Nghiên Cứu Tác Dụng Của Một Số Loại Thảo Dược Trong Phòng Và Trị Bệnh Hoại Tử Gan Tụy Cấp Ở Tôm

Nghiên cứu tác dụng của thảo dược trong phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm, mang lại giải pháp hiệu quả cho ngành nuôi trồng thủy sản.

• Tác giả: Phạm Thị Huyền
• Người hướng dẫn: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Thảo Dược Trong Phòng Trị Bệnh Hoại Tử Gan Tụy Cấp Ở Tôm
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục từ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. Thesis abstract
• 1.8. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.9. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.10. Tổng quan tài liệu
• 1.10.1. Tình hình nghiên cứu bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi
• 1.10.1.1. Trên thế giới
• 1.10.1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong NTTS
• 1.10.1.2.1. Trên thế giới
• 1.10.1.2.2. Tại Việt Nam
• 1.10.2. Một số loại thảo dược được lựa chọn nghiên cứu
• 1.10.2.1. Ké hoa vàng
• 1.11. Phương pháp nghiên cứu
• 1.11.1. Địa điểm nghiên cứu
• 1.11.2. Vật liệu nghiên cứu
• 1.11.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.11.4. Phương pháp nghiên cứu
• 1.11.4.1. Kiểm tra gen độc lực của vi khuẩn V.020 bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 1.11.4.2. Thử nghiệm hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm
• 1.11.4.3. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 1.11.4.4. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong quy mô thực nghiệm (pilot)
• 1.11.4.5. Phương pháp xử lý và phân tích số liệu
• 1.12. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
• 1.12.1. Xác nhận chủng vi khuẩn gây bệnh ahpnd bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 1.12.2. Xác định hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô thảo dược trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm
• 1.12.3. Xác định hoạt tính của dịch chiết thô thảo dược trong phòng trị bệnh ahpnd ở tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 1.12.3.1. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào thức ăn cho tôm ăn
• 1.12.3.2. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào môi trường nước nuôi tôm
• 1.12.4. Xác định hoạt tính của dịch chiết thô thồm lồm trong phòng trị bệnh ahpnd trên tôm ở quy mô thực nghiệm (PILOT)
• 1.12.4.1. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn
• 1.12.4.2. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào môi trường nước nuôi tôm
• 1.13. Kết luận và kiến nghị
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Thảo Dược Trị Hoại Tử Gan Tụy Tôm

Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) đang là mối đe dọa lớn cho ngành nuôi tôm toàn cầu, gây thiệt hại kinh tế nặng nề. Nghiên cứu này tập trung vào việc nghiên cứu khoa học về thảo dược và bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm, một hướng đi đầy tiềm năng để tìm ra giải pháp thay thế kháng sinh, vốn đang gây ra nhiều hệ lụy. Việc sử dụng thảo dược trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm không chỉ giúp giảm thiểu rủi ro về sức khỏe và môi trường mà còn mở ra cơ hội cho nền nuôi tôm bền vững bằng thảo dược. Nghiên cứu này sẽ đánh giá tác dụng của một số loại thảo dược phổ biến trong việc phòng và trị bệnh AHPND, từ đó cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn nuôi tôm.

1.1. Tầm quan trọng của việc tìm kiếm giải pháp thay thế kháng sinh

Việc lạm dụng kháng sinh trong nuôi tôm đã dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh, gây khó khăn trong điều trị bệnh và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Thảo dược thay thế kháng sinh trong nuôi tôm là một giải pháp tiềm năng, giúp giảm thiểu rủi ro về sức khỏe và môi trường. Nghiên cứu này sẽ đánh giá hiệu quả của các loại thảo dược trong việc kiểm soát bệnh AHPND, từ đó cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn nuôi tôm.

1.2. Ưu điểm của việc sử dụng thảo dược trong nuôi tôm

Thảo dược có nhiều ưu điểm so với kháng sinh, bao gồm tính an toàn cao, ít gây tác dụng phụ, và thân thiện với môi trường. Các loại thảo dược phổ biến dùng trong nuôi tôm thường chứa các hoạt chất sinh học có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, và tăng cường hệ miễn dịch cho tôm. Việc sử dụng thảo dược không chỉ giúp phòng và trị bệnh mà còn cải thiện sức khỏe tổng thể của tôm, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

II. Thách Thức Bệnh Hoại Tử Gan Tụy Cấp AHPND Ở Tôm Nuôi

Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) là một trong những thách thức lớn nhất đối với ngành nuôi tôm hiện nay. Bệnh gây ra tỷ lệ chết cao, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và lợi nhuận của người nuôi. Việc hiểu rõ về nguyên nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm, dấu hiệu nhận biết bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm, và các biện pháp phòng ngừa là vô cùng quan trọng. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của các loại thảo dược trong việc phòng và trị bệnh AHPND, từ đó cung cấp giải pháp hữu hiệu cho người nuôi tôm.

2.1. Tác động của AHPND đến ngành nuôi tôm toàn cầu

AHPND đã gây ra thiệt hại kinh tế hàng tỷ đô la cho ngành nuôi tôm toàn cầu. Bệnh lây lan nhanh chóng và khó kiểm soát, gây ra tỷ lệ chết cao ở tôm nuôi. Việc tìm kiếm các giải pháp hiệu quả để phòng và trị bệnh AHPND là vô cùng cấp thiết để bảo vệ ngành nuôi tôm.

2.2. Các yếu tố nguy cơ gây bệnh AHPND

Nhiều yếu tố có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh AHPND ở tôm, bao gồm chất lượng nước kém, mật độ nuôi cao, và sự hiện diện của mầm bệnh trong môi trường. Việc kiểm soát các yếu tố này là rất quan trọng để phòng ngừa bệnh AHPND. Theo báo cáo tổng kết bệnh tôm của Tổng cục thủy sản, trong năm 2012 cả nước có khoảng 100,776ha diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh, bao gồm AHPND chiếm khoảng 46,093ha còn lại dịch bệnh đốm trắng, đầu vàng.

2.3. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán AHPND

Tôm bị bệnh AHPND thường có các triệu chứng như giảm ăn, gan tụy teo nhỏ, nhạt màu, và mềm vỏ. Chẩn đoán AHPND thường dựa trên các triệu chứng lâm sàng, kết quả xét nghiệm mô bệnh học, và xét nghiệm PCR để xác định sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Dụng Thảo Dược Phòng Trị AHPND

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp tiếp cận đa chiều để đánh giá tác dụng của các loại thảo dược trong phòng và trị bệnh AHPND. Các phương pháp bao gồm: (1) Kiểm tra gen độc lực của vi khuẩn V.020 bằng kỹ thuật sinh học phân tử, (2) Thử nghiệm hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm, (3) Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong điều kiện phòng thí nghiệm, và (4) Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong quy mô thực nghiệm (pilot). Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng các loại thảo dược trong thực tiễn nuôi tôm.

3.1. Tuyển chọn và chuẩn bị mẫu thảo dược

Nghiên cứu lựa chọn các loại thảo dược có tiềm năng kháng khuẩn và tăng cường hệ miễn dịch cho tôm, bao gồm Thồm lồm, Ké hoa vàng, Nghệ, Khổ sâm, Thầu dầu và Đơn buốt. Các mẫu thảo dược được thu thập, làm sạch, và chiết xuất để thu được dịch chiết thô.

3.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn invitro

Dịch chiết thô của các loại thảo dược được thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn invitro đối với vi khuẩn gây bệnh AHPND. Phương pháp thử nghiệm bao gồm xác định đường kính vòng vô khuẩn và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).

3.3. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh trên tôm

Tôm được cho ăn thức ăn có bổ sung dịch chiết thô của các loại thảo dược hoặc được ngâm trong dung dịch dịch chiết thô. Sau đó, tôm được gây nhiễm vi khuẩn gây bệnh AHPND và theo dõi tỷ lệ sống, triệu chứng lâm sàng, và kết quả xét nghiệm mô bệnh học.

IV. Kết Quả Tác Dụng Của Thảo Dược Với Bệnh Hoại Tử Gan Tụy

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số loại thảo dược có tác dụng kháng khuẩn và phòng trị bệnh AHPND ở tôm. Tác dụng của thảo dược đối với hệ tiêu hóa của tôm và khả năng thảo dược tăng cường sức đề kháng cho tôm là những yếu tố quan trọng góp phần vào hiệu quả phòng trị bệnh. Nghiên cứu này đã xác định được một số loại thảo dược tiềm năng có thể được sử dụng để thay thế kháng sinh trong nuôi tôm.

4.1. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thô

Dịch chiết thô từ thầu dầu và thồm lồm có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn V.020 gây bệnh AHPND trên tôm nuôi nước lợ. Dịch chiết thô ethanol thu được từ thân lá cây thồm lồm có hiệu quả diệt vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND với đường kính vòng vô khuẩn đạt 19,8- 20,6 mm khi sử dụng nồng độ 66,7-200 µg/khoanh/20 µl.

4.2. Hiệu quả phòng bệnh AHPND qua đường ăn

Sản phẩm dịch chiết thô thầu dầu và thồm lồm không có hiệu quả phòng bệnh AHPND qua đường ăn với nồng độ lần lượt tương ứng 25-30g dịch thô/100kg tôm và 35 -40g dịch thô/100kg tôm.

4.3. Hiệu quả diệt khuẩn trong môi trường nước

Sản phẩm dịch chiết thô thồm lồm có hiệu quả diệt khuẩn V.parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng phương thức bổ sung vào môi trường nước với nồng độ 30g/m3. Sản phẩm dịch chiết thô thồm lồm sử dụng liều ngâm 30 g/m3, bổ sung vào 2 thời điểm (lần 1, bắt đầu công cường độc vi khuẩn với mật độ 105-106 cfu/ml và lần 2 cách lần 1 là 24 h) có hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống 60% so với lô đối chứng dương 0%.

V. Ứng Dụng Kinh Nghiệm Sử Dụng Thảo Dược Trong Phòng Trị AHPND

Nghiên cứu này cung cấp kinh nghiệm sử dụng thảo dược trong phòng trị bệnh cho tôm, đặc biệt là bệnh AHPND. Việc áp dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn nuôi tôm có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh tật và nâng cao hiệu quả sản xuất. Cách sử dụng thảo dược hiệu quả cho tôm cần được nghiên cứu và tối ưu hóa để đạt được kết quả tốt nhất.

5.1. Ứng dụng dịch chiết thô thồm lồm trong ao nuôi

Sử dụng sản phẩm dịch chiết thô thồm lồm (25g/100kg tôm) trộn vào thức ăn cho tôm ăn liên tục trong 7 ngày có hiệu quả phòng bệnh trong trường hợp xuất hiện tác nhân (V. parahaemolyticus) gây bệnh AHPND ngay sau khi được ăn chế phẩm. Sử dụng chế phẩm cho tôm ăn trong 14 ngày hoặc ăn ngay thời điểm xuất hiện tác nhân gây bệnh AHPND (mật độ vi khuẩn cao 105-106cfu/mL) không có hiệu quả phòng trị bệnh.

5.2. Bổ sung dịch chiết thô vào môi trường nước

Dịch chiết thô thồm lồm có khả năng diệt tác nhân gây bệnh AHPND trong môi trường nước tốt, tỷ lệ tôm sống đạt 74% khi sử dụng chế phẩm nồng độ 30g/m3, 64% khi sử dụng chế phẩm 25g/m3 và 0% khi không sử dụng chế phẩm.

VI. Kết Luận Tiềm Năng Của Thảo Dược Trong Nuôi Tôm Bền Vững

Nghiên cứu này khẳng định tiềm năng của thảo dược trong việc phòng và trị bệnh AHPND ở tôm, góp phần vào nuôi tôm bền vững bằng thảo dược. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thảo dược hiệu quả sẽ giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào kháng sinh và nâng cao chất lượng sản phẩm tôm. Hiệu quả kinh tế của việc sử dụng thảo dược trong nuôi tôm cũng cần được đánh giá để khuyến khích người nuôi áp dụng rộng rãi.

6.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần lựa chọn thêm thảo dược đưa vào thử nghiệm, nhằm bổ sung thêm loài thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn cao. Ứng dụng chế phẩm từ dịch chiết thô thảo dược thồm lồm vào mô hình ao nuôi ở thực địa bằng 2 phương thức bổ sung vào thức ăn để phòng bệnh và bổ sung vào nước khi xác định sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh trong nước nuôi.

6.2. Đề xuất cho ngành nuôi tôm

Khuyến khích người nuôi tôm áp dụng các biện pháp phòng bệnh tổng hợp, bao gồm sử dụng thảo dược, quản lý chất lượng nước, và chọn giống tôm khỏe mạnh. Cần có chính sách hỗ trợ và khuyến khích nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thảo dược cho nuôi tôm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu hiện sản xuất khoảng 80 triệu tấn sản phẩm mỗi năm với tốc độ tăng trưởng bình quân trên 7% mỗi năm. Tại Việt Nam, hoạt động nuôi tôm nước lợ đóng vai trò trụ cột trong nền kinh tế nông nghiệp, từng mang lại kim ngạch xuất khẩu 6,57 tỷ USD vào năm 2015 và tạo việc làm cho hàng triệu lao động. Tuy nhiên, sự phát triển thâm canh với mật độ cao đã làm bùng phát nhiều dịch bệnh nguy hiểm, đặc biệt là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND). Theo thống kê của ngành thủy sản năm 2012, cả nước có 100.776 ha diện tích nuôi tôm bị thiệt hại, trong đó diện tích tôm chết do AHPND lên tới 46.093 ha (chiếm gần 46% tổng diện tích thiệt hại).

Việc lạm dụng kháng sinh hóa dược trong thời gian dài đã gây ra hiện tượng kháng thuốc nghiêm trọng và đe dọa an toàn vệ sinh thực phẩm. Trước thực trạng đó, đề tài tập trung giải quyết vấn đề tìm kiếm nguồn dược liệu tự nhiên thay thế kháng sinh trong nuôi tôm. Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là đánh giá hoạt tính kháng khuẩn in vitro của 6 loại thảo dược bản địa và xác định hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng ở quy mô phòng thí nghiệm và mô hình thực nghiệm pilot.

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh Thủy sản miền Bắc thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, phối hợp cùng Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên với nguồn thảo dược thu hái tại tỉnh Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi xác định được dịch chiết thôm lồm có khả năng nâng tỷ lệ sống của tôm nhiễm bệnh từ 0% lên tới 74%, mở ra giải pháp phòng trị bệnh sinh học bền vững và an toàn cho ngành tôm Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên lý thuyết cơ chế bệnh sinh vi sinh vật thủy sản và dược lý học thực vật. Về cơ chế bệnh sinh, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm do các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang plasmid chứa gen độc lực pirABvp gây ra, làm thoái hóa và bong tróc tế bào biểu mô ống gan tụy.

Về mặt dược lý, các hợp chất thiên nhiên thứ cấp trong thực vật như polyphenol, flavonoid, terpenoid, tannin và alkaloid sở hữu hoạt tính kháng sinh thực vật (phytocide), có khả năng phá vỡ cấu trúc màng tế bào vi khuẩn gram âm và ức chế độc tố sinh học. Mô hình nghiên cứu áp dụng quy trình đánh giá sàng lọc kép: thử nghiệm kháng sinh đồ in vitro theo chuẩn Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng thí nghiệm (CLSI M31-A2) kết hợp với thử nghiệm cảm nhiễm in vivo trên tôm sống. Các khái niệm cốt lõi bao gồm: đường kính vòng vô khuẩn, liều gây nhiễm vi khuẩn (cfu/ml) và tỷ lệ sống tích lũy của tôm thí nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ 6 loại thảo dược bản địa gồm: Ké hoa vàng (mẫu M1), Khổ sâm (mẫu M2), Nghệ (mẫu M3), Thồm lồm (mẫu M4), Thầu dầu (mẫu M5) và Đơn buốt (mẫu M6). Dược liệu sau khi thu hái được sấy khô ở nhiệt độ 40-50 độ C đến khối lượng không đổi, sau đó chiết kiệt bằng dung môi ethanol 5 lần ở nhiệt độ thường và cất quay thu cặn chiết thô.

Cỡ mẫu và quy trình chọn mẫu được thực hiện nghiêm ngặt:

• Chủng vi khuẩn V.020 mang gen độc lực gây bệnh AHPND được nuôi cấy tăng sinh đạt mật độ 10 mũ 8 cfu/ml cho thử nghiệm in vitro và 10 mũ 5 đến 10 mũ 6 cfu/ml cho thử nghiệm gây nhiễm in vivo.
• Tôm thẻ chân trắng khỏe mạnh, phản xạ nhanh, cỡ đồng đều khoảng 3 gam/con và âm tính với virus WSSV, YHV, Taura và tác nhân AHPND. Mật độ thả nuôi là 20 con/bể ở quy mô phòng thí nghiệm và 100 con/bể ở quy mô pilot (thể tích bể 300 lít, độ mặn 10-12‰).

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích: Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR với cặp mồi AP3 nhằm khuếch đại chính xác đoạn gen mục tiêu 336 bp để khẳng định chủng gây bệnh. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kirby-Bauer trên thạch Mueller Hinton Agar bổ sung 2% NaCl được chọn để định lượng chính xác độ nhạy kháng khuẩn. Toàn bộ số liệu được phân tích ngẫu nhiên lặp lại 2 lần bằng phần mềm Excel 2011 và GraphPad với mức ý nghĩa thống kê p < 0,05. Nghiên cứu hoàn thành năm 2017 trong khuôn khổ Chương trình Công nghệ sinh học Thủy sản tầm nhìn 2020 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 3 phát hiện khoa học mang tính đột phá:

Thứ nhất, trong thử nghiệm in vitro, dịch chiết ethanol cây thồm lồm (mẫu M4) thể hiện khả năng tiêu diệt vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V.020 mạnh nhất trong 6 loại thảo dược. Ở các nồng độ từ 40 µg đến 200 µg/khoanh giấy, đường kính vòng vô khuẩn của thồm lồm đạt từ 15,3 mm đến 20,6 mm, tương đương hiệu lực của kháng sinh đối chứng Doxycycline 30 µg (đạt 21,8 mm). Mẫu thầu dầu và nghệ có độ nhạy trung bình với đường kính lần lượt là 15,3 mm và 14,4 mm ở liều 200 µg. Các mẫu ké hoa vàng, khổ sâm và đơn buốt không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn (đường kính vô khuẩn 0 mm).

Thứ hai, ở quy mô thực nghiệm pilot, việc bổ sung dịch chiết thồm lồm trực tiếp vào môi trường nước nuôi tôm mang lại hiệu quả bảo hộ vượt bậc. Khi sử dụng liều ngâm 30 g/m3 chia làm 2 lần (lần 1 lúc công cường độc và lần 2 cách 24 giờ), tỷ lệ sống của tôm đạt 74%. Ở liều 25 g/m3, tỷ lệ sống đạt 64%. Trong khi đó, lô đối chứng dương không sử dụng thảo dược có tỷ lệ chết 100% chỉ sau 3 ngày nhiễm vi khuẩn.

Thứ ba, nghiên cứu làm sáng tỏ ảnh hưởng của phương thức bổ sung qua thức ăn. Cho tôm ăn thức ăn trộn dịch chiết thồm lồm (25-30 g/100kg tôm) liên tục 7 ngày có tác dụng phòng bệnh tốt nếu tác nhân vi khuẩn xuất hiện ngay sau đó. Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian cho ăn lên 14 ngày hoặc cho ăn tại thời điểm vi khuẩn đã bùng phát mật độ cao (10 mũ 5 đến 10 mũ 6 cfu/ml), phương pháp trộn thức ăn không mang lại hiệu quả do tôm giảm bắt mồi và có hiện tượng ăn thịt lẫn nhau trong đàn.

Thảo luận kết quả

Khả năng kháng khuẩn vượt trội của cây thồm lồm có được là nhờ hàm lượng cao các dẫn xuất flavonoid và polyphenol trong thân lá, giúp phá vỡ màng sinh chất và làm bất hoạt ngoại độc tố của vi khuẩn Vibrio. Khi so sánh với các nghiên cứu trước đây về thảo dược trị bệnh AHPND, hoạt tính của thồm lồm (vòng vô khuẩn 20,6 mm) cao hơn hẳn so với dịch chiết lá sim (18,0 mm), hạt sim (13,33 mm), lá ổi (18,3 mm) và lá trầu không (16,3 mm).

Về mặt trực quan hóa số liệu, các phát hiện này có thể được trình bày rõ nét thông qua biểu đồ cột so sánh đường kính vòng vô khuẩn giữa 6 loại dịch chiết thảo dược và biểu đồ đường biểu diễn tỷ lệ sống sót tích lũy theo thời gian từ ngày 1 đến ngày 14 giữa các nghiệm thức. Kết quả khẳng định việc xử lý môi trường nước bằng dịch chiết thảo dược là hướng can thiệp tối ưu để khống chế mầm bệnh kịp thời trước khi vi khuẩn xâm nhập vào dạ dày và phá hủy gan tụy tôm.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm, 4 giải pháp hành động cụ thể được đề xuất nhằm ứng dụng thảo dược vào thực tiễn sản xuất:

1. Ứng dụng quy trình xử lý nước ao nuôi bằng dịch chiết thồm lồm: Tiến hành tạt dung dịch chiết thô thồm lồm nồng độ 25-30 g/m3 trực tiếp xuống ao khi phát hiện mật độ Vibrio tổng số vượt ngưỡng an toàn (trên 10 mũ 3 cfu/ml), xử lý 2 lần cách nhau 24 giờ để đạt mục tiêu duy trì tỷ lệ sống của tôm trên 70% trong các đợt dịch. Chủ thể thực hiện: Hộ nuôi tôm và hợp tác xã thủy sản nước lợ, áp dụng ngay trong các chu kỳ nuôi từ năm 2026.

2. Cải tiến kỹ thuật bào chế thức ăn chứa thảo dược: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi bọc hoặc bổ sung chất dẫn dụ như dầu gan mực và acid amin để khử vị ngái của thảo dược, cho ăn phòng định kỳ với liều lượng 20-25 g/100kg tôm trong 5-7 ngày trước giai đoạn nhạy cảm (10-45 ngày tuổi). Chủ thể thực hiện: Các doanh nghiệp sản xuất thức ăn thủy sản, lộ trình hoàn thiện công thức trong 12-18 tháng.

3. Chuẩn hóa quy trình chiết xuất cao thảo dược quy mô công nghiệp: Thiết lập dây chuyền chiết xuất ethanol hồi lưu ở nhiệt độ 45-50 độ C để tối ưu hóa hàm lượng polyphenol và flavonoid, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm thảo dược dạng bột hòa tan với hạn sử dụng trên 12 tháng. Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu chuyên ngành và công ty dược thú y.

4. Xây dựng vùng chuyên canh dược liệu thồm lồm: Quy hoạch vùng trồng thồm lồm hữu cơ tại các tỉnh trung du miền núi phía Bắc nhằm đạt sản lượng 15-20 tấn sinh khối tươi/ha/năm giai đoạn 2026-2030, đảm bảo nguồn nguyên liệu đầu vào ổn định và giá thành thấp. Chủ thể thực hiện: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn các địa phương phối hợp cùng doanh nghiệp chế biến.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Các nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Thú y - Thủy sản: Khai thác cơ sở dữ liệu về cơ chế kháng khuẩn của thảo dược, quy trình tinh chiết hoạt chất và phương pháp chuẩn hóa mô hình cảm nhiễm AHPND bằng kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ công tác đào tạo và nghiên cứu chuyên sâu.
• Kỹ sư thủy sản và chủ trang trại nuôi tôm nước lợ: Áp dụng trực tiếp phác đồ xử lý môi trường nước bằng thảo dược với liều lượng 30 g/m3 để giảm thiểu tỷ lệ hao hụt tôm nuôi xuống dưới 30%, thay thế hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh hóa dược.
• Doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và chế phẩm sinh học: Sử dụng công thức và dữ liệu thử nghiệm pilot của đề tài để phát triển, đăng ký lưu hành các dòng sản phẩm thảo dược trị bệnh hoại tử gan tụy có nguồn gốc tự nhiên.
• Cán bộ quản lý dịch bệnh và khuyến nông thủy sản: Tham khảo căn cứ khoa học để xây dựng tài liệu hướng dẫn quản lý sức khỏe tôm tổng hợp (IPM), tuyên truyền giải pháp nuôi tôm an toàn sinh học và không dư lượng kháng sinh cho cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

Dịch chiết cây thồm lồm có hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh AHPND ở mức độ nào so với kháng sinh? Thử nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết thô ethanol từ cây thồm lồm nồng độ 200 µg tạo đường kính vòng vô khuẩn 20,6 mm đối với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V.020. Mức độ này tiệm cận trực tiếp hiệu quả của kháng sinh chuyên dụng Doxycycline 30 µg (đạt 21,8 mm), chứng minh thảo dược có dược lực rất mạnh trong việc ức chế tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp.

Vì sao việc trộn dịch chiết thảo dược vào thức ăn kéo dài trên 7 ngày lại không mang lại hiệu quả cao? Dịch chiết thô có mùi vị đặc trưng khiến tôm giảm bắt mồi và bỏ ăn. Trong thí nghiệm, tôm không ăn thức ăn dẫn đến hiện tượng đói, suy kiệt và ăn thịt lẫn nhau với tỷ lệ hao hụt từ 47,6% đến 55% trước khi gây nhiễm. Khi gặp mật độ vi khuẩn 10 mũ 5 đến 10 mũ 6 cfu/ml, tôm bị suy giảm miễn dịch nên tỷ lệ chết tăng cao.

Quá trình chiết xuất và nguồn nguyên liệu cây thồm lồm tại Việt Nam có thuận lợi không? Cây thồm lồm là loài thực vật mọc hoang dã rất phổ biến tại nhiều địa phương như Thái Nguyên và các tỉnh trung du phía Bắc. Quá trình chiết xuất thô sử dụng dung môi ethanol ở nhiệt độ phòng và thu hồi cặn chiết ở 40-50 độ C có quy trình kỹ thuật đơn giản, tỷ lệ thu hồi cao, hoàn toàn khả thi để ứng dụng sản xuất ở quy mô trang trại hoặc công nghiệp.

Ngoài thồm lồm, các loại thảo dược khác trong nghiên cứu thể hiện hoạt tính ra sao? Trong số 6 loại thảo dược được kiểm tra, dịch chiết thầu dầu và nghệ thể hiện hoạt tính kháng khuẩn ở mức trung bình với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt đạt 15,3 mm và 14,4 mm ở liều 200 µg. Trong khi đó, ké hoa vàng, khổ sâm và đơn buốt không thể hiện hoạt tính ức chế đối với chủng vi khuẩn V.020 (đường kính vô khuẩn đạt 0 mm).

Phương pháp tạt dịch chiết thảo dược vào môi trường nước có ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái ao nuôi không? Dịch chiết thảo dược thồm lồm có nguồn gốc hoàn toàn tự nhiên, giàu hoạt chất sinh học dễ phân hủy sinh học và không để lại tồn dư độc hại trong nước hay mô tôm. Ở liều lượng khuyến nghị 25-30 g/m3, dịch chiết vừa tiêu diệt chọn lọc mầm bệnh Vibrio trong nước vừa duy trì độ an toàn cho hệ vi sinh vật có lợi trong môi trường ao nuôi.

Kết luận

• Luận văn đã xác định dịch chiết thô ethanol từ thân lá cây thồm lồm có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trong 6 loại thảo dược khảo sát, tạo đường kính vòng vô khuẩn 20,6 mm đối với chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND.
• Xác lập phương thức bổ sung dịch chiết thồm lồm vào nước nuôi tôm ở nồng độ 30 g/m3 (2 lần cách nhau 24 giờ) giúp nâng tỷ lệ sống của tôm đạt 74% ở quy mô thực nghiệm pilot, vượt trội so với mức chết 100% ở đối chứng.
• Đánh giá toàn diện giới hạn của phương thức trộn thức ăn truyền thống và chỉ ra nguyên nhân giảm ăn, tạo tiền đề để cải tiến công nghệ vi bọc thảo dược trong tương lai.
• Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm sinh học tự nhiên thay thế kháng sinh hóa dược, góp phần kiểm soát hiệu quả dịch bệnh nguy hiểm trong ngành nuôi tôm nước lợ.
• Khuyến nghị tiếp tục thử nghiệm diện rộng tại các ao nuôi thương phẩm trong giai đoạn 2026-2027 và thương mại hóa chế phẩm thảo dược phục vụ chuỗi giá trị tôm xuất khẩu bền vững.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là tìm ra nguồn dược liệu bản địa thồm lồm có hiệu lực cao trong phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm. Để tiếp cận trọn vẹn quy trình công nghệ và ứng dụng ngay vào vụ nuôi thực tế, quý độc giả và các đơn vị sản xuất hãy liên hệ trực tiếp với cơ sở đào tạo để nhận chuyển giao kỹ thuật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP Ở TÔM Ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: 1. Huỳnh Thị Mỹ Lệ 2. Phan Thị Vân NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Huyền i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ và PGS.TS Phan Thị Vân. Chân thành cảm ơn Ban Đào tạo sau đại học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú Y và Phòng Nghiên cứu Bệnh Thủy sản - Viện Nghiên cứu Nuôi trông Thủy sản I đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Cuối cùng xin chân thành cảm ơn đơn vị tài trợ kinh phí để tôi có thể hoàn thiện nghiên cứu.

Luận văn này được hoàn thành dưới sự hỗ trợ kinh phí thuộc đề tài Thủy sản do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phê duyệt thuộc chương trình công nghệ sinh học Thủy sản tầm nhìn 2020 (Mã số 04/HD-KHCN). Hà Nội, ngày tháng năm2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Huyền ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục từ viết tắt .v Danh mục bảng.

vi Danh mục hình. vii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài.

Mục tiêu nghiên cứu. Tổng quan tài liệu. Tình hình nghiên cứu bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi. Trên thế giới.

Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong NTTS. Trên thế giới. Tại Việt Nam. Một số loại thảo dược được lựa chọn nghiên cứu.

Ké hoa vàng. Phương pháp nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Kiểm tra gen độc lực của vi khuẩn V.020 bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Thử nghiệm hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm.

Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong quy mô thực nghiệm (pilot). Phương pháp xử lý và phân tích số liệu. Kết quả nghiên cứu và thảo luận.

Xác nhận chủng vi khuẩn gây bệnh ahpnd bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Xác định hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô thảo dược trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm. Xác định hoạt tính của dịch chiết thô thảo dược trong phòng trị bệnh ahpnd ở tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào thức ăn cho tôm ăn.

Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào môi trường nước nuôi tôm. Xác định hoạt tính của dịch chiết thô thồm lồm trong phòng trị bệnh ahpnd trên tôm ở quy mô thực nghiệm (PILOT). Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào môi trường nước nuôi tôm.

Kết luận và kiến nghị. 50 Tài liệu tham khảo. 51 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease BVTV Bảo vệ thực vật ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long DMSO Dimethyl sulfoxide HPV Hepatopancreas IMNV Infectious Myoneaosis Virus MHA Mueller Hinton Agar MPV Monoden Baculovirus NB Nutrient Broth NHP Necrotizing Heptopancrcatitis NTTS Nuôi trồng thủy sản TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts TSV Taura Syndrome Virus WSSV White spot syndrome virus YHV Yellow head virus v DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Phân loại terpenoid dựa theo liên kết mắt xích.

Danh mục thảo dược được chiết xuất dạng thô sử dụng trong nghiên cứu. Nồng độ mỗi loại chiết phẩm thô trong khoanh giấy lập kháng sinh đồ. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả dịch chiết thô đối với bệnh AHPND ở tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả dịch chiết thô thồm lồm đối với bệnh AHPND ở tôm quy mô thực nghiệm (pilot).

Tác dụng diệt vi khuẩn gây bệnh AHPND của dịch chiết thô. Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào thức ăn cho tôm ăn trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào môi trường nước nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND trong quá trình thí nghiệm (khi sử dụng dịch chiết thô thân lá cây thồm lồm) (%).

Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn ở quy mô thực nghiệm (pilot). Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn 7 ngày liên tục trước khi công cường độc (%). Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn 7 ngày liên tục, công cường độc ngày thứ 8 và tiếp tục cho ăn thức ăn chứa dịch chiết thô 7 ngày tiếp theo (%). Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND khi công cường độc và cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô thồm lồm cùng 1 thời điểm (%).

Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào môi trường nước nuôi tôm ở quy mô thực nghiệm (pilot). Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào nước ở 2 thời điểm (lần 1 ngay khi công cường độc, lần 2 cách lần 1 là 24h) (%). 48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2. Hiện tượng thoái hoá gan tuỵ cấp tính với mô gan tụy bị phá hủy.

Trường hợp bình thường với tế bào phân chia. Trường hợp bất thường thiếu sự phân chia tế bào. Trường hợp bình thường có sự hiện diện của tế bào B, F. Trường hợp bất thường không có sự hiện diện của tế bào B, F.

Tế bào có nhân lớn bất thường ở giai đoạn đầu của AHPND. Nhiễm khuẩn thứ cấp ở giai đoạn sau. Tôm sú bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính có gan tụy teo nhỏ. Tôm sú bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính có gan tụy nhạt màu so với bình thường.

Ké hoa vàng. Cây thồm lồm. Kết quả xác định chủng vi khuẩn gây AHPND bằng kỹ thuật PCR. Chuẩn bị pha dịch chiết thô lập kháng sinh đồ (A,B), vòng vô khuẩn của dịch chiết thô đối với vi khuẩn gây bệnh AHPND ở tôm (C,D và E).

Tỷ lệ tôm chết khi cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô M4 và M5 (%). Mẫu phân tích sau khi công cường độc vi khuẩn gây bệnh AHPND lên tôm thí nghiệm (1,2, và 3 là mẫu thu thuộc lô sử dụng thảo dược M4, 4,5 và 6 mẫu thu thuộc lô sử dụng thảo dược M5, 7 và 8 thuộc lô đối chứng âm). Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung chế phẩm M4 và M5 vào nước (%). Thử nghiệm hiệu quả hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh AHPND trong phòng thí nghiệm ướt.

Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn 7 ngày liên tục trước khi công cường độc (%). Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn 7 ngày liên tục, công cường độc ngày thứ 8 và tiếp tục cho ăn thức ăn chứa dịch chiết thô 7 ngày tiếp theo (%). Tỷ lệ tôm chết khi công cường độc và cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô thồm lồm cùng 1 thời điểm (%). Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào nước ở 2 thời điểm (lần 1 ngay khi công cường độc, lần 2 cách lần 1 là 24h) (%).

47 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Huyền Tên Luận văn: Nghiên cứu tác dụng của một số loại thảo dược trong phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm. Ngành: Thú Y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1. Mục đích nghiên cứu Xác định được loại thảo dược có hiệu quả phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi. Đối tượng nghiên cứu Tôm nuôi nước lợ, vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp và sáu loại thảo dược bao gồm: Thồm lồm, Ké hoa vàng, Nghệ, Khổ sâm, Thầu dầu và Đơn buốt.

Phương pháp nghiên cứu - Kiểm tra gen độc lực của vi khuẩn V.020 bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Thử nghiệm hoạt tính của các mẫu dịch thô trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm. - Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của chế phẩm trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của chế phẩm ở quy mô thực nghiệm (pilot).

Một số kết quả chính và kết luận Hoàn thành đề tài chúng tôi có một số kết quả chính và kết luận sau:  Trong điều kiện invitro - Sản phẩm dịch chiết thô từ thầu dầu và thồm lồm có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn V.020 gây bệnh AHPND trên tôm nuôi nước lợ. - Dịch chiết thô ethanol thu được từ thân lá cây thồm lồm có hiệu quả diệt vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND với đường kính vòng vô khuẩn đạt 19,8- 20,6 mm khi sử dụng nồng độ 66,7-200 µg/khoanh/20 µl.