CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ BÒ CẠP: Bò cạp là loài động vật chân khớp đã có từ lâu đời trên thế giới, qua 450 triệu năm tiến hóa, bò cạp không thay đổi nhiều về hình dạng, chỉ là kích thước nhỏ hơn trước. Bò cạp không chỉ thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học bởi đặc điểm hình thái học, tính đa dạng loài, phương tiện sinh thái nguồn gốc cổ xưa mà còn ở các thành phần có hoạt tính sinh học trong nọc độc của chúng [19].1: Bò cạp đen Heterometrus laoticus. Phân bố địa lý: Bò cạp có thể gặp ở mọi miền địa lý trên thế giới, thường xuất hiện ở những vùng ôn đới và nhiệt đới, khoảng 50 độ Nam và Bắc bán cầu.
Chúng sống trong rừng, sa mạc, trong hang và vài loài còn được tìm thấy dưới các tảng đá ở những núi có độ cao 5000 m [3]. Ở Việt Nam bò cạp phân bố khắp nơi trong nước từ đồng bằng đến miền núi trong những khu rừng ẩm ướt và cả hải đảo. Đã phát hiện có bốn họ, đó là: Buthidae , Scorpionidae , họ Chaerilidae và họ Pseudochactidae , trong đó họ Buthidae và Scorpionidae chiếm nhiều nhất. Chúng phân bố như sau: [2, 13, 24] Họ Buthidae: • Lychas mucronatus Fabricius: phân bố ở các tỉnh miền Trung và miền Nam, phát triển mạnh về số lượng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phước).
• Isometrus basilicus Karch: phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Quảng Trị, Bình Định, Khánh Hoà (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú). SVTH: Hoàng Mỹ Quỳnh Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học • Isometrus sp: phân bố ở Nghệ An (Vinh). • Isometrus deharvengi sp: phân bố ở Hòn Chồng, Kiên Giang. Họ Scorpionidae: • Heterometrus spinifer spinifer: phân bố ở Bình Phước (Bù Đốp, Bù Gia Mập, Đồng Phú).
• Heterometrus petersii petersii: ở thành phố Hồ Chí Minh, Bình Thuận, Khánh Hoà, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh. • Heterometrus laoticus Couzijn: ở Thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Đồng Nai (Biên Hoà), An Giang. • Heterometrus cyaneus cyaneus: phân bố ở Thừa Thiên Huế, Quảng Trị. • Heterometrus sp: phân bố ở Sơn La (Mộc Châu), Hà Tây (Ba Vì).
Họ Chaerilidae: • Chaerilus petrzelkai: ở miền nam Việt Nam, đảo Côn Sơn. • Chaerilus Simon, 1877: ở miền Nam Việt Nam. • Chaerilus vietnamicus Lourenco and Zhu, 2008 phân bố ở miền Bắc. • Chaerilus julietteae Lourenco: 2011 phân bố ở miền Nam.
• Chaerilus phami sp: tập trung ở đảo Côn Sơn. Họ Pseudochactidae: • Vietbocap canhi Lourenco & Pham, 2010.canhi Lourenco & Pham, 2010. thienduongensis Lourenco & Pham, 2012. Cả 3 loài này đều được phát hiện ở động Thiên Đường, Phong Nha – Kẻ Bàng thuộc tỉnh Quảng Bình.
Trong đề tài này chúng tôi đề cập đến loài bò cạp đen Heterometrus laoticus phân bố ở An Giang. Bò cạp Heterometrus laoticus còn gọi là bò cạp đen hay bò cạp rừng , chúng hầu hết được tìm thấy ở vùng Nam Bộ. Cơ thể có màu đen hoặc xanh đen, chiều dài trung bình khoảng 10-12 cm [20].2 Nọc độc bò cạp: Là nguồn giàu các chất có hoạt tính sinh học tác dụng trên hệ thống thần kinh và quá trình đông cầm máu [11, 20]. SVTH: Hoàng Mỹ Quỳnh Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học Nọc bò cạp chứa các polypeptide toxin tác dụng với các receptor và các kênh ion.
Ngoài các toxin nọc bò cạp còn chứa các thành phần hoạt tính sinh học khác nhau như: enzyme, nucleotide, lipides, mucoproteins, biogenic amines, và cả các thành phần chưa biết [4, 19]. Những hoạt chất được nghiên cứu nhiều nhất trong nọc bò cạp là các neurotoxin, chúng tác dụng lên các receptor và các kênh ion của các màng tế bào bị kích thích. Phụ thuộc vào tác dụng của các toxin với các kênh ion, người ta chia chúng làm 4 loại, đó là các toxin tác dụng với các kênh ion: kênh Na+, kênh K+, kênh Cl-, kênh Ca2+[4, 20]. • Các toxin tác dụng với các kênh Na+ thường cấu tạo từ 60 – 76 gốc axit amin và cấu trúc của chúng được ổn định bởi bốn cầu disulfisd [4, 20].
• Trong khi đó các toxin tác dụng với các kênh K+ thường cấu tạo từ khoảng 31 – 39 gốc axit amin và cấu trúc của chúng được ổn định nhờ ba hoặc bốn cầu disulfid [4, 20]. • Xác định được hai peptide khác của nọc bò cạp thay đổi sự liên kết của ryanodine với kênh Ca2+, một loại làm tăng sự liên kết của ryanodine và kênh Ca2+ , loại kia lại ức chế sự liên kết [4, 20]. • Toxin tác dụng với kênh Cl- là peptide cấu tạo từ 36 gốc axit amine với bốn cầu disulfid [4, 20]. Nọc bò cạp đã được chứng minh có tác dụng kháng viêm giảm đau và nghiên cứu gần đây đã cho thấy nó có tác dụng lên quá trình đông cầm máu.
Từ ít nhất là sáu họ riêng biệt của bò cạp: Buthidae, Caraboctonidae, Iuridae, Ischnuridae, Scorpionidae và Vejovidae được biết là chứa peptide hoạt tính dược lý và một số protein tham gia vào quá trình đông cầm máu [11]. Trong bài luận văn này, đối tượng nghiên cứu chính của chúng tôi là bò cạp Heterometrus laoticus đã được khảo sát có độc tính cấp đối với động vật và có thành phần chống đông máu. NHỮNG NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NỌC BÒ CẠP TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM: 1. Trên thế giới: SVTH: Hoàng Mỹ Quỳnh Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học Trong khi cấu trúc bậc một của các toxin nọc bò cạp rất khác nhau thì cấu trúc không gian của chúng rất giống nhau.
Trừ cấu trúc không gian của các toxin tác dụng lên kênh Ca2+ là chưa biết, còn tất cả các peptide toxin bò cạp đều có lõi cấu trúc bảo thủ [4]. Các toxin ngắn của nọc bò cạp thường có cấu trúc bậc hai gồm một alpha spiral và hai nhánh đối song song của cấu trúc beta, giữa cấu trúc alpha và beta được cố định bằng hai cầu disulfid còn cầu disulfid thứ ba gắn đầu N với đầu cuối C của peptide. Các toxin này thường tác dụng với kênh K+ [10].2: Cấu trúc toxin ngắn của nọc bò cạp Còn cấu trúc không gian của toxin dài gồm một apha spiral và ba nhánh đối song song của cấu trúc beta, trong cấu trúc này có bốn cầu disulfid. Ngoại trừ với qui luật này là cấu trúc của insectoxin tách từ nọc bò cạp Hotentotta judaicus, ở đó có hai đoạn alpha spiral thay vì một đoạn ở các toxin bò cạp khác.
Các toxin này thường tác dụng với các kênh Na+ [10].3: Cấu trúc toxin dài của nọc bò cạp Hiện nay trên cơ sở các toxin nọc bò cạp người ta đã chế ra nhiều loại thuốc chữa các bệnh hiểm nghèo như ung thư. Margatoxin tách từ nọc bò cạp SVTH: Hoàng Mỹ Quỳnh Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học Centruroides margaritatus đã được hãng Merck (Đức) đăng kí bản quyền như thuốc để điều trị bệnh tự miễn dịch và chống sự loại bỏ trong quá trình ghép các cơ quan của cơ thể. Chlorotoxin tách từ nọc bò cạp Leiurus quinquestritus đã được sử dụng để điều trị bệnh ung thư não. Chế phẩm “Escozul” sản xuất từ nọc Rhppalurus junceus được sử dụng ở Cuba để điều trị các bệnh ung thư và Pakingson.
Sự thay đổi cấu trúc bậc một của toxin bò cạp có thể sử dụng để chế tạo ra những loại thuốc mới với những hoạt tính riêng. Như nghiên cứu cấu trúc của Charybdotoxin đã mở ra khả năng sản xuất những protein nhỏ nhưng ổn định có những hoạt tính mới trong y dược [7, 19]. Nọc độc bò cạp còn có tính kháng khuẩn và kháng nấm, vì vậy cũng có thể dùng làm thuốc trị các bệnh do vi khuẩn và nấm gây nên [19]. Thành tựu của y học Cuba là thuốc điều trị ung thư Vidatox đã mang đến cho bệnh nhân ung thư một hi vọng mới.
Vidatox được bào chế từ nọc bò cạp xanh, với tên khoa học Rophalorus Junceus, có tính kháng tế bào ung thư và kháng viêm rất cao. Dưới tác động của chất này, nó làm cho khối u không phát triển được do bị ngăn chặn sự nuôi dưỡng từ mạch máu, ngoài ra nó còn đưa đến các chất gây miễn dịch tại khối u này [12]. Ở Việt Nam: Người ta đã nghiên cứu tính chất và thành phần ở một số loài bò cạp Việt Nam như Lychas mucronatus, Heterometrus laoticus [17, 18 -20, 22]. Từ nọc bò cạp nâu Lychas mucronatus người ta đã tách được một glycoprotein có hoạt tính lectin và bảy toxin ngắn này nằm trong khoảng 3.0 kDa, đã khảo sát tác dụng của chúng lên myelin thần kinh [17, 18].
Trong số những toxin đó đã xác định được trình tự acid amin cùa neurotoxin 14. Ngoài ra, người ta đã xác định độc tính cấp và tác dụng kháng viêm giảm đau của nọc bò cạp này. Đối với nọc bò cạp đen Heterometrus laoticus người ta đã khảo sát thành phần protein và dược tính của nó. Từ đó người ta xác định nó chứa các thành phần độc với động vật và độc với côn trùng, nọc toàn phần có tác động kháng viêm, giảm đau [26, 27].
Ngoài ra những nghiên cứu này cho thấy nọc bò cạp H. laoticus còn SVTH: Hoàng Mỹ Quỳnh Trang Luận văn tốt nghiệp Đại học chứa các thành phần tác động lên quá trình đông cầm máu, đó là một hoạt tính mới của nọc bò cạp [11]. Những nghiên cứu trước đây về tác động chống đông máu của 5 phân đoạn được tách ra từ nọc bò cạp H.laoticus, bằng sắc ký lọc gel, cho thấy có 3 phân đoạn đó là 2, 4 và 5 có tác động chống đông máu [29]. Vì thế, để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, chúng tôi đã tiến hành tách phân đoạn 5 bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha và khảo sát tác dụng chống đông máu của các phân đoạn thứ cấp của nó.3 SẮC KÍ LỌC GEL PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN PROTEIN: 1.1 Giới thiệu về sắc ký lọc gel: Sắc kí lọc gel (sắc kí rây phân tử) là phương pháp tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của các chất.
Một số vật liệu rắn xốp có khả năng tạo ra bộ khung gel hay rây phân tử khi gặp dung môi tách. Pha tĩnh trong sắc kí lọc gel là dung môi trong các lỗ của hạt gel, còn pha động chính là dung môi chạy qua. Nói cách khác pha động và pha tĩnh đều cùng là một dung môi hay hỗn hợp dung môi tách [28]. Khi dung dịch cần phân tích đi qua bộ khung gel hay rây phân tử do có kích thước phân tử khác nhau nên sẽ có khả năng khác nhau khi qua gel.
Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ gel không bị hấp phụ lên gel mà chỉ có khuếch tán giữa các khe hở của các hạt gel.