Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase của dịch chiết cây thổ sâm talinum paniculatum jacq gaertn

Khóa luận nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của dịch chiết cây thổ sâm Talinum paniculatum, ứng dụng tiềm năng trong y học và mỹ phẩm.

• Tác giả: Phạm Ngọc Ánh
• Người hướng dẫn: ThS. Phí Thị Cẩm Miện
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Chống Oxy Hóa Và Ức Chế Tyrosinase Của Dịch Chiết Cây Thổ Sâm Talinum Paniculatum
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích, yêu cầu
• 2. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về cây Thổ sâm
• 2.1.1. Nguồn gốc cây Thổ sâm
• 2.1.2. Đặc điểm phân loại và hình thái cây Thổ sâm
• 2.1.3. Đặc điểm phân bố cây Thổ sâm
• 2.1.4. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Thổ sâm
• 2.1.5. Thành phần hóa học của cây Thổ sâm
• 2.1.6. Tính vị và tác dụng của cây Thổ sâm
• 2.1.7. Tình hình nghiên cứu Thổ sâm ở Việt Nam và trên thế giới
• 2.2. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxi hóa của cao chiết thực vật
• 2.2.1. Phương pháp DPPH
• 2.2.2. Phương pháp MDA
• 2.3. Tổng quan về enzyme tyrosinase
• 2.3.1. Khái niệm và nguồn gốc về enzyme tyrosinase trong tự nhiên
• 2.3.2. Vai trò và ứng dụng của enzyme tyrosinase
• 2.3.3. Cơ chế hoạt động của enzyme tyrosinase
• 2.3.4. Ảnh hưởng chất ức chế đến hoạt động của enzyme tyrosinase
• 2.3.5. Các chất có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
• 2.3.6. Các phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme tyrosinase
• 2.3.7. Ý nghĩa của việc nghiên cứu về các chất ức chế enzyme tyrosinase
• 2.4. Một số phương pháp chiết
• 2.4.1. Phương pháp chiết Soxhlet
• 2.4.2. Phương pháp chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE)
• 2.4.3. Phương pháp ngấm kiệt
• 2.4.4. Phương pháp lôi cuốn hơi nước
• 3. PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
• 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Nghiên cứu tách chiết thu dịch chiết cây Thổ sâm
• 3.4.2. Đánh giá khả năng chống oxi hóa của dịch chiết cây Thổ sâm
• 3.4.3. Đánh giá khả năng ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase của dịch chiết cây Thổ sâm
• 3.5. Xử lí số liệu
• 4. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết
• 4.2. Đánh giá khả năng chống oxi hóa từ dịch chiết cây Thổ sâm
• 4.2.1. Xây dựng đường chuẩn Trolox
• 4.2.2. Xây dựng đường chuẩn dịch chiết
• 4.3. Đánh giá khả năng ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase từ dịch chiết cây Thổ sâm
• 4.3.1. Đánh giá khả năng ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase từ dịch chiết cây Thổ sâm
• 4.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của cơ chất với quá trình ức chế enzyme tyrosinase
• 5. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5.1. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất tách chiết
• 5.2. Đánh giá khả năng chống oxi hóa từ dịch chiết cây Thổ sâm
• 5.3. Đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ dịch chiết Thổ sâm
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết cây Thổ Sâm

Nghiên cứu tập trung vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết cây Thổ Sâm (Talinum Paniculatum). Các phương pháp như DPPH và ELISA được sử dụng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa. Kết quả cho thấy dịch chiết từ lá có hoạt tính mạnh nhất, đặc biệt ở nồng độ 1000 µg/ml. Các hợp chất phenolic trong lá được xác định là yếu tố chính giúp ức chế quá trình oxy hóa. Nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng dịch chiết cây Thổ Sâm trong sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm chống lão hóa.

1.1 Phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa

Phương pháp DPPH được sử dụng để đo khả năng bắt gốc tự do của dịch chiết cây Thổ Sâm. Kết quả cho thấy dịch chiết từ ethanol 70⁰ và 96⁰ có hiệu suất cao nhất. Chất chống oxy hóa Trolox được dùng làm chuẩn so sánh. Phương pháp ELISA cũng được áp dụng để xác định hoạt tính chống oxy hóa thông qua đo mật độ quang. Các kết quả này khẳng định tiềm năng của Talinum Paniculatum trong việc ngăn ngừa các bệnh liên quan đến gốc tự do.

II. Ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase của dịch chiết cây Thổ Sâm

Nghiên cứu cũng tập trung vào tác dụng ức chế tyrosinase của dịch chiết cây Thổ Sâm. Enzyme tyrosinase đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin, liên quan đến các bệnh về da. Kết quả cho thấy dịch chiết từ lá có khả năng ức chế mạnh, với giá trị IC50 là 67,33 µM. Các hợp chất phenolic trong dịch chiết được xác định là yếu tố chính giúp ức chế enzyme tyrosinase. Điều này mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất mỹ phẩm và thuốc điều trị các bệnh về da.

2.1 Cơ chế ức chế enzyme tyrosinase

Nghiên cứu sử dụng cơ chất L-DOPA để đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase. Kết quả cho thấy dịch chiết từ cây Thổ Sâm có cơ chế ức chế cạnh tranh, với giá trị Km = 0,77. Điều này chứng tỏ dịch chiết có khả năng liên kết trực tiếp với enzyme, ngăn cản quá trình tổng hợp melanin. Phương pháp Lineweaver-Burk được sử dụng để phân tích cơ chế ức chế, khẳng định hiệu quả của dịch chiết cây Thổ Sâm trong việc kiểm soát hoạt tính enzyme tyrosinase.

III. Ứng dụng thực tiễn của dịch chiết cây Thổ Sâm

Nghiên cứu khẳng định tiềm năng ứng dụng của dịch chiết cây Thổ Sâm trong nhiều lĩnh vực. Với khả năng chống oxy hóa mạnh, dịch chiết có thể được sử dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm chống lão hóa. Tác dụng ức chế tyrosinase mở ra cơ hội ứng dụng trong mỹ phẩm và thuốc điều trị các bệnh về da. Cây Thổ Sâm cũng được xem là nguồn dược liệu tự nhiên an toàn và hiệu quả, góp phần phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ thiên nhiên.

3.1 Tiềm năng trong ngành dược phẩm

Dịch chiết cây Thổ Sâm được đánh giá cao nhờ khả năng chống oxy hóa và ức chế tyrosinase. Các hợp chất phenolic trong dịch chiết có thể được tinh chế để sản xuất thuốc chống lão hóa và điều trị các bệnh về da. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Talinum Paniculatum là nguồn dược liệu tự nhiên dồi dào, an toàn và hiệu quả, góp phần giảm thiểu tác dụng phụ của các loại thuốc tổng hợp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase của dịch chiết cây Thổ sâm (Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn)" được thực hiện bởi sinh viên Phạm Ngọc Ánh dưới sự hướng dẫn của ThS. Phí Thị Cẩm Miện tại Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào năm 2021. Đề tài thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật và hóa sinh thực nghiệm, tập trung khảo sát hoạt tính sinh học từ thảo dược tự nhiên.

Lý do chọn đề tài xuất phát từ thực tế các bằng chứng khoa học cho thấy sự gia tăng nồng độ các gốc tự do trong tế bào là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh lý mạn tính nguy hiểm như xơ vữa động mạch, đái tháo đường và ung thư. Bên cạnh đó, enzyme tyrosinase (monophenol, o-diphenol: oxy oxidoreductase, EC 1.14.18.1) đóng vai trò then chốt trong chuỗi sinh tổng hợp hắc sắc tố melanin; sự tích tụ quá mức sắc tố này dẫn đến các hội chứng rối loạn sắc tố da ở người (nám da, đồi mồi, sạm da) và gây hiện tượng sẫm màu, làm biến đổi chất lượng trong bảo quản thực phẩm thực vật. Trong y học cổ truyền, cây Thổ sâm (Talinum paniculatum) từ lâu đã được nhân dân sử dụng như một vị thuốc bồi bổ, giải độc gan, điều hòa huyết áp, hỗ trợ hô hấp. Dù vậy, các nghiên cứu thực nghiệm trong nước nhằm xác lập minh chứng khoa học định lượng về năng lực dập tắt gốc tự do và cơ chế ức chế enzyme tyrosinase của các dịch chiết từ loài cây này còn rất hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của đề tài là đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase của dịch chiết thu nhận từ cây Thổ sâm (Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn), tạo tiền đề dữ liệu cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo trong dược phẩm và thực phẩm chức năng. Khóa luận xác lập 3 nhiệm vụ (yêu cầu) nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản:

1. Nghiên cứu tách chiết thu dịch chiết và cao chiết của Thổ sâm (Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn) bằng các hệ dung môi và phương pháp khác nhau.
2. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết Thổ sâm thông qua thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH.
3. Đánh giá khả năng ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase của dịch chiết cây Thổ sâm bằng phản ứng sinh hóa in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Bộ phận lá của cây Thổ sâm (Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn) thu hái tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học ứng dụng vi tảo, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Địa điểm nghiên cứu: Các phòng thí nghiệm thuộc Khoa Công nghệ Sinh học và Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học ứng dụng vi tảo, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Thời gian nghiên cứu: Khóa luận được tiến hành trong thời gian từ tháng 3 năm 2021 đến tháng 10 năm 2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết của khóa luận dựa trên đặc điểm hóa thực vật của chi Talinum (họ Portulacaceae) và cơ chế động học xúc tác enzyme:

• Khung lý thuyết hóa thực vật: Cây Thổ sâm chứa nhiều nhóm hoạt chất sinh học tự nhiên bao gồm phytosterol (campesterol, stigmasterol, sitosterol), polyphenol, flavonoid, tannin, saponin, steroid và các acid hữu cơ có khả năng chelat hóa ion kim loại hoặc chuyển dịch hydro/electron dập tắt gốc tự do.
• Lý thuyết xúc tác và động học enzyme tyrosinase: Enzyme tyrosinase là một oxidase chứa đồng loại 3 (type-3 copper center) phối trí với các gốc histidine, xúc tác hai phản ứng liên tiếp thuộc con đường Raper-Mason: monophenolase (hydroxyl hóa L-tyrosine thành L-DOPA) và diphenolase (oxy hóa L-DOPA thành o-dopaquinone). Động học phản ứng tuân theo phương trình Michaelis-Menten và được tuyến tính hóa thông qua phương trình đồ thị Lineweaver-Burk ($1/V$ phụ thuộc $1/[S]$) để phân biệt các kiểu ức chế thuận nghịch: ức chế cạnh tranh (tăng $K_m$, giữ nguyên $V_{max}$), ức chế không cạnh tranh kiểu I ($K_m$ không đổi, giảm $V_{max}$) và ức chế phi cạnh tranh/uncompetitive.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm đã triển khai:

• Phương pháp tách chiết mẫu:
  • Chiết hồi lưu Soxhlet: Sử dụng bột lá Thổ sâm khô bao gói trong túi giấy lọc, chiết kiệt liên tục với dung môi ethanol 70°.
  • Chiết có hỗ trợ vi sóng (Microwave-Assisted Extraction - MAE): Bột lá khô (10 g) được phối trộn với 300–400 ml dung môi (thử nghiệm độc lập với ethanol 96° và nước cất), gia nhiệt bằng lò vi sóng trong 20 phút. Hỗn hợp sau đó được ly tâm loại bỏ bã rắn ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút, tiếp tục làm bay hơi dung môi bằng thiết bị cô quay chân không để thu nhận cao chiết thô.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa: Sử dụng kỹ thuật quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, độ tinh khiết 95%). Nguyên tắc dựa trên phản ứng chuyển đổi gốc tự do DPPH màu tím thành dẫn xuất khử không màu hoặc màu vàng nhạt khi tiếp nhận electron hoặc nguyên tử hydro từ chất chống oxy hóa. Mật độ quang (OD) được đo trên máy quang phổ tại bước sóng hấp thụ cực đại $\lambda = 517\text{ nm}$. Hoạt tính trung hòa gốc tự do (% SC) được tính toán đối chiếu với mẫu đối chứng và mẫu trắng. Đồ thị tương quan giữa nồng độ chất thử và % SC được xây dựng để xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự do ($IC_{50}$). Hóa chất đối chứng dương sử dụng là Trolox ((±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid).
• Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase: Đánh giá tác dụng ức chế in vitro trên đĩa vi phiến 96 giếng phẳng (Corning, USA) và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 492 nm trên máy đọc ELISA (MR-96A Mindray). Hỗn hợp phản ứng gồm dung dịch đệm kali phosphat, dung dịch cơ chất L-DOPA (3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanine, 99%), dung dịch dịch chiết Thổ sâm ở các dãy nồng độ pha loãng khác nhau và enzyme mushroom tyrosinase (hoạt lực 7164 units/mg). Phản ứng được ủ ở 37°C trong 30 phút trước khi đo quang. Hiệu lực ức chế được biểu diễn bằng phần trăm ức chế (% Inhibition) và giá trị $IC_{50}$. Acid arbutin (độ tinh khiết 98%) được dùng làm chất đối chứng ức chế dương. Động học phản ứng và kiểu ức chế được phân tích qua đồ thị Lineweaver-Burk khi thay đổi nồng độ cơ chất L-DOPA tại nồng độ dịch chiết cố định 200 µg/ml.
• Nguồn dữ liệu: Dữ liệu thực nghiệm thu thập trực tiếp từ các phép đo quang phổ lặp lại 3 lần trong phòng thí nghiệm; số liệu được xử lý thống kê để tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (SD).

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Mở đầu

Phần mở đầu tập trung nêu bật tính cấp thiết của đề tài khi đối chiếu giữa tiềm năng dược liệu truyền thống của cây Thổ sâm (Talinum paniculatum) với thực trạng thiếu hụt dữ liệu nghiên cứu thực nghiệm định lượng về hoạt tính sinh học tại Việt Nam. Tác giả lập luận rằng sự tích tụ gốc tự do trong cơ thể và sự kích hoạt bất thường của enzyme tyrosinase liên quan trực tiếp đến các tổn thương tế bào và rối loạn sắc tố. Chương này xác định rõ mục đích nghiên cứu tổng thể, phân định 3 nhiệm vụ khoa học cốt lõi (tách chiết, khảo sát DPPH, khảo sát ức chế tyrosinase) và giới hạn phạm vi nghiên cứu trên mẫu lá thu thập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong niên khóa 2021.

Phần II: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các tư liệu khoa học liên quan đến đối tượng và phương pháp nghiên cứu, chia thành các tiểu mục:

• Tổng quan về cây Thổ sâm: Trình bày nguồn gốc xuất xứ từ châu Mỹ nhiệt đới, du nhập vào Việt Nam từ khoảng năm 1909; hệ thống phân loại học thuộc chi Talinum, họ Portulacaceae; đặc điểm hình thái thân thảo cao tới 0,6 m, lá mọc so le phiến dày bóng; đặc điểm nông học, sinh thái và phương pháp nhân giống bằng hạt hoặc giâm cành. Về hóa thực vật, cây chứa phytosterol, saponin, flavonoid, tannin, steroid cùng các nguyên tố kali, natri, canxi, magie, sắt; rễ chứa các dẫn xuất phenolic (campesterol, stigmasterol, sitosterol). Y học cổ truyền ghi nhận Thổ sâm có vị ngọt, tính bình, bổ trung ích khí, nhuận phế sinh tân, dùng chữa suy nhược, ho, viêm thận, sỏi bàng quang, cao huyết áp.
• Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Trích dẫn nghiên cứu của Menezes và cộng sự tại Brazil chứng minh lá Thổ sâm giàu protein (18,61 g/100 g), chất xơ (34,75 g/100 g), vitamin C (81,03 mg/100 g), hàm lượng phenolic cao nhất đạt 432,73 mg EAG/100 g khi chiết bằng methanol/acid acetic và có hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus cereus; các nghiên cứu chiết phân đoạn hexane, ethyl acetate kháng khuẩn trên tế bào BHK-21; các nghiên cứu của Guha, Bhardwaj, Tolulope về hoạt tính chống oxy hóa DPPH của các bộ phận cây.
• Phương pháp đánh giá chống oxy hóa: Trình bày chi tiết nguyên lý bắt gốc tự do DPPH ở bước sóng 517 nm và phương pháp xác định peroxy hóa lipid màng thông qua malonyl dialdehyde (MDA).
• Tổng quan enzyme tyrosinase: Phân tích cấu trúc trung tâm đồng đôi, vai trò sinh học của gen TYR, con đường hình thành hắc tố Raper-Mason, các ứng dụng trong y tế (điều trị Parkinson bằng L-DOPA, điều trị bạch biến, nám da) và nông nghiệp; cơ chế động học ức chế cạnh tranh, không cạnh tranh kiểu I và uncompetitive theo mô hình Michaelis-Menten; tổng thuật các chất ức chế tyrosinase tự nhiên và tổng hợp (acid kojic, arbutin, hydroquinone, vitamin C, acid azelaic).
• Các phương pháp tách chiết: Phân tích ưu nhược điểm của 4 kỹ thuật chiết: chiết hồi lưu Soxhlet, chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết ngấm kiệt và chiết lôi cuốn hơi nước.

Phần III: Đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này chuẩn hóa toàn bộ điều kiện thực nghiệm:

• Đối tượng: Lá cây Thổ sâm thu tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển CNSH vi tảo; thời gian thực hiện từ tháng 3 đến tháng 10 năm 2021.
• Hóa chất và trang thiết bị: DPPH, Trolox, cơ chất L-DOPA (99%), mushroom tyrosinase (7164 units/mg), acid arbutin (98%), đệm potassium/phosphat, dung môi ethanol, DMSO 99,9%; thiết bị chính gồm bộ chiết Soxhlet, lò vi sóng, máy ly tâm, máy cô quay chân không, máy đo quang phổ và máy đọc miễn dịch ELISA 96 giếng Mindray MR-96A.
• Bố trí thí nghiệm và quy trình:
  • Tách chiết: Thử nghiệm chiết vi sóng MAE (10 g bột lá trong 300–400 ml ethanol 96° hoặc nước, chạy 20 phút, ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút, cô quay chân không) và chiết Soxhlet với ethanol 70°.
  • Thử nghiệm DPPH: Pha loãng cao chiết thành các nồng độ từ 5 đến 1000 µg/ml, phản ứng với dung dịch DPPH 0,1 mM trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo OD tại 517 nm; dựng đường chuẩn Trolox.
  • Thử nghiệm enzyme tyrosinase: Bố trí các giếng thử nghiệm trên vi đĩa 96 giếng chứa đệm kali phosphat, L-DOPA, mẫu dịch chiết hoặc arbutin, bổ sung tyrosinase, ủ ấm 30 phút ở 37°C và đo OD tại 492 nm. Lập đồ thị Lineweaver-Burk để giải mã động học enzyme.

Phần IV: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả thể hiện các dữ liệu thực nghiệm qua các bảng biểu và đồ thị:

• Ảnh hưởng của dung môi và phương pháp đến hiệu suất tách chiết: Bảng 4.1 và Bảng 4.2 so sánh khối lượng dịch chiết, cao chiết và hiệu suất thu hồi giữa phương pháp Soxhlet (ethanol 70°) và phương pháp vi sóng MAE (ethanol 96°, nước cất).
• Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Thổ sâm: Dựng thành công đường chuẩn Trolox (Biểu đồ 4.1, Bảng 4.3). Kết quả bắt gốc tự do DPPH (Bảng 4.4, Biểu đồ 4.2) chứng minh nồng độ dịch chiết 1000 µg/ml cho khả năng dập tắt gốc tự do cao nhất ở cả ba dung môi; giá trị $IC_{50}$ của dịch chiết lá lần lượt đạt 361,791 µg/ml, 326,205 µg/ml và 309,936 µg/ml tùy thuộc hệ dung môi chiết xuất.
• Khả năng ức chế enzyme tyrosinase: Khảo sát mật độ quang OD trung bình (Bảng 4.5), xác định phần trăm ức chế và giá trị $IC_{50}$ của dịch chiết Thổ sâm (Bảng 4.6, Biểu đồ 4.3) so sánh trực tiếp với chất chuẩn arbutin (Bảng 4.7, Biểu đồ 4.4).
• Phân tích động học cơ chế ức chế: Khảo sát phản ứng với các nồng độ cơ chất L-DOPA biến thiên (Bảng 4.8). Đồ thị Lineweaver-Burk (Biểu đồ 4.5) tại nồng độ chất ức chế dịch chiết Thổ sâm 200 µg/ml xác định phản ứng ức chế tyrosinase thuộc dạng ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) với giá trị hằng số $K_m = 0,77$ và giá trị $IC_{50}$ phản ứng đạt 67,33 µM.

Phần V: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các phát hiện về hiệu suất dung môi, giá trị $IC_{50}$ chống oxy hóa DPPH và thông số động học ức chế enzyme tyrosinase cạnh tranh của dịch chiết lá Thổ sâm; đưa ra kiến nghị tiếp tục nghiên cứu tinh sạch phân đoạn hoạt tính và mở rộng thử nghiệm trên các bộ phận khác như thân và rễ củ.

Kết quả và đóng góp

Các kết quả định lượng cụ thể thu được từ quá trình thực nghiệm của đề tài được tổng hợp trong bảng sau:

Chỉ số / Thông số thực nghiệm	Điều kiện / Dung môi / Chất thử	Giá trị ghi nhận trong văn bản
Nồng độ dập tắt DPPH tối đa	Cả 3 hệ dung môi (Ethanol 70°, Ethanol 96°, Nước)	Đạt cao nhất tại nồng độ 1000 µg/ml
Giá trị $IC_{50}$ bắt gốc tự do DPPH	Dung môi 1 (theo thứ tự khảo sát mẫu lá)	361,791 µg/ml
Giá trị $IC_{50}$ bắt gốc tự do DPPH	Dung môi 2 (theo thứ tự khảo sát mẫu lá)	326,205 µg/ml
Giá trị $IC_{50}$ bắt gốc tự do DPPH	Dung môi 3 (theo thứ tự khảo sát mẫu lá)	309,936 µg/ml
Cơ chế ức chế enzyme tyrosinase	Phân tích qua đồ thị Lineweaver-Burk	Ức chế cạnh tranh (Competitive)
Hằng số Michaelis ($K_m$)	Tại nồng độ dịch chiết Thổ sâm 200 µg/ml	0,77
Giá trị $IC_{50}$ của phản ứng ức chế	Phản ứng tyrosinase và cơ chất L-DOPA	67,33 µM
Chất chuẩn đối chứng dương	Thử nghiệm chống oxy hóa DPPH	Trolox
Chất chuẩn đối chứng dương	Thử nghiệm ức chế enzyme tyrosinase	Acid Arbutin (98%)

Giải pháp và kiến nghị tác giả đề xuất:

• Kết quả chứng minh dịch chiết lá Thổ sâm có hoạt tính sinh học kép: chống oxy hóa mạnh và ức chế enzyme tyrosinase với cơ chế cạnh tranh lành tính. Do đó, tác giả đề xuất định hướng ứng dụng dịch chiết lá loài này làm thành phần bổ sung trong thực phẩm chức năng nhằm tăng cường sức khỏe, đồng thời nghiên cứu sản xuất các chế phẩm chăm sóc da và điều trị rối loạn sắc tố an toàn.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa quy trình công nghệ chiết xuất bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) và triển khai các thử nghiệm phân lập sâu hơn.

Đóng góp của khóa luận:

• Cung cấp dẫn liệu khoa học thực nghiệm có hệ thống đầu tiên về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase kết hợp hoạt tính chống oxy hóa DPPH của cây Thổ sâm sinh trưởng tại Việt Nam.
• Thiết lập quy trình chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE) rút ngắn thời gian so với phương pháp cổ điển, đồng thời xác lập thông số động học enzyme ($K_m = 0,77$; cơ chế ức chế cạnh tranh với cơ chất L-DOPA) làm cơ sở cho các nghiên cứu hóa dược tiếp nối.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Đề tài chỉ tập trung khảo sát trên bộ phận lá của cây Thổ sâm, chưa mở rộng phân tích so sánh song song với các bộ phận thân và rễ củ (những bộ phận có giá trị dược liệu truyền thống cao).
• Thử nghiệm mới dừng lại ở dạng dịch chiết thô và cao chiết toàn phần từ 3 hệ dung môi, chưa tiến hành phân đoạn chiết phân bố lỏng - lỏng hoặc sắc ký cột để tinh sạch, định danh cấu trúc phân tử của từng hợp chất chịu trách nhiệm chính về hoạt tính.
• Toàn bộ thử nghiệm ức chế enzyme và chống oxy hóa đều thực hiện ở quy mô in vitro phi tế bào (sử dụng enzyme mushroom tyrosinase), chưa kiểm tra trên dòng tế bào hắc tố sống (như dòng u hắc tố B16) hoặc mô hình in vivo.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của quá trình chiết vi sóng (công suất, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian) bằng mô hình bề mặt đáp ứng (RSM).
• Tiến hành phân lập các hợp chất phenolic, flavonoid đặc trưng từ dịch chiết lá và rễ củ Thổ sâm.
• Khảo sát độc tính tế bào và kiểm chứng hiệu quả ức chế tổng hợp melanin trên mô hình nuôi cấy tế bào hắc tố.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tư liệu học thuật hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Hóa sinh học, Dược liệu, Nông dược và Công nghệ Thực phẩm.
• Những người thực hiện đề tài về chiết xuất hoạt chất tự nhiên từ thực vật, sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa hoặc tìm kiếm chất ức chế enzyme tyrosinase phục vụ ngành mỹ dược phẩm.

Các nội dung đáng tham khảo nhất trong văn bản:

• Giao thức thực nghiệm chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE) kết hợp cô quay chân không thu hồi cao chiết từ mẫu thực vật tươi/khô.
• Quy trình chuẩn hóa thử nghiệm in vitro trên vi đĩa 96 giếng để định lượng hoạt tính chống oxy hóa DPPH và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase đo trên hệ thống ELISA, kèm theo phương pháp dựng đồ thị Lineweaver-Burk xác định thông số động học $K_m$.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng bộ phận nào của cây Thổ sâm và nguồn mẫu được thu hái ở đâu?
Nghiên cứu sử dụng mẫu lá của cây Thổ sâm (Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn). Toàn bộ nguyên liệu được thu hái trực tiếp tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học ứng dụng vi tảo thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong thời gian từ tháng 3 đến tháng 10 năm 2021.

2. Tác giả đã sử dụng những phương pháp và dung môi nào để tách chiết mẫu lá Thổ sâm?
Khóa luận đã khảo sát 2 phương pháp tách chiết: phương pháp chiết hồi lưu Soxhlet sử dụng dung môi ethanol 70° và phương pháp chiết có hỗ trợ vi sóng (MAE) sử dụng độc lập hai dung môi là ethanol 96° và nước cất (chạy vi sóng trong 20 phút, ly tâm loại bã và cô quay chân không).

3. Khả năng chống oxy hóa của các dịch chiết lá Thổ sâm đạt kết quả định lượng như thế nào qua thử nghiệm DPPH?
Kết quả thực nghiệm ghi nhận hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH đạt mức cao nhất ở nồng độ thử nghiệm 1000 µg/ml đối với cả 3 loại dịch chiết. Giá trị nồng độ ức chế 50% gốc tự do ($IC_{50}$) tương ứng của 3 hệ dịch chiết lá Thổ sâm được xác định là 361,791 µg/ml; 326,205 µg/ml và 309,936 µg/ml.

4. Dịch chiết lá Thổ sâm ức chế enzyme tyrosinase theo kiểu động học nào và các thông số thực nghiệm là bao nhiêu?
Dựa trên phân tích đồ thị Lineweaver-Burk tại nồng độ dịch chiết 200 µg/ml với cơ chất L-DOPA, dịch chiết lá Thổ sâm ức chế enzyme mushroom tyrosinase theo cơ chế ức chế cạnh tranh (competitive inhibition). Thử nghiệm ghi nhận giá trị hằng số Michaelis $K_m = 0,77$ và giá trị $IC_{50}$ của phản ứng đạt 67,33 µM.

5. Những chất chuẩn đối chứng dương nào được sử dụng trong các thử nghiệm sinh hóa của khóa luận?
Trong thử nghiệm đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH, chất chuẩn đối chứng dương là Trolox ((±)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid). Trong thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase trên vi đĩa 96 giếng, chất chuẩn đối chứng dương là acid arbutin với độ tinh khiết 98%.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Phạm Ngọc Ánh đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu thực nghiệm đề ra trong việc tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học từ lá cây Thổ sâm (Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn). Nghiên cứu đã chứng minh dịch chiết lá Thổ sâm thể hiện năng lực dập tắt gốc tự do DPPH mạnh nhất tại nồng độ 1000 µg/ml (giá trị $IC_{50}$ nằm trong khoảng 309,936–361,791 µg/ml) và ức chế enzyme tyrosinase theo cơ chế cạnh tranh với $K_m = 0,77$ và $IC_{50} = 67,33\text{ µM}$. Các dữ liệu thực nghiệm này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng nguồn thảo dược Thổ sâm bản địa trong phát triển thực phẩm bổ sung bảo vệ sức khỏe và các sản phẩm chăm sóc da an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thổ sâm (Talinum Paniculatum (Jacq.)Gaertn là loại cây thân thảo được biết đến với giá trị dược liệu cao được sử dụng như một bài thuốc quý điều trị bệnh ở người đồng thời rất tốt cho cơ thể con người giúp bổ trung ích khí, nhuận phế sinh tân. Dân gian thường dùng Thổ sâm để chữa các bệnh như suy nhược ốm yếu, hỗ trợ điều trị ho lâu ngày cũng như chữa các bệnh về cao huyết áp, bệnh gan và giúp giải độc gan nhưng chỉ có hai bộ phận của cây được chú trọng nghiên cứu nhiều nhất là lá và củ do có giá trị dược liệu cao. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây thổ sâm cho thấy, trong lá có rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau có khả năng kháng oxi hóa, có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxi hoá. Tyrosinase (monophenol, o-diphenol: oxy oxidoreductase, EC (1.1) là một enzyme oxi hóa, đều thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa.

Các chất hoá học trong lá được chứng minh có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh, có tiềm năng trong việc điều chế các loại thuốc chữa trị các bệnh liên quan tới gốc tự do như bệnh ung thư. Một số công trình đã chứng minh Thổ sâm thu nhận tại Ấn Độ chứa một lượng lớn các hợp chất thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như: chống oxi hóa, có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxi hóa và ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase. Đồng thời hiện nay, các bằng chứng khoa học cho thấy sự gia tăng nồng độ các gốc tự do trong tế bào là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây nên các vấn đề bệnh tật như: xơ vữa động mạch, tiểu đường, ung thư. Vì vậy, các nhà nghiên cứu trên thế giới không ngừng tìm tòi và sàng lọc các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên để giải quyết các vấn đề trên.

Do đó, nghiên cứu về khả năng chống oxi hóa và ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase là một vấn đề thiết thực. Trong phương pháp này đã nghiên cứu khả năng chống oxi hóa và ức chế hoạt 1 tính enzyme tyrosinase bằng các phương pháp thể hiện qua kết quả thí nghiệm. Trên thế giới và Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng chống oxi hóa và ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase. Tuy nhiên, đến nay có rất ít công bố về các phương pháp cụ thể để chứng minh khả năng chống oxi hóa và ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase, vì vậy việc phát triển các nghiên cứu cây Thổ sâm để nhiều người dân có thể biết tới công dụng của Thổ sâm cho việc chăm sóc sức khỏe là rất cần thiết, đề tài: “Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase của dịch chiết cây Thổ sâm (Talinum Paniculatum Jacq.” được thực hiện.

Mục đích, yêu cầu 1.Mục đích Đánh giá khả năng chống oxi hóa, ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase của dịch chiết cây thổ sâm (Talinum paniculatum jacq.Yêu cầu Nghiên cứu tách chiết thu dịch chiết và cao chiết của Thổ sâm (Talinum paniculatum jacq. Đánh giá khả năng chống oxi hóa của dịch chiết Thổ sâm (T. Đánh giá khả năng ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase của dịch chiết cây Thổ sâm (T. PHẦN II 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây Thổ sâm 2.1 Nguồn gốc cây Thổ sâm Thổ sâm (Talinum Paniculatum (Jacq.) có tên gọi khác là thổ sâm Cao Ly hay đơn giản sâm đất,.

là loại cây thảo dược mọc tự nhiên khắp nơi trên thế giới (Petprai et al. Ở Việt Nam, Thổ sâm vừa là cây mọc tự nhiên, vừa là cây trồng để làm thuốc. Theo một chuyên gia nghiên cứu cây thuốc dân tộc cổ truyền cho biết, Thổ sâm có nguồn gốc từ châu Mỹ nhiệt đới, du nhập vào Việt Nam khoảng năm 1909, sau đó mọc hoang khắp nơi, ra hoa quanh năm.2 Đặc điểm phân loại và hình thái cây Thổ sâm Phân loại: Thổ sâm có tên khoa học là: Talinum Paniculatum (Jacq. Đồng danh: Talinum Triangulare (Jacq.

(Portulaca Triangulare Jacq); Talinum Patens (Gaertn.) Willd; Talinum Fruticosum (L. Thổ sâm thuộc chi Sâm Mùng Tơi (Talinum), họ Rau Sam (Portulacaceae), bộ Cẩm Chướng (Caryophyllales), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae). Ngoài ra, cây Thổ sâm còn có tên gọi khác như: Sâm Cao Ly, Thổ Sâm Cao Ly, Giả nhân sâm, Sâm thảo, Sâm đất, Đông dương sâm, Cứa ly sinh (Thái), Mằm sâm đăm (Tày). Hình thái: Cây thảo mọc đứng cao tới 0,6m, hoàn toàn nhẵn, phân nhánh nhiều ở dưới.

Lá mọc so le, hình trái xoan thuôn hay hình trứng ngược, thót lại ở gốc thành cuống rất ngắn, dài 5-7cm, rộng 2,5-3,5cm, phiến lá dày, hơi mập, bóng cả hai mặt, mép lá hầu như lượn sóng. Hoa nhỏ, màu hồng, xếp thành chùm thưa ở ngọn thân và các nhánh, dài khoảng 30cm. Quả nhỏ hình cầu khi chín có màu đỏ nâu hay xám tro. Hạt rất nhỏ, dẹt, màu đen nhánh, trên mặt hơi nổi vân.

Cụm hoa là một chùy kép mọc ở đầu cành, gồm nhiều hoa nhỏ đường kính ước 6mm, tràng 5 cánh hoa màu tím đỏ nhạt, đài có 2 răng nhỏ, tràng 5 cánh nhọn, nhị nhiều, bầu thượng hình cầu. Củ gần giống củ nhân sâm. Mùa ra hoa tháng 6-7, có quả tháng 9-10.1 Thổ sâm ngoài tự nhiên Chú thích: 2.1 B: Thổ sâm, Hoa và quả Thổ sâm 2.3 Đặc điểm phân bố cây Thổ sâm Thổ sâm mọc hoang và được trồng làm cảnh ở một số tỉnh của Trung Quốc như: Triết Giang, Giang Tô, An Huy, Quảng Tây, Quảng Đông, Tứ Xuyên.và cũng dùng làm thuốc bổ thay sâm. Từ sự khác biệt về đặc điểm hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là hoa mà loài cây này gặp nhiều ở các tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Lạng Sơn, Cao Bằng, Thái Nguyên, Bắc Giang, Quảng Ninh, Hà Nội, Hòa Bình.

Thổ sâm được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc lấy lá làm rau ăn, củ làm thuốc. Cây có thể trồng được ở các vùng lạnh như Lào Cai, Hà Giang… và vùng nóng như đồng bằng, trung du Bắc Bộ. Ở miền Nam, cây Thổ sâm thường mọc hoang hoặc được trồng làm cảnh, nhất là trong khuôn viên chùa chiền, thiền viện, tòa thánh… (người ta hay gọi là cây sâm đất).4 Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Thổ sâm Đặc điểm sinh thái: Thổ sâm ưa đất ẩm nhưng nhiều ánh nắng, rất dễ trồng, có thể thu hoạch lá quanh năm. Khi thu hoạch thì cắt nhánh để đâm chồi, cho ra lứa rau 4 sâm khác.

Ngoài ra, rau sâm còn được trồng trong các chậu kiểng vì cây cho ra hoa bé xinh, phớt hồng rất đẹp. Thổ sâm có thể trồng từ rễ củ hoặc từ hạt. Có thể trồng trong vườn, giá thể khi cây con, trong chậu cảnh hay thùng xốp. Cây mọc khỏe, sau 2-3 tháng có thể hái ngọn và lá làm rau ăn, sau một năm có thể thu hoạch củ, nếu để lâu năm củ sẽ to hơn.

Lá và cành non dùng để nấu với thịt, tôm. Nấu canh rau vị thơm mát dễ chịu gần giống rau mùng tơi. Đặc điểm trồng trọt: Nguồn giống từ hạt Hạt giống sau khi thu hái được xử lí bằng nước ấm (2 sôi + 3 lạnh) ngâm trong nước khoảng 6-8 giờ, vớt ra để ráo, dùng que nhọn chọc lỗ sâu 1cm rồi cho hạt vào (2- 3 hạt/lỗ), lấp kín đất, dùng lưới che nắng cho luống gieo. Nguồn giống từ hom: Chọn hom: hom được lấy từ thân hoặc củ cây mẹ, lấy từ đoạn gốc đến hết phần bánh tẻ của thân, hạn chế lấy phần ngọn quá non, dễ bị thối gốc khi giâm.

Dùng dao hay kéo sắc để cắt hom. Hom được cắt từ thân có chiều dài khoảng 10-20 cm và ít nhất trên mỗi hom có 3-4 mắt lá, tỉa bớt lá trên hom còn chứa khoảng 1/3 lá, đem giâm vào luống. Thường xuyên tưới ẩm. Sau khi giâm 15-20 ngày hom giâm bắt đầu ra rễ thì đem trồng.

Cách trồng bằng hạt: Cây không kén đất, đất nào cũng mọc được trừ những nơi ngập úng. Đất cày bừa lên thành luống cao 20-25 cm, bón lót 10-15 tấn/ha phân chuồng, rạch thành hàng cách nhau 20 cm. Hạt gieo theo hàng, sau tỉa bớt, giữa các cây cách nhau khoảng cách 10-15 cm. Đất trồng pha trộn theo tỉ lệ: 80% đất thịt + 10% tro trấu hoặc rơm mục + 10% phân truồng ủ hoai.

Thường xuyên tưới nước giữ ẩm cho đất, đặc biệt vào mùa nắng hạn. Thường xuyên làm cỏ, xới xáo, vun gốc, bón thúc bằng nước phân chuồng, nước giải hoặc đạm pha loãng. Kết hợp nhổ cỏ dại và phòng trừ sâu xám ăn lá và chồi non. Thổ sâm ra hoa quả quanh năm, mùa ra hoa tháng 6-7, mùa ra quả tháng 9-10.

Khi quả chín cần thu hoạch kịp thời nếu không quả sẽ bị tách làm hạt bị rụng. Đem phơi cả quả, khi khô đập lấy hạt rồi phơi hạt trong nắng yếu cho khô. Hạt tốt là những hạt đen nhánh, bóng. Bảo quản trong lọ sành, để nơi khô ráo.

5 Thổ sâm thường dùng củ. Loại cây một năm đã có thể thu hoạch rễ củ, nhưng tốt nhất là sau ba năm. Nếu dùng ngay cắt rễ con bỏ đầu để cả vỏ thái miếng, sấy nhẹ lửa (60-70⁰C) cho khô. Nếu để lâu, đồ chín, bỏ rễ con, để cả củ hoặc thái miếng, sấy nhẹ lửa cho khô.

Lúc mới đào rễ có màu hồng đẹp. Đem phơi hay sấy khô và để lâu sẽ có màu đen xám. Khi dùng thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc nước đường, đồ chín. Lá thu hoạch quanh năm (Nguyễn Thị Trang, 2016).5 Thành phần hóa học của cây Thổ sâm Nghiên cứu về thành phần hóa học trong cây Thổ sâm, người ta đã phát hiện có các chất phitosterol, saponin, flavonoid, tannin, steroid, các chất vô cơ kali, natri, canxi, magie, sắt.

Trong rễ có các dẫn xuất phenolic, chứa l-hexacosanol, loctacosanol, l-triacontanol, campestrol, stigmasterol, jo-sitostero.6 Tính vị và tác dụng của cây Thổ sâm 2.1 Tính vị của cây Thổ sâm Vị ngọt, tính bình; có tác dụng bổ trung ích khí, nhuận phế sinh tân. Vì lá cây Thổ nhân sâm có vị hơi đắng, cay; tính lạnh, có ít độc nên khi dùng với liều lượng cao có thể gây nôn mửa và ra nhiều mồ hôi. Rễ có vị ngọt, cay, tính mát. Công dụng: thanh nhiệt (hạ sốt), lợi niệu, giải độc.

Chủ trị, toàn cây chữa tiểu đường. Rễ dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường, nhiễm trùng đường tiểu. Kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ thường dùng củ sâm đất nấu nước uống làm thuốc bổ.