Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp trong đồ án tốt nghiệp

Đồ án nghiên cứu tốt nghiệp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây elephantopus sp, thiết kế chi tiết, tính toán kỹ thuật theo tiêu chuẩn, đánh giá tính khả

• Tác giả: Phạm Hữu Tuấn
• Người hướng dẫn: ThS. Phạm Minh Nhựt
• Trường học: Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp.
• Loại tài liệu: đồ án tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CÁM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp.
• 1.2. Đặc điểm của một số loài thuộc Elephantopus sp.
• 1.3. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật
• 1.3.1. Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật
• 1.3.2. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật
• 1.3.3. Một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật
• 1.3.3.1. Alkaloid
• 1.3.3.2. Saponin
• 1.3.3.3. Anthraquinone glycoside
• 1.3.3.4. Flavonoids
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm
• 2.2. Vi sinh vật chỉ thị
• 2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp xử lý và tách chiết hợp chất kháng khuẩn
• 2.5.1. Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị
• 2.5.2. Phương pháp pha loãng mẫu
• 2.5.3. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật chỉ thị
• 2.5.4. Phương pháp tách các phân đoạn từ cao tổng methanol
• 2.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết
• 2.5.6. Phương pháp xác định chỉ số MIC
• 2.6. Phương pháp xác định thành phần hóa học
• 2.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.8. Bố trí thí nghiệm
• 2.8.1. Thí nghiệm 1: Thu nhận cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp.
• 2.8.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp.
• 2.8.3. Thí nghiệm 3: Tách chiết các phân đoạn từ cao tổng methanol 75% từ cây Elephantopus sp.
• 2.8.4. Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn của cao tổng methanol
• 2.8.5. Thí nghiệm 5: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao tổng methanol Elephantopus sp.
• 2.8.6. Thí nghiệm 6: Định tính một số thành phần có trong cây Elephantopus sp.
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Hiệu suất thu hồi cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp.
• 3.2. Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng methanol từ cây Elephantopus sp.
• 3.3. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao tổng Elephantopus sp.
• 3.4. Định tính sơ bộ thành phần hóa học cây Elephantopus sp.
• 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng Elephantopus sp. qua từng phân đoạn
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây Elephantopus sp

Cây Elephantopus sp thuộc họ Cúc, là loại cây sống lâu năm với khoảng 26 loài khác nhau. Các loài như Elephantopus tomentosus, Elephantopus mollis, và Elephantopus scaber đã được mô tả từ lâu đời. Elephantopus sp phân bố chủ yếu ở châu Phi, Nam Á, Úc, và Châu Mỹ. Tại Việt Nam, hai loài phổ biến là Elephantopus scaber và Elephantopus tomentosus. Cây này được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh như viêm thận, phù nề, sốt, và lở loét. Nghiên cứu hiện đại cũng đã xác nhận các tính chất kháng khuẩn và kháng viêm của loài cây này.

1.1. Đặc điểm của một số loài thuộc Elephantopus sp

Elephantopus scaber cao 30-60 cm, lá có lông ráp, hoa tím hoặc hồng. Elephantopus mollis cao 0,5-1m, lá thon dài, hoa trắng. Elephantopus tomentosus cao 60-120 cm, thân thẳng đứng, lá hình chữ nhật hoặc oval. Các loài này thường ra hoa vào mùa thu hoặc mùa hè, tùy thuộc vào loài và điều kiện môi trường.

1.2. Công dụng trong y học cổ truyền

Elephantopus sp được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền. Elephantopus scaber được dùng để chữa ho, làm thuốc bổ, và điều trị viêm nhiễm sau sinh. Elephantopus mollis có tác dụng lợi tiểu, hạ sốt, và kháng khuẩn. Elephantopus tomentosus được sử dụng để điều trị kháng viêm và giảm đau. Các nghiên cứu hiện đại đã xác nhận các tác dụng kháng khuẩn và kháng viêm của loài cây này.

II. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol

Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp đã được nghiên cứu kỹ lưỡng. Các hợp chất trong cao chiết có khả năng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Cơ chế kháng khuẩn bao gồm việc phá vỡ màng tế bào, ức chế tổng hợp DNA và RNA, và gây gián đoạn quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Nghiên cứu này cũng xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết methanol, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.

2.1. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật

Các hợp chất từ thực vật như alkaloid, flavonoid, và saponin có tác dụng kháng khuẩn mạnh. Alkaloid như berberine có khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn, trong khi flavonoid và saponin tác động lên màng tế bào và quá trình trao đổi chất. Các hợp chất này có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương, Gram âm, và nấm.

2.2. Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn

Nghiên cứu đã xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp đối với các chủng vi khuẩn như Escherichia coli, Shigella flexneri, và Salmonella typhii. Kết quả cho thấy cao chiết có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn này ở nồng độ thấp. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định là 25 mg/ml đối với một số chủng vi khuẩn.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu được thực hiện bằng cách chiết xuất từ cây Elephantopus sp sử dụng dung môi methanol 75%. Các phân đoạn như hexan, butanol, và ethyl acetate được tách chiết từ cao tổng methanol. Hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn này được đánh giá thông qua phương pháp pha loãng mẫu và xác định MIC. Kết quả cho thấy các phân đoạn có khả năng kháng khuẩn mạnh, đặc biệt là phân đoạn butanol.

3.1. Phương pháp tách chiết và đánh giá

Cao chiết methanol được tách chiết từ cây Elephantopus sp bằng phương pháp ngâm trong dung môi methanol 75%. Các phân đoạn hexan, butanol, và ethyl acetate được tách chiết từ cao tổng methanol. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng phương pháp pha loãng mẫu và xác định MIC.

3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học

Nghiên cứu đã định tính các thành phần hóa học trong cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp. Các hợp chất như alkaloid, flavonoid, và saponin được xác định thông qua các thử nghiệm hóa học. Các hợp chất này có vai trò quan trọng trong tính chất kháng khuẩn của cao chiết.

IV. Kết luận và đề nghị

Nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn mạnh của cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp. Các phân đoạn như butanol và ethyl acetate có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Nghiên cứu cũng đề nghị tiếp tục khám phá các hợp chất khác trong cây Elephantopus sp để phát triển các loại thuốc kháng khuẩn tự nhiên.

4.1. Giá trị thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Elephantopus sp trong y học cổ truyền. Cao chiết methanol và các phân đoạn của nó có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt là trong bối cảnh kháng kháng sinh ngày càng gia tăng.

4.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu đề nghị tiếp tục khám phá các hợp chất khác trong cây Elephantopus sp và đánh giá tác dụng kháng khuẩn của chúng. Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm về cơ chế tác động và độ an toàn của các hợp chất này để phát triển các loại thuốc kháng khuẩn tự nhiên.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lịch sử y học từ đầu thế kỷ XIX, các chất kháng sinh phân lập từ vi sinh vật (điển hình như penicillin từ nấm Penicillium) đã giữ vai trò chủ đạo trong việc điều trị các bệnh lý nhiễm trùng. Tuy nhiên, trước tình trạng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng trên phạm vi toàn cầu, cùng với sự bùng phát phức tạp của các dịch bệnh truyền nhiễm tại các nước đang phát triển và những tác dụng không mong muốn của các loại dược phẩm tổng hợp hóa học, xu hướng nghiên cứu khai thác các hoạt chất sinh học tự nhiên từ thực vật đang nhận được sự quan tâm lớn. Trong y học cổ truyền, nhiều loài thảo dược đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian dưới dạng ngâm sắc để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa và ngoài da. Nhằm cung cấp các luận cứ khoa học thực nghiệm để kiểm chứng tri thức bản địa, đề tài "Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ cây Elephantopus sp." đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của đồ án bao gồm:

1. Xác định khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Elephantopus sp.
2. Bước đầu xác định thành phần hóa học có trong cây Elephantopus sp.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được xác định gồm ba nội dung:

1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol và các phân đoạn từ cây Elephantopus sp.
2. Xác định chỉ số MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) và MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) của cao chiết methanol và các phân đoạn từ cây Elephantopus sp.
3. Định tính một số thành phần hóa học có trong cây Elephantopus sp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng thực vật: Mẫu cây thuộc chi Elephantopus sp. (họ Cúc - Asteraceae) thu thập tại Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng. Nghiên cứu giới hạn khảo sát mẫu thực vật ở mức độ chi.
• Hệ dung môi chiết xuất: Giới hạn trên hệ dung môi methanol 75% để thu cao tổng và 4 phân đoạn phân tách lỏng - lỏng gồm n-hexan (HF), ethyl acetate (EF), 1-butanol (BF) và phân đoạn nước (WF).
• Thành phần hóa học: Giới hạn ở phương pháp định tính phát hiện các nhóm chất hữu cơ tổng quát.
• Vi sinh vật chỉ thị: Khảo sát trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột và vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da.
• Thời gian và địa điểm: Đề tài tiến hành từ tháng 05/2015 đến tháng 08/2015 tại Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Về cơ sở lý thuyết thực vật học và hóa thực vật, tác giả tổng quan chi thực vật Elephantopus L. thuộc họ Cúc (Asteraceae), bộ Asterales, lớp Angiospermae. Đồ án mô tả chi tiết đặc điểm hình thái và dược tính của ba loài tiêu biểu gồm Elephantopus scaber, Elephantopus mollis và Elephantopus tomentosus. Tác giả phân tích cơ chế kháng khuẩn của các chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật (Plant Secondary Metabolites - PSMs). Các hợp chất này tác động lên vi sinh vật qua các cơ chế: phá vỡ tính toàn vẹn và chức năng màng tế bào, ức chế quá trình tổng hợp và chức năng của DNA/RNA, cản trở các phản ứng chuyển hóa trung gian, làm đông tụ tế bào chất và gián đoạn quá trình truyền tin nội bào. Tác giả cũng tổng thuật 7 nhóm hoạt chất sinh học tự nhiên chính có tiềm năng kháng khuẩn gồm: alkaloid, saponin, anthraquinone glycoside, flavonoids, phenolic, tannin và terpene.

Về phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, đồ án triển khai các quy trình chuẩn hóa:

• Phương pháp xử lý và trích ly mẫu: Mẫu cây toàn phần rửa sạch, phơi khô 3–5 ngày, nghiền thành bột mịn. Bột mẫu được ngâm chiết kiệt với dung môi methanol 75% theo tỷ lệ 1:15 (khối lượng/thể tích) trong 24 giờ, lặp lại 3–5 lần. Dịch chiết sau ly tâm (4000 vòng/phút trong 10 phút) được cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ dưới 50°C, sau đó làm khô bằng máy đông khô ở -20°C trong 3 ngày để thu cao tổng methanol.
• Phương pháp tách phân đoạn lỏng - lỏng: Phân tách cao tổng methanol 75% bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan, ethyl acetate, 1-butanol và nước theo tỷ lệ 1:1 trong phễu chiết, lặp lại 4–6 chu kỳ để thu các phân đoạn HF, EF, BF và WF.
• Phương pháp nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật: Vi sinh vật chỉ thị được bảo quản định kỳ trên thạch nghiêng Trypticase Soya Agar (TSA) ở 4°C và giữ giống lạnh sâu trong dung dịch glycerol 40% ở -15°C. Trước thí nghiệm, vi khuẩn được hoạt hóa trong môi trường Trypton Soya Broth (TSB), ủ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 18–24 giờ, đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm và pha loãng bằng nước muối sinh lý vô trùng đạt mật độ chuẩn 10^6 CFU/ml.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và xác định chỉ số MIC: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) trên đĩa thạch TSA theo Aibinu và cộng sự (2007). Các giếng thạch có đường kính 6 mm được đục trên bề mặt đĩa đã trang vi khuẩn. Nhỏ chính xác 100 µl dịch chiết (pha trong dimethyl sulfoxide - DMSO 1%) vào giếng, ủ ở 37°C trong 24 giờ và tiến hành đo đường kính vòng ức chế sinh trưởng (vòng kháng khuẩn). Thử nghiệm xác định MIC thực hiện bằng cách pha loãng dịch chiết theo dãy nồng độ cơ số 2.
• Phương pháp định tính thành phần hóa thực vật: Dựa theo quy trình của Yadav và cộng sự (2013) thông qua các phản ứng màu và phản ứng tạo tủa đặc trưng với các thuốc thử hóa học: Molisch, Fehling và Barfoed (carbohydrate); Mayer, Dragendroff, Hager, Wagner (alkaloid); thử nghiệm tạo bọt (saponin); Borntrager (anthraquinone glycoside); kiềm hóa, Shinoda và sắt(III) chloride (flavonoid); chì acetate và gelatin (phenolic); chì acetate, gelatin mặn, FeCl3 và KMnO4 (tannin); Salkowski và Libermann – Burchard (steroids); Ninhydrin (amino acid).
• Nguồn dữ liệu vi sinh: 20 chủng vi khuẩn kiểm định được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế Công cộng TP.HCM, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 và phần mềm Statgraphics Centurion XV phiên bản 15.02, áp dụng phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định sâu Tukey.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu xác lập tính cấp thiết của việc tìm kiếm các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thảo mộc trong bối cảnh tỷ lệ kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh gia tăng. Tác giả chỉ rõ việc dùng nước sắc cây Elephantopus sp. trong y học cổ truyền là tiền đề thực tiễn cho nghiên cứu. Nội dung chương công bố rõ ràng mục đích, 3 nhiệm vụ nghiên cứu và giới hạn phạm vi nghiên cứu về mặt thực vật (mức độ chi), dung môi (methanol 75% và 4 phân đoạn lỏng), phương pháp định tính và danh mục 20 chủng vi khuẩn khảo sát.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 cung cấp nền tảng lý luận toàn diện gồm 6 nội dung lớn:

• Vị trí phân loại, hình thái thực vật của chi Elephantopus và ba loài đại diện: E. scaber (cao 30–60 cm, lá chụm hoa thị, hoa tím hoặc hồng), E. mollis (cao 0,5–1 m, lá mọc dọc thân, hoa trắng), E. tomentosus (cao 60–120 cm, thân đứng phân nhánh, cụm hoa 12–20 đầu). Tác giả dẫn chứng vùng phân bố địa lý và công dụng trị bệnh trong dân gian tại Việt Nam, Thái Lan (chữa ho, làm thuốc bổ), Malaysia (chống nhiễm trùng hậu sản, trừ giun, trị đầy hơi) và Brazil (hạ sốt, tiêu sỏi thận).
• Bản chất và cơ chế kháng khuẩn của các chất chuyển hóa thứ cấp (PSMs), phân tích các vị trí tác động lên tế bào vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm và nấm men, chỉ rõ vi khuẩn Gram âm nhạy cảm với các hợp chất tác động lên tính thấm của lớp màng kép lipid ngoài.
• Phân loại và cơ chế của các nhóm hợp chất tự nhiên: alkaloid (như berberine gây biến đổi acid nucleic), saponin (làm giảm sức căng bề mặt), anthraquinone, flavonoids (tạo phức bất hoạt enzyme), phenolic (oxy hóa protein và enzyme), tannin (kết tủa protein tế bào vi khuẩn) và terpene.
• Tổng quan các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt tính kháng khuẩn của thảo dược (các nghiên cứu của Anees, Consolacion, Chopra, Greenwood, Lê Thị Bích Uyên...).
• Ảnh hưởng của hệ dung môi chiết xuất (ethanol, methanol, petroleum ether, nước) tới khả năng hòa tan và giải phóng các hoạt chất sinh học.
• Đặc điểm sinh học, hình thái vi thể, khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc và cơ chế gây độc tố của hai nhóm vi sinh vật chỉ thị: nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Escherichia, Vibrio, Salmonella, Shigella) và nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên da (Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus).

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết đối tượng, hóa chất, môi trường dinh dưỡng, thiết bị kỹ thuật và tiến trình 6 thí nghiệm thực hiện:

• Thí nghiệm 1: Quy trình thu nhận cao chiết methanol từ bột cây khô với tỷ lệ chiết 1:15 (w/v), ngâm chiết 3 chu kỳ x 24 giờ, cô quay đuổi dung môi ở nhiệt độ dưới 50°C và đông khô ở -20°C trong 3 ngày.
• Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng methanol 75% ở nồng độ 100 mg/ml (hòa tan trong DMSO 1%) trên 20 chủng vi sinh vật bằng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch 6 mm, thể tích nạp mẫu 100 µl, ủ 37°C trong 24 giờ.
• Thí nghiệm 3: Quy trình chiết phân đoạn liên tiếp lỏng - lỏng bằng bình lắng với các dung môi có độ phân cực khác nhau để thu 4 phân đoạn: hexan (HF), ethyl acetate (EF), butanol (BF) và nước (WF).
• Thí nghiệm 4: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của 4 phân đoạn cao chiết trên các chủng vi khuẩn mục tiêu ở các nồng độ xác định: phân đoạn hexan HF (20 mg/ml), phân đoạn ethyl acetate EF (40 mg/ml), phân đoạn butanol BF (50 mg/ml) và phân đoạn nước WF (50 mg/ml).
• Thí nghiệm 5: Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết methanol đối với các chủng vi khuẩn mẫn cảm bằng phương pháp pha loãng nồng độ bậc 2 trên đĩa thạch.
• Thí nghiệm 6: Quy trình định tính nhận diện các nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên bằng các phản ứng tạo màu và kết tủa đặc trưng.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 thể hiện các kết quả đo đạc thực nghiệm qua các tiểu mục:

• Tiểu mục 3.1: Đánh giá hiệu suất thu hồi cao chiết methanol 75% từ sinh khối bột cây khô Elephantopus sp.
• Tiểu mục 3.2 và Bảng 3.1: Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng methanol 75% (nồng độ 100 mg/ml) đối với 20 chủng vi sinh vật chỉ thị; ghi nhận hiệu lực ức chế rõ nét thông qua hình thành vòng vô khuẩn trên các chủng Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus, Listeria monocytogenes và Pseudomonas aeruginosa.
• Tiểu mục 3.3 và Bảng 3.2: Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao tổng methanol 75% trên các chủng vi khuẩn nhạy cảm, chỉ ra ngưỡng nồng độ thấp nhất bắt đầu xuất hiện vòng kháng khuẩn quanh giếng thạch.
• Tiểu mục 3.4 và Bảng 3.3: Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học thực vật; kiểm chứng bằng hình ảnh thực nghiệm cho thấy phản ứng dương tính rõ rệt với tannin, alkaloid và flavonoid trong cao chiết cây Elephantopus sp.
• Tiểu mục 3.5 và Bảng 3.4: Kết quả tổng hợp so sánh hoạt tính kháng khuẩn của cao tổng methanol 75% và 4 phân đoạn chiết (hexan, ethyl acetate, butanol và nước), cho thấy mức độ ức chế khác nhau giữa các phân đoạn đối với từng nhóm vi khuẩn mục tiêu (Escherichia spp., Shigella flexneri, Salmonella typhii, Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa).

Chương 4: Kết luận và đề nghị

Tổng kết các phát hiện khoa học về khả năng ức chế vi khuẩn của cao chiết methanol cây Elephantopus sp., xác nhận giá trị y dược học của loài cây này và đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả và đóng góp

Về số liệu và chỉ tiêu thực nghiệm, đồ án đã chuẩn hóa danh mục 20 chủng vi sinh vật khảo sát và các mức nồng độ thử nghiệm của cao chiết:

Nhóm vi sinh vật chỉ thị	Chủng vi khuẩn kiểm định cụ thể	Số lượng chủng	Nồng độ khảo sát của dịch chiết
Nhóm Escherichia	Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli 0208, Escherichia coli, Enterotoxigenic E. coli (ETEC)	04	Cao tổng: 100 mg/ml; HF: 20 mg/ml; BF: 50 mg/ml; EF: 40 mg/ml; WF: 50 mg/ml
Nhóm Listeria	Listeria innocua, Listeria monocytogenes	02	Cao tổng: 100 mg/ml và 25 mg/ml; các phân đoạn lỏng
Nhóm Salmonella	Salmonella dublin, Salmonella enteritidis, Salmonella typhii, Salmonella typhimurium	04	Cao tổng: 100 mg/ml; các phân đoạn lỏng
Nhóm Shigella	Shigella boydii, Shigella flexneri, Shigella sonnei	03	Cao tổng: 100 mg/ml; HF: 20 mg/ml; BF: 50 mg/ml; EF: 40 mg/ml; WF: 50 mg/ml
Nhóm Vibrio	Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus	04	Cao tổng: 100 mg/ml và 25 mg/ml; các phân đoạn lỏng
Nhóm gây bệnh cơ hội trên da	Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis	03	Cao tổng: 100 mg/ml; các phân đoạn lỏng

Các kết quả thực nghiệm nổi bật ghi nhận trong đồ án:

• Cao tổng methanol 75% từ cây Elephantopus sp. ở nồng độ 100 mg/ml thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, có khả năng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, tạo vòng kháng khuẩn quan sát rõ trên các chủng đường ruột (E. coli, S. flexneri, S. typhii, V. cholerae, V. alginolyticus) và các chủng cơ hội trên da (L. monocytogenes, P. aeruginosa).
• Thử nghiệm phân đoạn lỏng - lỏng chứng minh sự phân bố hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc vào dung môi chiết tách: các phân đoạn phân cực trung bình và kém phân cực như hexan (HF ở 20 mg/ml) và butanol (BF ở 50 mg/ml) duy trì hoạt tính ức chế trên các chủng vi khuẩn kiểm định như E. coli và Shigella flexneri.
• Phân tích hóa thực vật bước đầu đã định tính thành công sự có mặt của các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng gồm tannin, alkaloid và flavonoid trong dịch chiết cây Elephantopus sp.

Về đóng góp học thuật, đồ án cung cấp dẫn liệu thực nghiệm khoa học về hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh của chi thực vật Elephantopus thu hái tại Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà. Kết quả này bổ sung bằng chứng sinh học thực nghiệm cho các bài thuốc dân gian lưu truyền tại Việt Nam và các nước Đông Nam Á.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài:

• Mẫu thực vật khảo sát mới được định danh dừng lại ở mức độ chi (Elephantopus sp.), chưa phân lập và xác định chính xác tên loài cụ thể (E. scaber, E. mollis hay E. tomentosus).
• Thành phần hóa học mới dừng lại ở mức độ thử nghiệm định tính phát hiện nhóm chất chung, chưa tiến hành định lượng hàm lượng hoạt chất cũng như chưa phân lập, tinh sạch từng hợp chất đơn lẻ.
• Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ mới thực hiện in vitro bằng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch trên môi trường thạch TSA, chưa đánh giá độc tính tế bào hay thử nghiệm hiệu lực sinh học trên mô hình động vật (in vivo).

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả định hướng:

• Phối hợp giám định thực vật học phân tử để xác định chính xác danh pháp loài của mẫu cây thu thập tại Bidoup – Núi Bà.
• Thực hiện chiết tách sâu, sắc ký phân đoạn và ứng dụng các phương pháp quang phổ (như NMR, MS) nhằm tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh khiết có hoạt tính kháng khuẩn cao.
• Mở rộng xác định đầy đủ chỉ số nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) trên toàn bộ 20 chủng vi khuẩn và khảo sát độc tính cấp tính, độc tính bán trường diễn để đánh giá độ an toàn dược học.

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành: Công nghệ Sinh học, Dược học, Hóa hợp chất tự nhiên và Vi sinh vật học ứng dụng.

Nội dung đáng giá để tham khảo gồm:

• Quy trình chiết xuất cao tổng methanol kết hợp cô quay chân không và đông khô bảo toàn hoạt tính sinh học.
• Kỹ thuật phân tách phân đoạn lỏng - lỏng liên tục bốn pha dung môi (hexan, ethyl acetate, butanol, nước).
• Quy trình bố trí thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch chuẩn hóa trên 20 chủng vi khuẩn kiểm định, cùng hệ thống các phản ứng hóa thực vật định tính các nhóm chất hữu cơ từ thực vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật được nghiên cứu trong đồ án được thu hái ở đâu và xử lý bằng phương pháp nào? Mẫu cây Elephantopus sp. được thu hái trực tiếp tại Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng. Quá trình xử lý gồm rửa sạch bụi bẩn, phơi khô tự nhiên trong thời gian từ 3 đến 5 ngày, sau đó đem toàn cây xay thành dạng bột mịn và bảo quản ở 4°C trước khi ngâm chiết.

2. Tác giả đã dùng những hệ dung môi nào để tách chiết và phân đoạn cao chiết? Tác giả sử dụng dung môi ban đầu là methanol 75% theo tỷ lệ 1:15 (w/v) ngâm chiết 3 chu kỳ để thu cao tổng. Sau đó, cao tổng methanol 75% được đưa vào phễu chiết phân tách lần lượt với 4 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau theo tỷ lệ 1:1 gồm: n-hexan, ethyl acetate, 1-butanol và cuối cùng là phân đoạn nước.

3. Danh mục vi sinh vật chỉ thị trong đồ án gồm bao nhiêu chủng và thuộc những nhóm bệnh nào? Đề tài khảo sát trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị, chia làm hai nhóm bệnh chính:

• Nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy: gồm 4 chủng Escherichia (E. coli O157:H7, E. coli 0208, E. coli, ETEC), 2 chủng Listeria (L. innocua, L. monocytogenes), 4 chủng Salmonella (S. dublin, S. enteritidis, S. typhii, S. typhimurium), 3 chủng Shigella (S. boydii, S. flexneri, S. sonnei) và 4 chủng Vibrio (V. alginolyticus, V. cholerae, V. harveyi, V. parahaemolyticus).
• Nhóm vi sinh vật gây bệnh cơ hội trên da: gồm 3 chủng Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Enterococcus faecalis.

4. Những phản ứng hóa học nào đã xác nhận sự hiện diện của các nhóm hoạt chất trong cây? Đồ án đã thực hiện các phản ứng định tính hóa thực vật và ghi nhận sự xuất hiện của:

• Tannin thông qua phản ứng tạo tủa với gelatin mặn, chì acetate và muối sắt(III) chloride.
• Alkaloid thông qua phản ứng tạo tủa đặc trưng với các thuốc thử Dragendroff, Mayer, Wagner và Hager.
• Flavonoid thông qua phản ứng kiềm hóa alkaline, phản ứng khử Shinoda và phản ứng với sắt(III) chloride.

5. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết được thử nghiệm ở những mức nồng độ nào? Cao tổng methanol 75% được khảo sát hoạt tính sơ bộ ở nồng độ 100 mg/ml (và pha loãng khảo sát ở 25 mg/ml đối với một số chủng như L. monocytogenes và V. alginolyticus). Đối với 4 phân đoạn chiết, nồng độ thử nghiệm kháng khuẩn được chuẩn hóa gồm: phân đoạn hexan (HF) ở 20 mg/ml, phân đoạn ethyl acetate (EF) ở 40 mg/ml, phân đoạn butanol (BF) ở 50 mg/ml và phân đoạn nước (WF) ở 50 mg/ml.

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của sinh viên Phạm Hữu Tuấn đã hoàn thành việc đánh giá thực nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết methanol 75% và các phân đoạn dung môi từ cây Elephantopus sp. thu thập tại Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà trên 20 chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột và gây bệnh ngoài da. Nghiên cứu xác lập quy trình chiết xuất, xác định sơ bộ nồng độ ức chế tối thiểu và định tính thành công sự hiện diện của các nhóm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học như tannin, alkaloid và flavonoid. Kết quả thực nghiệm là luận cứ khoa học quan trọng bước đầu chứng minh tiềm năng dược liệu của chi thực vật Elephantopus trong nghiên cứu phát triển các chế phẩm kháng khuẩn tự nhiên.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Giới thiệu về cây Elephantopus sp. Nguồn gốc Elephantopus sp. là loại cây sống lâu năm thuộc họ Cúc, có khoảng 26 loài, chúng đã được mô tả từ lâu đời điển hình như Elephantopus tomentosus được mô tả lần đầu vào năm 1753, Elephantopus mollis được Kunth mô tả vào năm 1820, còn Elephantopus scaber thì được mô tả lần đầu vào năm 1753 bởi Lour.

Phân loại Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Angiospermae Loại Campanulids Bộ Asterales Họ Asteraceae Giống Elephantopus Loại Elephantopus sp. Đặc điểm của một số loài thuộc Elephantopus sp. Elephantopus scaber Elephantopus scaber cao 30-60 cm. Lá mọc thành hoa thị ở gốc, thuôn thon hay thành cuống ôm thân, tù ở đầu, dài 6 -12cm, rộng 3-5 cm, có răng, có lông ráp ở cả hai mặt, với lông trắng, cứng, áp sát.

Hoa tím hay hồng, xếp 4 cái thành đầu; các đầu này lại tập hợp thành ngù bao bởi hai lá bắc hình tam giác, dài 10-15mm, rộng ở gốc. Quả bế có 10 cạnh, hình thoi, có lông, cụt ở đỉnh; mào lông cứng xếp một dãy, thường ra hoa vào mùa thu giữa tháng 6 tới tháng 12, (Wang và ctv 2004). 3 Đồ án tốt nghiệp Hình 1. Hình thái cây Elephantopus scaber 1.

Elephantopus mollis Elephantopus mollis cao 0,5-1m, phủ đầy lông. Lá mọc dài theo thân, không cuống; phiến thon dạng bay, dài 10-15cm, gốc ôm thân, mép khía lượn, có lông mềm ngắn ở mặt dưới; các lá trên rất tiêu giảm. Cụm hoa dài theo thân, nhánh mang nhiều hoa đầu kép trong một bao chung; các hoa đầu phụ cao 8 mm, mang 4 tới 5 hoa trắng, quả bế cao 3mm, có rãnh; mào lông có 5 tơ và thường ra hoa vào tháng 6 và 7 (Alyokhin và ctv 2002). Hình thái cây Elephantopus mollis 1.

Elephantopus tomentosus 4 Đồ án tốt nghiệp Elephantopus tomentosus cao từ 60 tới 120 cm, thân cây thẳng đứng nhiều nhánh, góc cạnh có lông tơ trắng, phần thân rễ khỏe mạnh hình sợi hướng thẳng lên, lá thường bị úa khi cây bắt đầu nở hoa, hầu như không có cuốn lá hoặc cuốn lá rất nhỏ, lá nằm bên dưới có hình chữ nhật hay oval diện tích khoảng 8-22 × 3-7 cm, một gân chính, lá nằm trên có hình elip hay hình chữ nhật có diện tích vào khoảng 7-8 × 1,5-2 cm, hướng trục có lằn xếp và nổi cộm lên lông tơ thưa thớt hoặc dày đặc, cụm hoa vào khoảng 12 tới 20 cụm, cuốn thon dài (Wang và ctv, 2012). Hình thái cây Elephantopus tomentosus 1. Phân bố Elephantopus sp. thường mọc nhiều ở châu Phi, Nam Á, Úc và Châu Mỹ, một vài loài thuộc Đông Nam Mỹ và số ít ở Ấn Độ và Himalaya.

Loài Elephantopus mollis được tìm thấy ở dọc các bờ biển Philippines, ngoài ra còn có thể tìm thấy ở Mexico, Đài Loan và Borneo. Tại Việt Nam có thể gặp một trong hai loài là Elephantopus scaber hay Elephantopus tomentosus. Công dụng Elephantopus sp. được dân gian sử dụng như một loại thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh như viêm thận, phù nề, sốt tức ngực, lở loét, đau khớp do thương 5 Đồ án tốt nghiệp tích, ho do viêm phổi.

chúng cũng còn được dùng như một loại thuốc bổ tăng cường sức khỏe, làm thuốc hạ sốt, viêm cuống phổi và hen suyễn. Người Thái Lan đã dùng Elephantopus scaber để chữa chứng ho, làm thuốc bổ (Inta và ctv, 2008). Ở Malaysia nước sắc rễ cây Elephantopus scaber giúp ngăn chặn viêm nhiễm sau khi sinh con, ngoài ra toàn bộ cây Elephantopus scaber được nấu cùng với đậu đỏ có thể trị chứng đầy hơi (Hammer và Johns, 1993), Elephantopus scaber ở Brazil được sử dụng như một phương thuốc truyền thống giúp hạ sốt, lợi tiểu, loại sỏi thận (Poli và ctv, 1992). Trong nghiên cứu hiện tại chúng cũng được kiểm tra khá kỹ lưỡng về tính độc, khả năng hạ sốt, khả năng giảm đau, kháng viêm, lợi tiểu và gây táo bón.

Elephantopus mollis có công dụng lợi tiểu, hạ sốt, trị thương, kháng khuẩn và virus, rễ cây Elephantopus mollis có công dụng chống nôn mửa còn lá cây có công dụng trong việc chữa các vết loét và bệnh chàm, cả rễ và lá có công dụng làm mềm vết thương, trị tiêu chảy và các chứng đau lỗ tiểu và đau dạ dày (Muthiumani và ctv, 2010). Ở Malaysia người ta sử dụng Elephantopus tomentosus như một vị thuốc lợi tiểu, hạ sốt, giảm đau và trị giun, ngoài ra chúng còn được dùng làm thuốc bôi ngoài da (Jaganath, 2000). Trong báo cáo của Yam và ctv (2009) thì Elephantopus tomentosus được sử dụng để điều trị kháng viêm. Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật 1.

Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật Chất kháng khuẩn thực vật là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có tác dụng tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật. Các chất kháng khuẩn thường có tác dụng đặc hiệu lên các loài vi sinh vật khác nhau ở nồng độ thường rất nhỏ (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010). Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thực vật Cơ chế chung của các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật bao gồm việc phá vỡ màng chức năng và cấu trúc tế bào, gây ra sự gián đoạn quá trình tổng hợp cùng chức năng của DNA và RNA, gây cản trở các chuyển hóa trung gian tế bào, gây đông tụ các thành phần tế bào chất và làm gián đoạn quá trình truyền thông tin 6 Đồ án tốt nghiệp của tế bào. Ngoài ra quá trình hoạt động kháng khuẩn còn bao gồm cả PSMs (Plant secondary metabolites) tác động tới màng tế bào, khuếch tán qua màng tế bào rồi tác động tương tác với các thành phần nội bào từ đó ảnh hưởng tác động tới hoạt động tế bào (Radulovíc và ctv 2013).

Các điểm tác động của PSMs lên vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm Các hợp chất từ thực vật có tác động kháng khuẩn không chỉ là đối với vi khuẩn Gram dương và Gram âm mà còn với cả nấm, trong đó các chủng Gram âm là nhạy cảm dễ bị các hợp chất thực vật tác động lên nhất, có tới 5 hướng mà các hợp chất thực vật có thể tác động tới các chủng Gram âm. Trường hợp điển hình là của thymol, hợp chất này có tác động tới cả màng tế bào của tế bào chất bên ngoài và bên trong bằng cách tích hợp vào nhóm đầu cực của lớp đôi lipid dẫn tới sự chênh lệch, làm tăng tính bán thấm của màng tế bào và gây chết, tuy nhiên thymol cũng có thể tham gia vào việc quy định các gen tham gia vào tổng hợp protein màng ngoài, ức chế enzym liên quan đến bảo vệ chống lại stress nhiệt, tổng hợp ATP, các con đường trao đổi chất citric. Tiềm năng kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của PSMs có thể bị ảnh hưởng và phụ thuộc bởi rất nhiều yếu tố như tính năng của tế bào đích (vi khuẩn, nấm, Gram dương, Gram âm), điều kiện môi trường, khả năng hòa tan, nồng 7 Đồ án tốt nghiệp độ, nhiệt độ, độ pH ảnh hưởng quan trọng tới tác động kháng khuẩn của PSMs cũng như các hỗn hợp của chúng (Radulovíc và ctv, 2013). Một số hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 1.

Alkaloid Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được cung cấp bởi amino acid, đa số có nhân dị vòng. Đa số các alkaloid đều có tính base yếu. Chủ yếu trong thực vật, tập trung ở một số họ: Apocynaceae (họ Trúc đào) gần 800 alkaloid, Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần 400 alkaloid, Fabaceae (họ Đậu) 350 alkaloid, Solanaceae (họ Cà) gần 200 alkaloid. Phương pháp định tính alkaloid: Thử nghiệm Wagner, thử nghiệm Hager, thử nghiệm Mayer, thử nghiệm Dragendroff.

Vai trò của alkaloid chủ yếu là tác động diệt khuẩn, ảnh hưởng lên hệ thần kinh, hạ huyết áp, chống ung thư. Một số alkaloid có tính kháng khuẩn: Solamargine là một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum khasinum), và các loại alkaloid khác trong loài cây này có tác dụng chống lại sự lây nhiễm khi đã mắc phải HIV. Kháng khuẩn tốt nhất dối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan trực tiếp tới việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy. Ngoài solamargine thì berbein cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với shigella, Staphylococcus.

Những năm gần đây một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine có tinh kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn Gram dương, Gram âm ngoài ra berberine còn chống lại nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh. Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với khuẩn gây sốt rét. Cơ chế kháng khuẩn berberine là khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh số rét, chính vì thế mà tác dụng kháng khuẩn của berberine đối với loài này khá mạnh. Đặc biệt khi dùng berberine điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phất triển bình thường của hệ vi sinh vật có lợi ở ruột.

Vì vậy berberine đang được chú ý phát triển ơ nhiều nước (Nguyễn Thị Hiền và ctv 2010). Saponin 8 Đồ án tốt nghiệp Saponin thuộc nhóm glycosides, dưới tác dụng của các enzyme thực vật, vi khuẩn hay acid loãng, saponin bị thuỷ phân thành genin (gọi là sapogenin) và phần glucid thường ở dạng vô định hình, có vị đắng, tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan, hòa tan vào nước từ đó làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo bọt. phát hiện trong mẫu có Saponin bằng thử nghiệm lắc tạo bọt Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, lợi tiểu (liều cao gây nôn mửa, đi lỏng), một số saponin có tác dụng chống viêm, một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus, kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, theo Hoàng Sầm và Hứa Văn Thao (2012). Anthraquinone glycoside Anthraquinone glycosides là hợp chất thường có màu từ vàng, cam tới đỏ, gắn vào nhân thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH., tuỳ theo vị trí các nhóm chức gắn vào nhân mà có các dẫn chất khác nhau.

Anthraquinone glycosides được định tính bằng thử nghiệm Borntrager. Một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất anthraquinon có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư. Thành phần ức chế vi khuẩn trong cây Đại Hoàng chủ yếu là dẫn chất của anthraquinone, có tác dụng kháng khuẩn rộng chủ yếu đối với tụ cầu, liên cầu, song cầu khuẩn lậu, trực khuẩn bạch hầu, thương hàn, phó thương hàn, kiết lị, theo Mạnh Hùng (2015). Flavonoids Flavonoids là một sắc tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, giúp sản xuất sắc tố vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa.

Bộ khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon, có độ tan không giống nhau.