Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Kháng sinh truyền thống có nguồn gốc từ vi sinh vật hoặc qua các quy trình bán tổng hợp, tổng hợp hóa học đang bị lạm dụng nghiêm trọng trong y tế và chăn nuôi. Thực trạng này dẫn đến hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và sự tồn dư hóa chất kháng sinh trong chuỗi cung ứng thực phẩm. Bên cạnh đó, các chất chống oxy hóa tổng hợp thường dùng trong công nghiệp thực phẩm như butylated hydroxyanisole (BHA) và butylated hydroxytoluene (BHT) tiềm ẩn độc tính và nguy cơ gây hại cho sức khỏe con người. Trước yêu cầu tìm kiếm các hoạt chất sinh học tự nhiên, an toàn để thay thế kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và ứng dụng trong y dược, cây cúc tần (Pluchea indica (L.) Less) và xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees) là hai đối tượng thảo dược giàu tiềm năng được lựa chọn để nghiên cứu.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể như sau:

  1. Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn của tinh dầu cúc tần cùng các dịch chiết từ dược liệu cúc tần và xuyên tâm liên trên 9 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm: Bacillus subtilis ATCC 6633, Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 25023, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 85922, Escherichia coli ATCC 35218 (ATCC 33218), Escherichia coli ATCC 25922 và Salmonella ATCC 13311.
  2. Xác định dung môi chiết xuất tối ưu nhất cho hoạt tính kháng khuẩn của từng loại dược liệu.
  3. Khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết cúc tần và xuyên tâm liên; từ đó xác định dung môi cho hiệu suất thu nhận hàm lượng và hoạt tính cao nhất.

Đối tượng nghiên cứu gồm:

  • Dược liệu thực vật: Cây cúc tần thu hái tại Làng Nghĩa Trai, xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên; Dược liệu xuyên tâm liên sơ chế do Công ty Dược liệu cổ truyền Bình An (Nghĩa Trai, Hưng Yên) cung cấp.
  • Vi khuẩn thử nghiệm: 9 chủng vi khuẩn chuẩn ATCC được cung cấp bởi Viện Công nghệ sinh học và lưu trữ, bảo quản tại Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Phạm vi nghiên cứu:

  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Phạm vi thời gian: Thực hiện từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 05 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Đề tài dựa trên cơ sở lý thuyết về thành phần hóa thực vật của cây cúc tần (Pluchea indica thuộc họ Asteraceae) và xuyên tâm liên (Andrographis paniculata thuộc họ Acanthaceae), tập trung vào các nhóm hoạt chất chính như diterpen lacton (tiêu biểu là andrographolide), arabinogalactan, flavonoid, tanin và polyphenol. Cơ chế kháng khuẩn được phân tích dựa trên sự khác biệt cấu trúc thành tế bào giữa vi khuẩn Gram dương (lớp peptidoglycan dày, chứa axit teichoic) và vi khuẩn Gram âm (lớp peptidoglycan mỏng, có màng ngoài lipopolysaccharide). Cơ chế chống oxy hóa được đánh giá thông qua khả năng khử gốc tự do của các hợp chất phenolic nhằm bảo vệ cấu trúc tế bào khỏi stress oxy hóa.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm các quy trình chuẩn hóa:

  • Phương pháp chiết xuất dược liệu: Dược liệu khô được nghiền thành bột mịn (kích thước hạt < 0,5 mm), ngâm chiết trong 6 dung môi có độ phân cực khác nhau gồm nước nóng, methanol, ethanol, ethyl acetate, aceton và hexan theo tỷ lệ 1:30 (10 g bột dược liệu/300 ml dung môi). Dịch chiết được ly tâm loại cặn ở 3500 vòng/phút trong 10 phút, cô quay đuổi dung môi bằng máy cô quay chân không RE-501 ở nhiệt độ không quá 45°C. Cao chiết được hòa tan lại trong dimethyl sulfoxide (DMSO) thành dung dịch gốc nồng độ 2 g/ml (2000 mg/ml) và pha loãng thành 4 mức nồng độ khảo sát: 250 mg/ml, 500 mg/ml, 1000 mg/ml và 2000 mg/ml.
  • Phương pháp tách chiết tinh dầu: Sử dụng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước từ nguyên liệu cúc tần tươi ngâm dung dịch NaCl 20% trong 12–24 giờ; phân tách tinh dầu bằng bình florentin và hỗ trợ thu hồi bằng dung môi hexan qua cô quay hút chân không.
  • Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Áp dụng nguyên lý khuếch tán giếng thạch của Kirby-Bauer. Canh khuẩn được nuôi cấy đạt độ đục chuẩn McFarland 3.0 (tương ứng $9 \times 10^8$ CFU/ml), sau đó trộn vào môi trường thạch Mueller Hinton để đạt mật độ $10^6$ CFU/ml trên đĩa petri 10 cm. Các giếng thạch được tạo bằng ống khâu đường kính 10 mm, nạp 100 µl dịch chiết ở các nồng độ khác nhau. Hoạt tính kháng khuẩn được đo bằng đường kính vòng vô khuẩn ($D - d$, mm) qua máy đo Haloes Caliper - Zone Reader. Tinh dầu cúc tần được khảo sát qua hai phương pháp: khuếch tán giếng thạch và xông hơi (sử dụng 10 miếng giấy lọc tẩm tinh dầu/ethyl acetate gắn trên nắp đĩa petri úp ngược).
  • Phương pháp định lượng polyphenol tổng số: Sử dụng phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu trong môi trường $\text{Na}_2\text{CO}_3$ 10% theo quy trình của Suda et al. Độ hấp thụ quang (OD) được đo ở bước sóng 750 nm trên máy quang phổ so màu 722. Hàm lượng polyphenol được quy đổi tương đương theo đường chuẩn acid chlorogenic (mg acid chlorogenic/100 mg bột dược liệu).
  • Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa: Sử dụng phương pháp quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) theo quy trình của Masuda et al. (2002). Dung dịch DPPH pha trong ethanol 96% phản ứng với mẫu thử trong bóng tối 60 phút, đo mật độ quang ở bước sóng 515 nm. Hoạt tính dọn gốc tự do (%) được tính dựa trên độ giảm OD so với đối chứng và quy đổi tương đương sang mg Vitamin E (VTME/alpha-tocopherol)/100 mg dược liệu.
  • Phương pháp xử lý số liệu: Thống kê sinh học trên phần mềm Microsoft Excel, biểu thị kết quả bằng giá trị trung bình qua 2 lần lặp lại thí nghiệm kèm sai số chuẩn.

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các đặc điểm thực vật học, công dụng dân gian và thành phần hóa thực vật của cây cúc tần và xuyên tâm liên. Tác giả tổng thuật chi tiết đặc tính sinh học của 9 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm (B. subtilis, G. stearothermophilus, P. aeruginosa, S. aureus, E. coli, Salmonella). Đồng thời, chương cung cấp cơ sở lý thuyết về cấu tạo, phân loại các hợp chất polyphenol, cơ chế phản ứng chống oxy hóa enzyme (SOD, CAT, GPx) và không enzyme. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước được tổng hợp, chỉ ra các công bố trước đây về chiết xuất lá Pluchea indica (Sirikhwan et al., 2021; Phùng Thị Hằng, 2021) và chiết xuất Andrographis paniculata (Sahalan et al., 2003; Nguyễn Thị Thanh Hà et al., 2021).

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương trình bày nguồn gốc các nguyên vật liệu, hóa chất tinh khiết và hệ thống thiết bị phòng thí nghiệm tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tác giả mô tả chi tiết từng bước quy trình kỹ thuật: thu hái dược liệu, nghiền nhỏ, chiết xuất với 6 hệ dung môi (nước nóng, methanol, ethanol, ethyl acetate, aceton, hexan), chưng cất tinh dầu, hoạt hóa vi khuẩn, đổ thạch, đục lỗ thạch, ủ mẫu ở 15°C trong 3 giờ trước khi nuôi cấy 37°C trong 24 giờ. Các công thức toán học xác định đường kính vòng vô khuẩn ($D - d$), công thức tính tỷ lệ dọn gốc tự do $\text{AA}%$ và phương pháp thiết lập đường chuẩn đo quang phổ UV-Vis đều được thiết lập chuẩn xác.

Kết quả và thảo luận

Chương tập trung phân tích các dữ liệu thực nghiệm thu được từ ba nội dung chính:

  1. Hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết:

    • Đối với cúc tần: Thể hiện hoạt tính ức chế mạnh trên hai chủng vi khuẩn Gram dương B. subtilis và G. stearothermophilus. Dung môi methanol cho hiệu quả kháng khuẩn tối ưu nhất ở nồng độ 2000 mg/ml (kháng thêm S. aureus). Dịch chiết ethyl acetate và methanol ức chế được E. coli 85922 ở nồng độ cao nhất (2000 mg/ml). Dung môi nước nóng không tạo ra vòng vô khuẩn trên cả 9 chủng vi khuẩn. Cúc tần hoàn toàn không kháng được P. aeruginosa 9027, E. coli 25922 và Salmonella 13311.
    • Đối với xuyên tâm liên: Thể hiện phổ kháng khuẩn rộng trên toàn bộ 9 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm. Dung môi ethanol đạt hiệu quả vượt trội nhất, tạo đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là 18,22 mm trên E. coli 25922 ở nồng độ 2000 mg/ml. Cả 6 dung môi chiết xuất từ xuyên tâm liên đều ức chế được B. subtilis. Dịch chiết ethyl acetate kháng được 6/9 chủng vi khuẩn (đạt vòng vô khuẩn lớn nhất 12,41 mm trên S. aureus), dung môi aceton kháng 5/9 chủng, trong khi dung môi hexan có hoạt tính kháng khuẩn kém nhất.
    • Đối với tinh dầu cúc tần: Phương pháp khuếch tán giếng thạch cho thấy tinh dầu nguyên chất và nồng độ 0,1 có khả năng ức chế vi khuẩn (đặc biệt rõ rệt trên B. subtilis). Phương pháp xông hơi không ghi nhận được vòng vô khuẩn rõ rệt.

  2. Khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số:

    • Đường chuẩn acid chlorogenic được thiết lập với phương trình tuyến tính $y = 1,0213x$, hệ số tương quan $R^2 = 0,9746$ ($p < 0,05$).
    • Cúc tần có hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất ở phân đoạn chiết bằng nước nóng (đạt 0,86 mg acid chlorogenic/100 mg dược liệu), tiếp theo là methanol, và thấp nhất ở phân đoạn hexan (0,001 mg/100 mg).
    • Xuyên tâm liên có hàm lượng polyphenol thấp hơn cúc tần (không vượt quá 0,3 mg/100 mg dược liệu), giảm dần theo thứ tự: methanol > nước nóng > ethanol > aceton. Hai dung môi ethyl acetate và hexan không phát hiện được polyphenol (not detected - nd) do phản ứng đổi màu thuốc thử Folin không đủ độ nhạy.

  3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa:

    • Đường chuẩn Vitamin E (VTME) đối với DPPH có phương trình $y = 193,2526x$ ($R^2$ đạt độ tin cậy cao).
    • Khả năng dọn gốc tự do tương quan thuận với hàm lượng polyphenol. Dịch chiết cúc tần trong dung môi nước nóng và methanol cho hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, trong đó phân đoạn nước nóng đạt giá trị tương đương 1,007 mg VTME/100 mg dược liệu, sau đó giảm dần qua aceton, ethyl acetate, ethanol và hexan.
    • Dịch chiết xuyên tâm liên trong dung môi ethyl acetate và hexan cũng không xác định được hoạt tính chống oxy hóa do hàm lượng hoạt chất khử quá thấp.

Kết luận và kiến nghị

Tóm lược các kết luận thực nghiệm về dung môi tối ưu cho từng mục tiêu chiết xuất và đề xuất các hướng ứng dụng dược liệu cúc tần, xuyên tâm liên trong thực tiễn chăn nuôi sạch.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm toàn diện về hoạt tính kháng khuẩn, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của hai loài thảo dược qua bảng tổng hợp sau:

Dược liệu Dung môi chiết xuất Phổ kháng khuẩn chính Hàm lượng Polyphenol (mg acid chlorogenic/100 mg) Hoạt tính chống oxy hóa (mg VTME/100 mg)
Cúc tần (P. indica) Nước nóng Không kháng khuẩn (0/9 chủng) 0,860 1,007
Methanol Kháng B. subtilis, G. philus, S. aureus, E. coli 85922 Cao thứ hai (sau nước nóng) Cao (chỉ sau nước nóng)
Ethanol Kháng B. subtilis, G. philus 0,001 Thấp
Ethyl acetate Kháng B. subtilis, G. philus, E. coli 85922 Trung bình Trung bình
Aceton Kháng B. subtilis, G. philus Trung bình Trung bình
Hexan Kháng B. subtilis, G. philus 0,001 Thấp nhất
Tinh dầu nguyên chất Kháng mạnh trên B. subtilis (khuếch tán giếng) — —
Xuyên tâm liên (A. paniculata) Ethanol Kháng 9/9 chủng vi khuẩn ($D-d$ đạt 18,22 mm trên E. coli 25922) < 0,300 Trung bình
Methanol Kháng B. subtilis, G. philus, E. coli, S. aureus... Cao nhất trong các dung môi (< 0,300) Cao nhất trong các dung môi
Nước nóng Kháng yếu Cao thứ hai (< 0,300) Trung bình
Ethyl acetate Kháng 6/9 chủng ($D-d$ đạt 12,41 mm trên S. aureus) Không phát hiện (nd) Không phát hiện (nd)
Aceton Kháng 5/9 chủng Thấp (< 0,300) Thấp
Hexan Kháng kém nhất (chỉ ức chế B. subtilis ở 1000–2000 mg/ml) Không phát hiện (nd) Không phát hiện (nd)

Các đóng góp cụ thể của khóa luận bao gồm:

  • Xác định được ethanol là dung môi tối ưu nhất để chiết xuất hoạt chất kháng khuẩn từ xuyên tâm liên (ức chế phổ rộng trên cả 9 chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương thử nghiệm).
  • Xác định methanol là dung môi tối ưu nhất cho hoạt tính kháng khuẩn của cúc tần; trong khi nước nóng là dung môi thu nhận hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở loài này.
  • Cung cấp thêm dẫn liệu thực nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu cúc tần bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
  • Đề xuất cơ sở khoa học cho việc tuyển chọn và sử dụng dịch chiết thảo dược cúc tần, xuyên tâm liên bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm hạn chế và thay thế kháng sinh tổng hợp, góp phần xây dựng chuỗi thực phẩm an toàn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Các thí nghiệm mới dừng lại ở quy mô in vitro trong phòng thí nghiệm với 2 lần lặp lại cho mỗi công thức dung môi.
  • Phân đoạn chiết bằng ethyl acetate và hexan ở cây xuyên tâm liên chưa đủ nồng độ để định lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa bằng phản ứng màu thông thường.
  • Phương pháp xông hơi tinh dầu cúc tần chưa ghi nhận được hiệu quả rõ rệt do hạn chế về phương pháp khuếch tán pha hơi trên đĩa petri úp ngược.
  • Chưa tiến hành phân lập, tinh sạch và định danh cấu trúc hóa học chi tiết của từng hợp chất đơn lẻ tạo nên hoạt tính trong cao chiết.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết trên các chủng vi khuẩn phân lập trực tiếp từ động vật nuôi mắc bệnh tại các trang trại chăn nuôi.
  • Tiến hành thử nghiệm in vivo bổ sung cao chiết hoặc tinh dầu vào khẩu phần ăn của vật nuôi để đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh và an toàn sinh học thực tế.
  • Tối ưu hóa quy trình chưng cất, tách chiết và ứng dụng các kỹ thuật sắc ký để tinh sạch hoạt chất andrographolide từ xuyên tâm liên và các polyphenol chính từ cúc tần.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các ngành Công nghệ sinh học, Dược học, Thú y, Hóa thực vật và Chăn nuôi.
  • Những người thực hiện đề tài về chiết xuất hoạt chất tự nhiên, sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn hoặc đánh giá khả năng chống oxy hóa của thảo dược.
  • Nội dung đáng tham khảo chuyên sâu: Bố trí thí nghiệm chiết xuất phân đoạn đa dung môi; phương pháp vi sinh chuẩn hóa theo Kirby-Bauer trên 9 chủng vi khuẩn ATCC; quy trình thiết lập đường chuẩn đo quang phổ định lượng polyphenol (Folin-Ciocalteu) và hoạt tính chống oxy hóa (DPPH).

Câu hỏi thường gặp

1. Dung môi nào cho hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất đối với từng loại dược liệu trong khóa luận?
Dung môi ethanol cho hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất đối với xuyên tâm liên (ức chế cả 9 chủng vi khuẩn thử nghiệm, đường kính vòng vô khuẩn đạt 18,22 mm trên E. coli 25922 ở nồng độ 2000 mg/ml). Đối với cúc tần, dung môi methanol cho hiệu quả kháng khuẩn tối ưu nhất trong các dung môi khảo sát.

2. Tại sao cao chiết nước nóng của cúc tần có hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao nhất nhưng không thể hiện tính kháng khuẩn?
Dung môi nước nóng chiết xuất tốt các hợp chất polyphenol phân cực có khả năng dọn gốc tự do DPPH (đạt 0,86 mg acid chlorogenic/100 mg và 1,007 mg VTME/100 mg), tuy nhiên các hoạt chất chính đảm nhận vai trò kháng khuẩn của cúc tần lại kém tan trong nước nóng và chỉ phân bố ở các phân đoạn dung môi hữu cơ có độ phân cực trung bình đến thấp như methanol hoặc ethyl acetate.

3. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu cúc tần được khảo sát bằng những phương pháp nào và cho kết quả ra sao?
Tinh dầu cúc tần được khảo sát qua hai phương pháp: khuếch tán giếng thạch và xông hơi đĩa petri úp ngược. Kết quả cho thấy phương pháp khuếch tán giếng thạch thể hiện vòng vô khuẩn rõ rệt ở nồng độ 0,1 và tinh dầu nguyên chất (đặc biệt trên chủng Bacillus subtilis), trong khi phương pháp xông hơi không ghi nhận được hiệu quả kháng khuẩn.

4. Các chất chuẩn nào được sử dụng trong định lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa?
Nghiên cứu sử dụng chất chuẩn Acid Chlorogenic để xây dựng đường chuẩn quy đổi hàm lượng polyphenol tổng số (bước sóng đo 750 nm, phương trình $y = 1,0213x$, $R^2 = 0,9746$) và chất chuẩn Vitamin E ($\alpha$-tocopherol / VTME) để quy đổi hoạt tính chống oxy hóa dọn gốc tự do DPPH (bước sóng đo 515 nm, phương trình $y = 193,2526x$).

5. Chủng vi khuẩn nào thể hiện mức độ nhạy cảm cao nhất đối với các dịch chiết trong nghiên cứu?
Vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis ATCC 6633 và Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 là những chủng nhạy cảm nhất, bị ức chế bởi hầu hết các hệ dung môi chiết xuất của cả cúc tần và xuyên tâm liên, điều này phù hợp với đặc điểm cấu tạo thành tế bào peptidoglycan đơn lớp dễ bị tổn thương của vi khuẩn Gram dương.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Phạm Thị Huế đã chứng minh thực nghiệm thành công tiềm năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của hai loài dược liệu cúc tần (Pluchea indica) và xuyên tâm liên (Andrographis paniculata). Trong đó, cao chiết ethanol của xuyên tâm liên thể hiện khả năng kháng khuẩn vượt trội trên cả 9 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm, còn dịch chiết nước nóng và methanol của cúc tần sở hữu hàm lượng polyphenol cùng hoạt tính dọn gốc tự do DPPH cao. Các phát hiện này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho định hướng ứng dụng hoạt chất tự nhiên từ thảo dược nhằm thay thế kháng sinh trong chăn nuôi và phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe.