Khóa luận nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết lá dâu tại Trường Đại học Y Dược

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây dâu Morus Alba, mở ra hướng ứng dụng tiềm năng trong y học.

• Tác giả: Bùi Trà My
• Người hướng dẫn: PGS.TS Bùi Thanh Tùng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Y Dược
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây dâu (Morus Alba L.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bệnh viêm đại tràng
• 1.2. Yếu tố nguy cơ của bệnh viêm đại tràng
• 1.3. Cơ chế bệnh sinh
• 1.4. Biến chứng của bệnh viêm đại tràng
• 1.5. Các phương pháp điều trị
• 1.6. Các dạng mô hình gây viêm đại tràng
• 1.7. Tổng quan về Stress oxy hóa và phương pháp định lượng MDA
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Mẫu nghiên cứu
• 2.3. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
• 2.4. Động vật thí nghiệm
• 2.5. Thiết bị sử dụng
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Xác định thành phần các chất có trong cao lá dâu
• 2.6.2. Xây dựng mô hình chuột viêm đại tràng
• 2.6.3. Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu
• 2.6.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả cao chiết lá dâu
• 3.2. Kết quả điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu
• 3.2.1. Về cao chiết lá dâu
• 3.2.2. Về khả năng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá tác dụng điều trị của cao chiết từ cây dâu Morus Alba đối với viêm đại tràng. Đây là một bệnh lý phổ biến trong bệnh đường tiêu hóa, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống. Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định các hoạt chất sinh học trong cao chiết và đánh giá hiệu quả của chúng trong việc điều trị viêm.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định các hoạt chất sinh học trong cao chiết từ cây dâu Morus Alba và đánh giá khả năng điều trị viêm đại tràng trên mô hình chuột. Nghiên cứu này cũng hướng đến việc tìm kiếm các giải pháp thay thế từ dược liệu tự nhiên, giảm thiểu tác dụng phụ so với các phương pháp điều trị hiện tại.

1.2. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết xuất thực vật để tạo ra cao chiết từ lá cây dâu Morus Alba. Các mô hình chuột viêm đại tràng được tạo ra bằng cách sử dụng chất cysteamin. Hiệu quả điều trị được đánh giá thông qua các chỉ số sinh hóa và mô học.

II. Tác dụng điều trị

Tác dụng điều trị của cao chiết từ cây dâu Morus Alba được chứng minh thông qua khả năng chống viêm và phục hồi niêm mạc đại tràng. Các hoạt chất sinh học trong cao chiết giúp giảm các triệu chứng viêm đại tràng như đau bụng, tiêu chảy và chảy máu.

2.1. Cơ chế chống viêm

Các hoạt chất sinh học trong cao chiết ức chế sản xuất các cytokine gây viêm như TNF-α và IL-6. Điều này giúp giảm viêm và tổn thương niêm mạc đại tràng. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao chiết có khả năng tăng cường hệ thống miễn dịch tại chỗ.

2.2. Hiệu quả trên mô hình chuột

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ cây dâu Morus Alba giúp giảm đáng kể các triệu chứng viêm đại tràng trên mô hình chuột. Các chỉ số sinh hóa như MDA (malondialdehyde) cũng giảm, chứng tỏ khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ của cao chiết.

III. Viêm đại tràng

Viêm đại tràng là một bệnh lý mãn tính, gây ra các triệu chứng như đau bụng, tiêu chảy và chảy máu. Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm kiếm các giải pháp điều trị từ dược liệu tự nhiên, đặc biệt là cao chiết từ cây dâu Morus Alba.

3.1. Nguyên nhân và triệu chứng

Viêm đại tràng có thể do nhiều yếu tố như di truyền, môi trường và rối loạn miễn dịch. Các triệu chứng bao gồm đau bụng, tiêu chảy kèm máu và mệt mỏi. Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc điều trị kịp thời để ngăn ngừa biến chứng.

3.2. Phương pháp điều trị hiện tại

Các phương pháp điều trị hiện tại bao gồm thuốc chống viêm và ức chế miễn dịch. Tuy nhiên, chúng thường gây tác dụng phụ nghiêm trọng. Nghiên cứu này đề xuất sử dụng cao chiết từ cây dâu Morus Alba như một giải pháp thay thế an toàn và hiệu quả.

IV. Cao chiết từ cây dâu Morus Alba

Cao chiết từ cây dâu Morus Alba là một dược liệu quý, chứa nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng chống viêm và chống oxy hóa. Nghiên cứu này khẳng định tiềm năng của cao chiết trong việc điều trị viêm đại tràng.

4.1. Thành phần hóa học

Cao chiết từ cây dâu Morus Alba chứa các flavonoid, polyphenol và các hoạt chất sinh học khác. Các thành phần này có khả năng chống viêm và bảo vệ niêm mạc đại tràng khỏi tổn thương.

4.2. Ứng dụng trong y học cổ truyền

Trong y học cổ truyền, cây dâu Morus Alba được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý, bao gồm viêm đại tràng. Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng khoa học cho các ứng dụng truyền thống của dược liệu này.

V. Kết luận và đề xuất

Nghiên cứu này khẳng định tiềm năng của cao chiết từ cây dâu Morus Alba trong việc điều trị viêm đại tràng. Các hoạt chất sinh học trong cao chiết giúp giảm viêm và phục hồi niêm mạc đại tràng. Đề xuất tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng rộng rãi trong lâm sàng.

5.1. Giá trị thực tiễn

Nghiên cứu này mang lại giá trị thực tiễn cao, cung cấp một giải pháp điều trị an toàn và hiệu quả từ dược liệu tự nhiên. Cao chiết từ cây dâu Morus Alba có thể trở thành một lựa chọn hàng đầu trong điều trị viêm đại tràng.

5.2. Hướng phát triển tương lai

Cần tiếp tục nghiên cứu để xác định liều lượng tối ưu và cơ chế tác dụng chi tiết của cao chiết. Đồng thời, cần thử nghiệm lâm sàng trên người để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của dược liệu này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong bối cảnh bệnh lý đường tiêu hóa ngày càng gia tăng và trở thành vấn đề sức khỏe đáng báo động trên toàn cầu cũng như tại Việt Nam, viêm đại tràng nổi lên như một rối loạn viêm ruột mạn tính phổ biến. Bệnh có đặc trưng diễn tiến kéo dài, dễ tái phát và gây suy giảm nghiêm trọng chất lượng cuộc sống của người bệnh. Các biến chứng nguy hiểm của viêm đại tràng bao gồm tắc ruột, thủng ruột, phình giãn đại tràng nhiễm độc (Toxic Megacolon) và nguy cơ tiến triển thành ung thư đại tràng theo thời gian mắc bệnh (tỷ lệ tích lũy ước tính 2% sau 10 năm, 8% sau 20 năm và 18% sau 30 năm).

Hiện nay, phác đồ điều trị tân dược chủ yếu sử dụng các nhóm thuốc như dẫn xuất acid 5-aminosalicylic (5-ASA), corticosteroid và các thuốc sinh học ức chế miễn dịch. Tuy nhiên, việc điều trị kéo dài bằng các thuốc này thường đi kèm nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng trên chức năng gan, thận và làm tăng nguy cơ nhiễm trùng cơ hội. Do đó, nhu cầu tìm kiếm các nguồn dược liệu tự nhiên có hiệu quả điều trị, tính an toàn cao và chi phí hợp lý đang là hướng tiếp cận được quan tâm trong y dược học. Cây dâu tằm (Morus alba L.) là loài thực vật phổ biến tại Việt Nam, đã được y học cổ truyền sử dụng từ lâu đời và các nghiên cứu quốc tế ghi nhận nhiều hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, kháng viêm. Tuy nhiên, các dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa học gắn liền với tác dụng điều trị viêm đại tràng của lá dâu tại Việt Nam vẫn còn hạn chế.

Từ thực tế nêu trên, đề tài khóa luận "Nghiên cứu tác dụng điều trị viêm đại tràng từ cao chiết cây dâu (Morus alba L.)" được thực hiện với 2 mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định sơ bộ các hợp chất có trong cao chiết lá dâu (Morus alba L.) bằng phương pháp sắc ký khí ghép hai lần khối phổ (GC-MS/MS).
2. Đánh giá tác dụng điều trị viêm đại tràng của cao chiết lá dâu trên mô hình thực nghiệm chuột nhắt trắng bị gây viêm đại tràng bằng cysteamin.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá dâu (Morus alba L.) thu hái vào tháng 8 năm 2020 tại tỉnh Hà Nam, được định danh thực vật học tại Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội; động vật thực nghiệm là chuột nhắt trắng chủng Swiss (trọng lượng 20 ± 5,0 g) cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tại Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, hoàn thành vào tháng 5 năm 2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình sinh bệnh học

• Cơ chế bệnh sinh viêm đại tràng và stress oxy hóa: Viêm đại tràng mạn tính liên quan mật thiết đến sự mất cân bằng giữa các gốc tự do oxy phản ứng (ROS), nitơ phản ứng (RNS) và hệ thống chống oxy hóa nội sinh. Sự thâm nhiễm bạch cầu trung tính và đại thực bào vào niêm mạc ruột làm bùng phát các chất trung gian gây viêm (TNF-α, IL-1, IL-6) và thúc đẩy quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Malondialdehyde (MDA) là sản phẩm thứ cấp quan trọng của phản ứng peroxy hóa các acid béo chưa no nhiều liên kết đôi (PUFA), đóng vai trò chỉ thị sinh học trực tiếp phản ánh mức độ tổn thương do stress oxy hóa tại mô đại tràng.
• Mô hình gây tổn thương đại tràng bằng Cysteamin: Cysteamin ($\text{HSCH}_2\text{CH}_2\text{NH}_2$) qua đường uống gây độc tế bào biểu mô ruột, ức chế thụ thể hoạt hóa tân sinh peroxisome gamma (PPARγ) – thụ thể có vai trò kháng viêm và ức chế các cytokin tiền viêm, từ đó làm suy giảm hàng rào bảo vệ niêm mạc và khởi phát phản ứng viêm loét cấp/bán cấp tương tự bệnh lý ở người.
• Thuốc đối chứng dương: Sulfasalazine (liều 222 mg/kg), chất kinh điển phối hợp phân tử 5-ASA và sulfapyridine qua liên kết azo, tác động ức chế cyclooxygenase, tổng hợp prostaglandin E2, leukotriene và các cytokin tiền viêm.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Điều chế mẫu: Lá dâu sấy khô dưới 13% ẩm, chiết xuất bằng ethanol 30% theo tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 100 g : 1 L (chiết lặp lại 2 lần), cô thu hồi dung môi tạo cao đặc.
• Phân tích hóa thực vật: Sử dụng hệ thống sắc ký khí ghép hai lần khối phổ GC-MS/MS 7000D Triple Quad (Agilent), cột mao quản DB-5ms ($30\text{ m} \times 250\text{ }\mu\text{m} \times 0,25\text{ }\mu\text{m}$), chương trình nhiệt độ từ 50°C đến 250°C (tăng 10°C/phút), nguồn ion hóa va chạm electron (EI 70 eV). Nhận diện thành phần bằng cách đối chiếu phổ khối với thư viện chuẩn NIST 14.
• Thử nghiệm sinh học in vivo: Chuột Swiss được phân ngẫu nhiên thành 5 lô ($n = 5$ chuột/lô):
  1. Lô 1 (Chứng sinh lý): Chuột bình thường, uống dung dịch NaCl 0,9%.
  2. Lô 2 (Chứng bệnh lý): Gây viêm bằng cysteamin (200 mg/kg thể trọng, uống 2 lần cách nhau 4 giờ ở ngày 1), không dùng thuốc điều trị.
  3. Lô 3 (Chứng thuốc): Gây viêm bằng cysteamin + uống sulfasalazine liều 222 mg/kg/ngày trong 7 ngày.
  4. Lô 4 (Cao lá dâu liều 1): Gây viêm bằng cysteamin + uống cao lá dâu liều 100 mg/kg/ngày trong 7 ngày.
  5. Lô 5 (Cao lá dâu liều 2): Gây viêm bằng cysteamin + uống cao lá dâu liều 200 mg/kg/ngày trong 7 ngày.
• Đánh giá hình thái đại thể và định lượng MDA mô ruột: Sau 7 ngày, mổ bộc lộ và tách đại tràng để quan sát mức độ tổn thương, loét và phù nề. Định lượng MDA dựa trên phản ứng so màu giữa MDA trong dịch đồng thể mô ruột (nghiền trong đệm Tris-HCl tỷ lệ 1:9, bổ sung chất chống oxy hóa BHT) với thuốc thử 1-methyl-2-phenylindole 10,3 mM trong môi trường acid HCl 37% ở 45°C trong 45 phút, đo độ hấp thụ quang học tại bước sóng 586 nm bằng máy đo quang phổ UV-Vis Cary 60, dựng đường chuẩn với chất chuẩn 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMOP).
• Phương pháp xử lý số liệu: Thu thập và xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016, kiểm định sự khác biệt có ý nghĩa ở mức $p < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về bệnh học viêm đại tràng, các mô hình thực nghiệm và đối tượng nghiên cứu:

• Bệnh học viêm đại tràng: Định nghĩa theo AGA (2020) và The Lancet (2017); phân loại 3 thể bệnh (viêm niêm mạc trực tràng, viêm đại tràng trái, viêm toàn bộ đại tràng); các yếu tố nguy cơ (độ tuổi khởi phát 30–40 tuổi, di truyền chiếm 8–14% ở thân nhân độ 1, chủng tộc Do Thái cao gấp 3–5 lần); biến chứng thủng ruột, giãn đại tràng nhiễm độc và ung thư hóa; các phác đồ điều trị nội khoa hiện hành.
• Các mô hình gây viêm đại tràng trên động vật: Tổng quan hơn 20 mô hình (chuột loại gen knockout IL-2, IL-10; chuyển gen IL-7, HLA-B27; viêm tự phát C3H/HejBir; cảm ứng hóa chất bằng acid acetic, DSS, indomethacin, cysteamin...). Phân tích tác dụng sinh bệnh học của cysteamin qua ức chế PPARγ và khởi phát stress oxy hóa.
• Stress oxy hóa và phương pháp định lượng MDA: Vai trò của các gốc tự do ROS, RNS trong peroxy hóa lipid; so sánh phương pháp định lượng MDA trực tiếp (HPLC-UV) và gián tiếp (phản ứng với TBA hoặc thuốc thử chọn lọc 1-methyl-2-phenylindole có cực đại hấp thụ 586 nm).
• Tổng quan về cây dâu (Morus alba L.): Phân loại thực vật học, hình thái, phân bố; tổng hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các nhóm hoạt chất (flavonoid như quercetin 3-(6-malonylglucoside), rutin, isoquercitrin hàm lượng 9,9 mg/g khô; các dẫn xuất moracin, morachalcone, prenylflavane) cùng các tác dụng dược lý hiện đại (chống oxy hóa, bảo vệ gan, hạ đường huyết, kháng ung thư, kháng khuẩn) và công dụng trong y học cổ truyền (vị thuốc tang diệp).

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình chuẩn bị mẫu, thiết bị và phương pháp thực nghiệm:

• Chuẩn bị dược liệu: Thu hái lá dâu tại Hà Nam (8/2020), làm sạch, sấy khô dưới 13% ẩm. 500 g bột lá dâu được chiết với ethanol 30% (tỷ lệ 100 g : 1 L, 2 lần), cô thu hồi dung môi được cao đặc.
• Trang thiết bị và hóa chất: Sử dụng máy GC-MS/MS 7000D Triple Quad (Agilent), máy đo quang Cary 60 UV-Vis, cân phân tích Shimadzu AY 220, máy siêu âm AC-150H; các hóa chất tinh khiết gồm 1-methyl-2-phenylindole, BHT, HCl 37%, TMOP 99%, sulfasalazine 500 mg (Pfizer).
• Quy trình phân tích GC-MS/MS: Cài đặt thông số sắc ký (cột DB-5ms, gradient nhiệt độ 50–250°C) và phổ khối (EI 70 eV, quét dải 100–350 m/z), tra cứu thư viện NIST 14.
• Quy trình tạo mô hình và bố trí lô thử nghiệm: Chuột nhắt Swiss ($20 \pm 5,0\text{ g}$) nhịn ăn 24 giờ trước khi uống cysteamin liều 200 mg/kg (2 lần vào 9h và 13h ngày thứ nhất). Thiết kế 5 lô thử nghiệm ($n = 5$), điều trị liên tục trong 7 ngày qua đường uống.
• Quy trình định lượng MDA: Thu hoạch mô đại tràng, nghiền đồng thể trong đệm Tris-HCl (tỷ lệ 1:9), bổ sung 10 $\mu\text{L}$ BHT 0,5 M, ly tâm lấy dịch trong. Trộn dịch mô với 1-methyl-2-phenylindole 10,3 mM và HCl 37%, ủ 45°C trong 45 phút, ly tâm và đo quang ở bước sóng 586 nm; tính toán theo phương trình đường chuẩn TMOP.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm và thảo luận kết quả:

• Hiệu suất chiết xuất: Từ 500 g lá dâu khô thu được 101,5 g cao đặc, tương ứng hiệu suất chiết đạt 20,3%; hàm ẩm của cao đạt 6,54%. Hiệu suất chiết ở mức trung bình do sử dụng dung môi cồn nồng độ thấp (ethanol 30%).
• Thành phần hóa học qua GC-MS/MS: Nhận diện được các hợp chất chính trong cao chiết lá dâu dựa trên thời gian lưu ($t_R$), công thức phân tử và độ tin cậy đối chiếu thư viện NIST 14.

STT (Pic)	Thời gian lưu ($t_R$, phút)	Tên hợp chất	Độ tin cậy (%)	Công thức phân tử	Phân tử khối (g/mol)
1	11,94	1H-1,2,3-Triazole, 4-methyl-5-(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)-	68,75	$\text{C}_7\text{H}_9\text{N}_5$	163
2	12,32	4H-Benzo[def]carbazole	60,34	$\text{C}_{14}\text{H}_9\text{N}$	191
3	13,12	1H-1,2,3-Triazole, 4-methyl-5-(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)-	68,52	$\text{C}_7\text{H}_9\text{N}_5$	163
4	14,76	Anthracene, 9,10-dihydro-9-(1-methylpropyl)-	66,84	$\text{C}{18}\text{H}{20}$	236
5	15,16	7-Methoxy-2,3-dimethylindole	68,87	$\text{C}{11}\text{H}{13}\text{NO}$	175
6	16,23	Anthracene, 9,10-dihydro-9-(1-methylpropyl)-	61,72	$\text{C}{18}\text{H}{20}$	236
7	16,79	Phenol, 2,5-bis(1-methylethyl)-, acetate	63,92	$\text{C}{14}\text{H}{20}\text{O}_2$	220
8	17,32	Dibenz[b,f][1,4]oxazepine	81,52	$\text{C}_{13}\text{H}_9\text{NO}$	175
9	18,70	6-Methyl-3-[3-oxo-3-phenylprop-1-en-1-yl]chromen-4-one	61,14	$\text{C}{19}\text{H}{14}\text{O}_3$	290
10	27,54	Isophthalic acid, 3,5-difluorophenyl octyl ester	66,25	$\text{C}{22}\text{H}{24}\text{F}_2\text{O}_4$	390

• Kết quả đánh giá hình thái tổn thương đại thể mô đại tràng:
  • Lô chứng sinh lý: Niêm mạc đại tràng nhẵn bóng, màu sắc đồng nhất, không có vết loét.
  • Lô chứng bệnh lý (cysteamin 200 mg/kg): Xuất hiện rõ các ổ loét sâu, xung huyết và hoại tử niêm mạc.
  • Lô chứng thuốc (sulfasalazine 222 mg/kg): Niêm mạc hồi phục tốt, không thấy vết loét hay xuất huyết, chỉ còn phù nề nhẹ.
  • Lô cao lá dâu liều 100 mg/kg và 200 mg/kg: Giảm rõ rệt mức độ tổn thương, chỉ xuất huyết nhẹ và phù nề nhẹ, không còn ổ loét lớn như lô bệnh lý.
• Kết quả định lượng nồng độ MDA mô ruột:
  • Nồng độ MDA ở lô bệnh lý tăng cao rõ rệt so với lô chứng sinh lý ($p < 0,05$), phản ánh mức độ stress oxy hóa và peroxy hóa lipid nghiêm trọng do cysteamin gây ra.
  • Ở lô chứng thuốc (sulfasalazine), nồng độ MDA giảm có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý ($p < 0,05$).
  • Ở cả hai lô dùng cao lá dâu liều 100 mg/kg và 200 mg/kg, nồng độ MDA trong mô ruột đều giảm rõ rệt và có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý ($p < 0,05$), đạt mức tương đương với nhóm điều trị bằng thuốc đối chứng sulfasalazine.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Chương 4 đúc kết các kết quả đạt được và định hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Kết luận: Xác định sơ bộ 10 hợp chất trong cao chiết lá dâu bằng GC-MS/MS; chứng minh cao chiết lá dâu ở hai mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg có tác dụng làm giảm tổn thương đại thể và ức chế peroxy hóa lipid (giảm MDA) trên mô hình viêm đại tràng do cysteamin sau 7 ngày điều trị.
• Đề xuất: Tiếp tục nghiên cứu phân lập các hoạt chất chính mang hoạt tính; nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử tác dụng kháng viêm của cao chiết lá dâu.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính đạt được

• Về chiết xuất và thành phần hóa học: Quy trình chiết xuất lá dâu bằng dung môi ethanol 30% thu được hiệu suất 20,3% cao đặc với độ ẩm 6,54%. Phân tích GC-MS/MS đã định danh sơ bộ 10 chất chính, bao gồm các dẫn xuất chromenone, phenol acetate, anthranoid/anthracene, indole, oxazepine và triazole.
• Về hiệu quả điều trị thực nghiệm:
  • Mô hình viêm đại tràng thực nghiệm bằng cysteamin 200 mg/kg trên chuột nhắt trắng được thiết lập thành công với các biểu hiện loét đại thể và gia tăng nồng độ MDA mô ruột có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$).
  • Cao chiết ethanol lá dâu ở cả hai mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể trọng thể hiện tác dụng bảo vệ và hồi phục niêm mạc đại tràng rõ rệt sau 7 ngày điều trị: giảm phù nề, hạn chế xuất huyết, làm liền vết loét trên đại thể.
  • Về mặt hóa sinh, cao lá dâu ở 2 mức liều thử nghiệm làm giảm nồng độ MDA mô ruột có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý ($p < 0,05$), cho hiệu quả ức chế stress oxy hóa tương đương với thuốc đối chứng dương sulfasalazine (222 mg/kg).

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Kiến nghị tiếp tục triển khai các nghiên cứu phân lập sâu, tinh chế các hoạt chất đơn lẻ từ cao chiết lá dâu để xác định chính xác hoạt chất quyết định tác dụng điều trị viêm đại tràng.
• Đề xuất mở rộng nghiên cứu cơ chế tác dụng ở mức độ phân tử, bao gồm đánh giá sự thay đổi biểu hiện của các cytokin tiền viêm (TNF-α, IL-1, IL-6) và thụ thể PPARγ.

Đóng góp về mặt khoa học

• Đóng góp thêm dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa học bằng kỹ thuật GC-MS/MS đối với nguồn dược liệu lá dâu thu hái tại tỉnh Hà Nam, Việt Nam.
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm dược lý in vivo chứng minh khả năng kháng peroxy hóa lipid và làm giảm tổn thương niêm mạc đại tràng của cao chiết lá dâu trên mô hình chuột cảm ứng bởi cysteamin.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức định tính sơ bộ các hợp chất trong cao chiết toàn phần bằng phương pháp GC-MS/MS thông qua đối chiếu thư viện phổ NIST 14, chưa tiến hành định lượng hàm lượng từng hoạt chất cụ thể.
• Hiệu suất chiết xuất cao đặc còn ở mức trung bình (20,3%) do lựa chọn dung môi ethanol nồng độ thấp (30%).
• Đánh giá tác dụng sinh học mới tập trung vào quan sát đại thể và chỉ số peroxy hóa lipid (nồng độ MDA), chưa khảo sát biến đổi mô bệnh học vi thể (nhuộm HE) cũng như chưa định lượng trực tiếp nồng độ các cytokin gây viêm (TNF-α, IL-1β, IL-6) trong huyết thanh hoặc mô ruột.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Khảo sát tối ưu hóa điều kiện chiết xuất (dung môi, nhiệt độ, thời gian) nhằm nâng cao hiệu suất chiết và hàm lượng hoạt chất có hoạt tính.
• Tiến hành phân lập, xác định cấu trúc hóa học và thử hoạt tính sinh học của các hợp chất đơn lẻ tinh khiết từ lá dâu.
• Bổ sung các đánh giá mô học, biểu hiện gen và cơ chế phân tử điều hòa các con đường tín hiệu viêm và stress oxy hóa của cao chiết lá dâu.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận cung cấp thông tin tham khảo hữu ích cho các đối tượng và định hướng nghiên cứu sau:

• Sinh viên và học viên ngành Dược học, Dược lý – Dược lâm sàng, Dược liệu: Tham khảo quy trình thiết lập mô hình viêm đại tràng thực nghiệm bằng cysteamin trên chuột nhắt trắng; phương pháp đánh giá tổn thương mô và quy trình định lượng chỉ số peroxy hóa lipid MDA bằng thuốc thử 1-methyl-2-phenylindole ở bước sóng 586 nm.
• Nhà nghiên cứu hóa thực vật và phát triển dược liệu: Tham khảo điều kiện phân tích sắc ký khí khối phổ GC-MS/MS (cột DB-5ms, chương trình nhiệt độ và thông số ion hóa EI) trong việc sàng lọc thành phần hóa học của các phân đoạn chiết xuất thảo mộc phức tạp.

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình chiết xuất cao lá dâu trong nghiên cứu được thực hiện như thế nào và đạt hiệu suất bao nhiêu?
Nghiên cứu sử dụng 500 g lá dâu khô (độ ẩm < 13%) cắt nhỏ, chiết xuất bằng dung môi ethanol 30% với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 100 g : 1 L, tiến hành chiết lặp lại 2 lần. Gộp các dịch chiết và loại dung môi bằng phương pháp cô thu được 101,5 g cao đặc lá dâu, đạt hiệu suất chiết 20,3% và hàm ẩm của cao là 6,54%.

2. Mô hình gây bệnh viêm đại tràng thực nghiệm trên chuột được thiết lập bằng phương pháp nào?
Chuột nhắt trắng chủng Swiss ($20 \pm 5,0\text{ g}$) được cho nhịn ăn 1 ngày, sau đó gây viêm đại tràng bằng cách cho uống cysteamin ở mức liều 200 mg/kg thể trọng vào lúc 9h sáng và 13h chiều trong ngày đầu tiên của nghiên cứu (uống 2 lần, mỗi lần cách nhau 4 tiếng).

3. Nghiên cứu bố trí các lô thử nghiệm in vivo như thế nào và dùng mức liều điều trị bao nhiêu?
Chuột được chia thành 5 lô ($n = 5$ chuột/lô), điều trị liên tục trong 7 ngày: Lô 1 (Chứng sinh lý - uống NaCl 0,9%); Lô 2 (Chứng bệnh lý - cysteamin 200 mg/kg); Lô 3 (Chứng thuốc - cysteamin + sulfasalazine 222 mg/kg); Lô 4 (Cao lá dâu liều 1 - cysteamin + cao lá dâu 100 mg/kg); Lô 5 (Cao lá dâu liều 2 - cysteamin + cao lá dâu 200 mg/kg). Dung dịch thuốc và cao được pha uống theo thể tích 0,2 mL/10 g thể trọng chuột.

4. Chỉ số sinh hóa nào được sử dụng để đánh giá stress oxy hóa và kết quả ở các nhóm chuột ra sao?
Nghiên cứu sử dụng chỉ số Malondialdehyde (MDA) trong dịch đồng thể mô ruột để đánh giá mức độ peroxy hóa lipid qua phản ứng với 1-methyl-2-phenylindole ở bước sóng 586 nm. Kết quả cho thấy lô bệnh lý có nồng độ MDA tăng cao có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý ($p < 0,05$). Cả hai lô uống cao lá dâu liều 100 mg/kg và 200 mg/kg cùng lô uống sulfasalazine đều có nồng độ MDA giảm có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý ($p < 0,05$).

5. Phương pháp phân tích nào được dùng để xác định thành phần hóa học của cao lá dâu và đã tìm ra những chất nào?
Nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký khí ghép hai lần khối phổ (GC-MS/MS 7000D Triple Quad của Agilent, cột DB-5ms) kết hợp tra cứu thư viện NIST 14. Kết quả nhận diện sơ bộ 10 hợp chất chính gồm: 1H-1,2,3-Triazole, 4-methyl-5-(5-methyl-1H-pyrazol-3-yl)-; 4H-Benzo[def]carbazole; Anthracene, 9,10-dihydro-9-(1-methylpropyl)-; 7-Methoxy-2,3-dimethylindole; Phenol, 2,5-bis(1-methylethyl)-, acetate; Dibenz[b,f][1,4]oxazepine; 6-Methyl-3-[3-oxo-3-phenylprop-1-en-1-yl]chromen-4-one; Isophthalic acid, 3,5-difluorophenyl octyl ester.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bùi Trà My đã hoàn thành việc khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết ethanol lá dâu (Morus alba L.) bằng kỹ thuật GC-MS/MS và nhận diện được 10 hợp chất chính. Thực nghiệm sinh học trên chuột nhắt trắng chứng minh cao chiết lá dâu ở cả hai mức liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể trọng có khả năng cải thiện rõ rệt tổn thương đại thể và làm giảm nồng độ MDA mô ruột ($p < 0,05$) sau 7 ngày điều trị. Kết quả nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực nghiệm bước đầu khẳng định tiềm năng của dược liệu lá dâu trong việc ức chế stress oxy hóa và hỗ trợ điều trị viêm đại tràng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Bệnh viêm đại tràng.1 Khái niệm Theo Hiệp hội Tiêu hóa Hoa Kỳ năm 2020 (American Gastroenterological Association – AGA): “Viêm đại tràng là một dạng bệnh viêm ruột, ảnh hưởng đến đại tràng và trực tràng, có thể gây đau bụng dữ dội, co rút, tiêu chảy và chảy máu.”[8] Tạp chí The Lancet năm 2017, “Viêm đại tràng là một rối loạn mãn tính của niêm mạc đại tràng, bắt đầu ở trực tràng và thường kéo dài liên tục qua một phần hoặc toàn bộ đại tràng, với triệu chứng đặc trưng là tiêu chảy ra máu.”[46] Như vậy, viêm đại tràng là một dạng bệnh viêm ruột mãn tính xuất hiện ở trực tràng và đại tràng, thường gây ra tình trạng tiêu chảy ra máu 1.2 Triệu chứng Các triệu chứng của viêm loét đại tràng có thể bao gồm từ nhẹ đến nặng và khác nhau ở mỗi người. Các triệu chứng này có thể thay đổi theo thời gian, giai đoạn thuyên giảm, bệnh nhân cảm thấy sức khỏe tốt và không có triệu chứng, xen kẽ giữa những đợt bùng phát. Viêm đại tràng là một dạng bệnh diễn biến tùy thuộc vào cá nhân từng người.

Một số người có thể duy trì tình trạng sức khỏe tốt trong nhiều năm, trong khi một số khác lại bùng phát thường xuyên [17]. Các triệu chứng của bện nhân có thể thay đổi theo quy mô và mức độ ruột bị viêm, nhưng các triệu chứng phổ biến nhất khi bệnh bùng phát bao gồm [17]: - Tiêu chảy: thường kèm theo máu và chất nhày, bệnh nhân có nhu cầu khẩn cấp vào nhà vệ sinh. - Đau quặn bụng: có thể rất nghiêm trọng, thường xảy ra trường khi bệnh nhân đại tiện. - Mệt mỏi: điều này có thể do thiếu máu hoặc mất ngủ khi bệnh nhân phải thức dậy vào ban đêm do đau bụng và tiêu chảy gây ra.

- Thiếu máu: bệnh nhân có thể bị giảm số lượng hồng cầu nếu bị mất máu nhiều hoặc ăn không ngon, gây ra cảm giác mệt mỏi cho bệnh nhân.3 Phân loại Viêm đại tràng thường được phân loại theo mức độ ảnh hưởng của bệnh đến đại tràng. Viêm đại tràng được chia thành 3 loại chính, gồm: viêm niêm mạc trực tràng, viêm đại tràng phía bên trái và viêm toàn bộ đại tràng [17]. Hình 1: Phân loại Viêm đại tràng - Viêm niêm mạc trực tràng: trong viêm niêm mạc trực tràng, chỉ có phần trực tràng bị viêm, các phần còn lại của đại tràng không bị ảnh hưởng và vẫn có thể hoạt động bình thường. Đối với những bệnh nhân dạng này, triệu chứng chính là phân có máu tươi hoặc chất nhày lẫn máu.

Bện nhân có thể bị tiêu chảy, phân bình thường hoặc thậm chí là táo bón, đôi khi cảm thấy cần đi vệ sinh gấp. Do phần trực tràng bị viêm nên nhạy cảm hơn, một số bệnh nhân cảm thấy họ muốn đi vệ sinh nhưng trên thực tế thì ruột của họ là rỗng, không thể cho ra bất cứ thứ gì [17]. - Viêm đại tràng phía bên trái: tình trạng viêm xảy ra ở vùng trực tràng và đại tràng xuống. Các triệu chứng bao gồm tiêu chảy kèm theo máu và chất nhày, đau bụng phía bên trái, đi ngoài gấp và mót rặn [17].

- Viêm toàn bộ đại tràng: trong loại này, tình trạng viêm ảnh hưởng đến hầu hết đại tràng, có thể gây tiêu chảy thường xuyên, kèm theo máu, chất nhày và đôi khi có mủ. Bệnh nhân có thể bị đau bụng dữ dội, co rút, sốt và hụt cân. Trong các đợt phát bệnh nhẹ hơn, triệu chứng chính gồm tiêu chảy hoặc phân lỏng hơn, không có máu [17].4 Yếu tố nguy cơ của bệnh viêm đại tràng.1 Vị trí địa lý, tuổi tác, giới tính Viêm đại tràng phổ biến hơn cả ở hai khu vực Bắc Mỹ và Bắc Âu, và tỉ lệ mắc và lưu hành bệnh thấp nhất ở các nước Nam bán cầu và các nước phía Đông [46]. Thời điểm khởi phát viêm đại tràng cao nhất là từ trên 30 tuổi đến 40 tuổi [16].

Các nghiên cứu cũng đã ghi nhận không rằng giới tính không phải là yếu tố nguy cơ của bệnh viêm đại tràng [16, 27].2 Yếu tố di truyền Đối với viêm đại tràng, tiền sử gia đình là yếu tố quan trọng để đánh giá nguy cơ mắc bệnh. Nguy cơ mắc viêm đại tràng đặc biệt cao khi trong những gia đình có người mắc bệnh: 8 - 14% bệnh nhân có họ hàng gần mắc viêm đại tràng [36]. Ngoài ra, người Do Thái có tỉ lệ mắc viêm loét đại tràng cao hơn từ 3 đến 5 lần so với các dân tộc khác [9]. Điều này cũng chỉ ra cho chúng ta thấy rằng yếu tố di truyền cũng là một trong những yếu tố nguy cơ của viêm loét đại tràng.3 Nhân tố môi trường Tỉ lệ mắc viêm đại tràng là cao hơn ở các nước phát triển so với các nước đang phát triển và ở thành thị so với nông thôn.

Người ta giải thích nguyên nhân là do ở các nước đang phát triển, việc tiếp cận với các dịch vụ y tế và lưu trữ hồ sơ là tốt hơn so với các nước kém phát triển. Hơn nữa, điều kiện vệ sinh được cải thiện đã làm giảm tiếp xúc với các nhiễm khuẩn đường ruột từ khi còn nhỏ, do đó mà hạn chế sự hoàn thiện của hệ thống miễn dịch niêm mạc. Từ đó, có thể dẫn đến những phản ứng miễn dịch không phù hợp khi tiếp xúc với vi sinh vật lây nhiễm xảy ra sau này [46]. Các loại thuốc, chẳng hạn như thuốc tránh thai, liệu pháp thay thế hormone và thuốc chống viêm không steroid đều có liên quan đến việc tăng nguy cơ viêm loét đại tràng, trong khi kháng sinh thì không [46].

Việc cho con bú được cho là làm giảm nguy cơ dẫn đến viêm đại tràng. Dữ liệu được tổng hợp từ 11 nghiên cứu tiền cứu ở châu Âu không tìm thấy mối liên hệ giữa căng thẳng và khởi phát viêm loét đại tràng [25].5 Cơ chế bệnh sinh Viêm đại tràng là một bệnh đa yếu tố, có thể liên quan đến di truyền, rối loạn chức năng tế bào biểu mô, hệ vi sinh vật đường ruột, hệ thống miễn dịch bị suy yếu. Các nghiên cứu liên kết trên toàn bộ hệ gen đã xác định được 200 locus nguy cơ đối với bệnh viêm ruột, với hầu hết các gen ghóp phần gây ra cả viêm đại tràng và bệnh Crohn [26, 33]. Các locus liên quan đến tăng tính nhạy cảm với viêm loét đại tràng bao gồm kháng nguyên bạch cầu người và các gen liên quan đến chức năng rào cản, chẳng hạn như HNF4A và CDH1 [11, 26].

Tuy nhiên, di truyền chỉ giải thích được 7,5% phương sai của bệnh, ít có khả năng dự đoán về kiểu hình và hiện đang được sử dụng hạn chế trên lâm sàng [11, 26]. Trong các bệnh viêm đại tràng, hệ vi sinh vật của bệnh nhân thường kém đa dạng và kém ổn định hơn đáng kể theo thời gian [40]. Sự suy giảm của các vi khuẩn bảo vệ cơ thể như họ vi khuẩn sản xuất các acid béo chuỗi ngắn (SCFA) Ruminococcaceae và Lachnospiraceae cùng với sự gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli và họ Fusobacteriaceae đã được ghi nhận [20]. Tác động chính của chứng loạn khuẩn là có thể làm giảm sức khỏe biểu mô, tăng thêm tình trạng rối loạn chức năng biểu mô và tính nhạy cảm bẩm sinh với viêm đại tràng trên bệnh nhân [40].

Với việc quan sát mô học tình trạng viêm dưới biểu mô, nhiều nghiên cứu đã coi tình trạng suy giảm biểu mô là một yếu tố gây viêm đại tràng [40]. Nguyên nhân dẫn đến sự suy giảm này là do sự thay đổi các chất tiết, chẳng hạn như các peptide kháng khuẩn và chất nhày; hoặc các khiếm khuyết mô học, chẳng hạn như do các mối nối chặt chẽ của biểu mô bị gián đoạn và quá trình tái tạo mô xảy ra lỗi [40]. Khi các rối loạn sinh học xảy ra làm mất khả năng sản xuất SCFA, chất cần thiết cho việc cung cấp năng lượng biểu mô và sản xuất chất nhày, thì nguy cơ mắc viêm đại tràng là rất cao [40]. Trong một số nghiên cứu, sử dụng các chất làm tăng khả năng vận chuyển SCFA đã được chứng minh là có một số tác dụng trong việc điều trị bệnh viêm loét đại tràng [14, 24, 47].

Trong viêm đại tràng hoạt động, môi trường viêm thúc đẩy thời gian tồn tại các tế bào bạch cầu trung tính, những tế bào phản ứng đầu tiên của hệ miễn dịch vốn chỉ tồn tại trong thời gian ngắn [40]. Thời gian sống sót của bạch cầu trung tính tăng lên đồng nghĩa với việc làm tăng hoạt động gây viêm và tổn thương mô 5 của nó thông qua việc giải phóng các protease nền, các cytokin gây viêm và các chất oxy hóa như oxy phản ứng và nitơ phản ứng [40]. Việc tăng cường sản xuất các chất oxy hóa, chất trung gian gây viêm này đã góp phần tích cực vào quá trình khiến bệnh khởi phát và kéo dài phản ứng viêm trong viêm đại tràng.6 Biến chứng của bệnh viêm đại tràng Trong một số trường hợp, viêm đại tràng có thể gây ra thêm những vấn đề về đường ruột. Các biến chứng có thể xảy ra bao gồm: tắc ruột, thủng ruột, Toxic Megacolon, tạo thành lỗ rò và ung thư đại tràng [17].

Tình trạng viêm nhiễm trên ruột có thể dẫn đến đến việc ruột bị thu hẹp lại, hậu quả là phân khó đi qua đại tràng, gây tắc ruột. Trong trường hợp tình trạng viêm lan rộng và nghiêm trọng, các khí trong hệ tiêu hóa có thể bị kẹt lại, khiến đại tràng sưng lên, gây sốt cao cũng như đau và căng ở bụng. Tình trạng này gọi là Toxic Megacolon, khả năng xảy ra là 1/40 bệnh nhân. Toxic Megacolon cần phải nhanh chóng điều trị nếu không rất có thể bệnh nhân cần phải phẫu thuật.

Khi tình trạng viêm diễn ra mạnh hoặc tắc nghẽn nghiêm trọng thì tình trạng thủng ruột có thể xảy ra, đây là một dạng cấp cứu y tế hiếm gặp. Ở những người mắc viêm đại trạng, đặc biệt là trên những bệnh nhân đã từng phẫu thuật, trong một vài trường hợp hiếm hoi có thể phát triển thành lỗ rò kết nối các phần ruột với nhau, với âm đạo và bàng quang [17]. Đặc biệt, đối với những bệnh nhân đã mắc viêm đại tràng nhiều năm thì nguy cơ mắc ung thư là cao hơn bình thường. Nguy cơ này tăng lên theo mức độ bị ảnh hưởng của đại tràng do viêm, và càng nghiêm trong hơn trong trường hợp viêm đại tràng lan tỏa [17].

Nghiên cứu cho thấy, kể từ khi được chẩn đoán, nguy cơ tích lũy để phát triển thành ung thư của bệnh nhân viêm đại tràng là 2% sau 10 năm, 8% sau 20 năm và 18% sau 30 năm [21].