, mang một số rễ nhỏ và có màu nâu nhạt (Hình 1. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Hình thái toàn cây và quả Bạch tật lê (Tribulus terrestris) [16] Tại Việt Nam cây Bạch tật lê đƣợc Bùi Đình Thạch và cộng sự (2011) mô tả với đặc điểm hình thái tƣơng tự: Cây thảo, mọc bò lan, phân nhánh nhiều, có lông trắng nằm. Lá kép lông chim, mọc đối hoặc gần đối, một to một nhỏ, gồm 5-7 đôi lá chét bằng nhau; phiến lá dài 5-16 mm, rộng đến 2,5 mm, phủ lông trắng ở mặt dƣới.

Hoa mọc riêng lẻ ở nách lá; lá đài 5; cánh hoa 5, nhỏ ngắn hơn 1 cm, mỏng, màu vàng, vành xanh, sớm rụng; nhị 10, có 5 dài, 5 ngắn; bầu 5 ô. Quả thƣờng có 5 cạnh có gai, có lông dày, tách thành 5 mảnh vỏ rất cứng, mỗi mảnh mang nhiều hạt. Mùa hoa tháng 5-7; mùa quả tháng 8-9 (Hình 1. Đặc điểm hình thái của cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris) [1] 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Sinh thái: Cây ƣa sáng, chịu đƣợc khô hạn, thƣờng mọc thành đám nhỏ trên các bãi cát ven biển.

Cây tái sinh bằng hạt vào mùa mƣa. Sinh trƣởng phát triển nhanh, bò lan trên mặt đất. Sau khi mùa hoa quả kết thúc, cây cũng tự tàn lụi vào đầu mùa khô. Quả tự mở khi chín để hạt thoát ra ngoài.

Hạt nằm lẫn trong cát suốt mùa khô vẫn còn khả năng nảy mầm tốt. Phân bố: Bạch tật lê phân bố rải rác ở khắp các vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và cả vùng ôn đới ấm của châu Âu. Ở Việt Nam, cây chỉ gặp ở vùng ven biển, từ Quảng Bình, Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Trà Vinh [1,2]. Thành phần hóa học và tác dụng dược lí của cây Bạch tật lê 1.

Thành phần hóa học của cây Bạch tật lê Nghiên cứu thành phần hóa học sơ bộ của Bạch tật lê cho thấy sự có mặt của saponin, flavonoid, glycosid, alkaloid và tanin [56]. Trong đó saponin và furostanol saponin đƣợc xem là thành phần chính bao gồm 58 loại saponin spicrostan và 50 loại saponin furostane (Hình 1. Các saponin steroid nhƣ protodioscin, prototribestin, rutin và dioscin đƣợc xem là các saponin có hoạt tính sinh học của Bạch tật lê (Hình 1. Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu trƣớc đây cho thấy thành phần saponin và hàm lƣợng saponin của cây Bạch tật lêtừ các vùng địa lý khác nhau là khác nhau [31].

Các hợp chất flavonoid của Bạch tật lêchủ yếu là các dẫn xuất của quercetin, kaempferol và isorhamnetin bao gồm: Quercetin (109), iso-quercitrin (110), rutin (111), quercetin-3-O-gent (112), quercetin-3-O-gentr (113), quercetin-3-0-rha-gent (114), quercetin-3-O-gent-7-O- glu (115) là favonoid với quercetin là cấu trúc gốc cơ bản. Isorhamnetin (116), isorhamnetin-3-O-glu (117), isor-hamnetin-3-O-gent (118), isorhamnetin-3-O-rutinoside (119), isorhamnetin-3-O-rutinoside (120), isorhamnetin-3,7-di-O-glu (121), isorhamnetin-3-O-p-coumarylglu (122), isorhamnetin-3-O-gent-7-O-glu (123), isorham-netin-3-O-gentr-7-O-glu (124) là favonoid với isorhamnetin là cấu trúc gốc cơ bản. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Kaempferol (125), kaempferol-3-O-glu (126), kaemp-ferol-3-O-gent (127), kaempferol-3-O-rutinoside (128), kaemp-ferol-3-O-gent kaempferol-3-O-gent-7-O- glu (129), tribuloside (130) là favonoid với kaempferol nhƣ cấu trúc gốc cơ bản (Hình 1.6) Alkaloid bao gồm: Tribulusamide C (131), tribulusterine (132), tribulusinA (133), harmine (134), harman (135), harmmol (136), tribulusimide C (137), terrestriamide (138), N-trans- coumaroyltyramine (139), N-trans-cafeoyltyramine (140), terrestribisamide (141) là những alkaloid chính đƣợc tách từ thân, lá và quả của Bạch tật lê. Các alkaloid của hạt chủ yếu thuộc nhóm β-carboline alkaloid và amide alkaloid (Hình 1.

Nghiên cứu của Kostova về tác dụng hóa học và hoạt tính sinh học của saponin chỉ ra rằng furostanol và saponin spirostanol của tigogenin, neotigogenin, gitogenin, neogitogenin, hecogenin, neohecogenin, diosgenin, chlorogenin, ruscogenin và sarsasapogenin thƣờng đƣợc phát hiện ở cây Bạch tật lê. Ngoài ra, bốn saponin sulfat của tigogenin và diosgenin cũng đƣợc phân lập, chủ yếu là các furostanol glycoside bao gồm: protodioscin và protogracillin, trong đó protodioscin là chất saponin chủ yếu nhất và chỉ có một lƣợng nhỏ các spirostanol glycoside [31,54]. Wu và cộng sự chỉ ra rằng trong cây Bạch tật lêhàm lƣợng flavonoid gấp 1,5 lần lƣợng saponin [5]. Bhutani và cộng sự đã phân lập đƣợc các hợp chất kaempferol, kaempferol-3-glucoside, kaempferol-3-rutinoside và tribuloside [kaempferol-3- β-D- (6 "-p-coumaroyl) glucoside] từ lá, quả cây Bạch tật lêvà xác định công thức của các hợp chất này bằng các phƣơng pháp phân tích quang phổ [14].

Louveaux và cộng sự đã phát hiện 18 flavonoid (các dẫn xuất của caffeoyl, các quercetin glycoside, bao gồm rutin và các kaempferol glycoside) bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong 4 phân đoạn dịch chiết xuất từ lá cây Bạch tật lê[10]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Matin Yekta đã tách chiết 3 flavonoid glycoside bao gồm: Quercetin 3-O- glycoside, quercetin 3-O-rutinoside và kaempferol 3-O-glycoside từ các bộ phận trên mặt đất của cây Bạch tật lê[38]. Raja và Venkataraman đã xác định đƣợc các hợp chất flavonoid từ phân đoạn dịch chiết ether và chloroform của quả Bạch tật lêtƣơi từ Ấn Độ sử dụng hệ dung môi ethyl acetate : benzen (1:9). Trong khi đó các flavonoid này không đƣợc phát hiện trong dịch chiết của các loài quả khác [38, 44].

Wu đã phân tách và định danh ba hợp chất mới, terrestribisamide, 25R- spirost-4-en-3, 12-dione và tribulusterine, cùng với 10 hợp chất đã biết bao gồm: N- p coumaroyltyramine, terrestriamide, hecogenin, aurantiamide acetate, xanthosine, este axit béo, ferulicaxit, vanillin, axit p-hydroxybenzoic, và β-sitosterol từ quả Bạch tật lê khô [53]. Các alkaloid trong dịch chiết bao gồm harmane và norharmane. β -carboline alkaloid, tribulusterine chiếm một hàm lƣợng nhỏ trong quả cây [15]. Sử dụng sắc ký khí kết hợp khối phổ phân tích dịch chiết metanol của toàn bộ cây Bạch tật lêcho thấy α-amyrin là thành phần chính và 7 hợp chất với hàm lƣợng nhỏ hơn là 3,7,11,15-tetrametyl-2-hexadecen-1-ol, axit n-hexadecadienoic, axit hexadecadienoic este ethyl, phytol, 9,12-octadecadienoicaxit, axit 9,12,15- octadecatrienoic và 1,2-benzenedicarboxylicaxit disoctyl este.

Ngoài ra, sterol (β- sitosterols và stigmasterol) cũng đƣợc phát hiện [15]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các loại khung carbon của saponin spiroston trong Bạch tật lê [56]. 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Các loại khung carbon của saponin furostane trong Bạch tật lê [56] Hình 1. Một số saponin chính có hoạt tính sinh học tách chiết từ Bạch tật lê [27]. 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc hóa học của flavonoid tách chiết từ Bạch tật lê [56].

Cấu trúc của alkaloid tách chiết từ Bạch tật lê [56]. 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tác dụng dược lí của cây Bạch tật lê. Bạch tật lê đƣợc sử dụng trong các vị thuốc truyền thống nhƣ thuốc bổ, thuốc tăng cƣờng sinh lí, thuốc giảm nhẹ co thắt dạ dày, hạ huyết áp và lợi tiểu.

Quả Bạch tật lê khô rất có hiệu quả trong chữa trị hầu hết các rối loạn sinh dục và là một thành phần quan trọng của Ayurvedic - một loại thuốc đƣợc sử dụng để hỗ trợ chức năng sinh lí và tiêu hóa cũng nhƣ để loại bỏ độc tố do nƣớc tiểu. Bạch tật lê đã đƣợc sử dụng trong hàng thế kỷ ở Ayurveda để điều trị chứng bất lực, bệnh hoa liễu và khiếm khuyết sinh dục. Tại Bulgaria, chúng đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc truyền thống để điều trị chứng bất lực. Ngoài tất cả các ứng dụng này, rễ và quả Bạch tật lê còn đƣợc sử dụng trong điều trị rối loạn tim mạch, các bệnh về mắt, phục hồi chức năng gan, nhuận tràng, giảm đau, lợi tiểu và làm thuốc bổ tại Trung Quốc và Ấn Độ [30].

Tác động lợi tiểu Các đặc tính lợi tiểu của cây Bạch tật lê là do một lƣợng lớn nitrat và tinh dầu có trong quả và hạt đồng thời cũng có thể là do sự có mặt của muối kali ở nồng độ cao. Ali và cộng sự đã nghiên cứu tác động lợi tiểu của dịch chiết từ quả và lá cây Bạch tật lê trên chuột với nồng độ uống là 5,0 g/kg.