CHƯƠNG 1. Lý do chọn đề tài Gamma Aminobutyric Acid (GABA) là một acid amin phi protein có chức năng quan trọng trong hoạt động cua hệ thần kinh người. GABA giống như một loại thuốc an thần tự nhiên được não bộ sản xuất ra để giúp giảm bớt các hiện tượng: căng thăng, lo lăng, mat ngủ. Ngày nay, GABA đã được các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng hỗ trợ điều trị, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về thần kinh như: Huntington, Parkinson, Alzheimer, tram cam, .va lam cham su phat triển của các tế bào ung thư vu, ung thư dai trang, ung thư gan.
Thông thường, não bộ sẽ tiết ra lượng GABA chúng ta cần, nhưng với chế độ ăn uống kém, tiếp xúc với nhiều chất độc hại từ môi trường, não bộ sẽ bị quá tải và không thé nào đáp ứng đủ lượng GABA can thiết. Do đó, việc bổ sung GABA như một dạng thực phẩm chức năng là rất cần thiết để duy trì một cơ thé khỏe mạnh. Vì vậy việc sản xuất GABA rất được các nhà nghiên cứu quan tâm trong những năm gan đây. Hiện nay GABA được sản xuất bằng nhiều phương pháp khác nhau như: tách chiết từ ngũ cốc nảy mam, lên men bang vi sinh vật (VSV) trên các nguyên liệu cám gạo, dịch nho, rong biến, đậu nành.
Trong đó phương pháp lên men sử dụng vi khuẩn lactic như: Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracaséi. đã đem lai hiệu quả cao trên một số nguyên liệu. Tuy nhiên chi phí san xuất GABA băng phương pháp lên men vẫn khá cao do việc tạo một môi trường dinh dưỡng phù hợp cho quá trình lên men khá tốn kém. Do đó việc tìm một nguồn nguyên liệu để sản xuất GABA với chi phí thấp hơn đang là van dé rat được quan tâm nghiên cứu.
Hạt bụp giảm ở nước ta từ trước đến nay chỉ được xem như một loại phế liệu ít có giá trị sử dung và thường bị thải bỏ. Nhưng hạt bụp giấm chứa ham lượng dinh dưỡng cao như: tổng carbohydrate là 38 %, giàu vitamin và khoáng chat, đặc biệt hàm lượng HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên Luận văn Thạc sĩ 2 protein lên đến 30,11 %, trong đó ty lệ acid glutamic chiếm 21/78 % [1]. Do do, hạt bup giam là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc sản xuất GABA với chi phí thấp. Xuất phát từ những yêu cau của thực tiễn, dé tài “Nghiên cứu quá trình lên men sinh tong hop Gamma Aminobutyric acid (GABA) từ môi trường hạt bụp giấm sử dụng chung Lactobacillus plantarum” đã được lựa chọn thực hiện.
Mục tiêu của đề tài và nội dung nghiên cứu 1. Mục tiêu của đề tài Tối ưu hóa quá trình lên men để sinh tong hop GABA đạt hiệu suất cao từ hạt bụp giấm, sử dụng chủng vi khuan Lactobacillus plantarum. Nội dung nghiên cứu > Xác định thành phan hóa học co bản của hạt bụp giấm > Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến sự tổng hợp GABA. > Xác định các điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp GABA.
> Khảo sát ảnh hưởng việc xử lý enzyme protease đến quá trình tổng hợp GABA. > Khảo sát ảnh hưởng của việc bố sung coenzyme Pyridoxal 5-Phosphate (PLP) đến quá trình sinh tổng hợp GABA. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1. Đối tượng nghiên cứu Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình lên men sinh tổng hợp GABA từ môi trường hạt bụp giam bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum.
Phạm vỉ nghiên cứu Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu hạt bụp giẫm và xác định các điều kiện quá trình lên men sinh tổng hợp GABA. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học > Khảo sát hạt bụp giảm như một nguồn nguyên liệu mới tiém năng để sản xuất GABA đạt hiệu quả cao. HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên Luận văn Thạc sĩ 3 > Thử nghiệm khả năng sinh tổng hợp GABA của chủng Lactobacillus plantarum trên môi trường dịch hạt bụp giấm.
Y nghĩa thực tiễn > Tận dụng nguồn phế liệu bụp giẫm dé sản xuất thực phẩm chức năng GABA > Mở dau cho việc sản xuất GABA chi phí thấp ở quy mô công nghiệp > Nâng cao giá trị kinh tế của cây bụp giấm HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên Luận văn Thạc sĩ 4 CHƯƠNG 2. Tổng quan về GABA 2. Giới thiệu về GABA GABA là một amino acid phi protein có 4 carbon, nó được tìm thấy trong tế bào vi sinh vật (VSV), thực vật và động vật. GABA được phát hiện lầu dau tiên trong mô củ khoai tây vào năm 1949 [2|.
Chức năng của GABA ở các loài sinh vật vẫn chưa được hiểu biết day đủ. Ở thực vat, GABA có vai trò trong việc chồng lại các stress sinh học từ môi trường như nông độ muối cao, côn trùng, điều kiện ánh sáng thấp, sự xâm nhập của vi khuẩn, virus.GABA còn đóng vai trò trao đối chất trong chu trình Krebs và sự phát triển, sinh sản ở thực vật [3]. Ở động vật, GABA được tìm thay Vol nong do cao trong não, ngoài có vai trò trao đổi chat trong chu trình Krebs còn đóng một vai trò chính trong sự dẫn truyền thần kinh ức chế của hệ thần kinh trung ương và các mô ngoại vi. Nó ngăn chặn các tín hiệu thần kinh kích thích giúp giảm căng thăng, lo âu, mat ngủ và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh than kinh ở người [4].
Ở vi sinh vật, vai trò chủ yếu của GABA là giúp vi sinh vật chống lại điều kiện pH thấp [2]. Ngoài ra, GABA còn liên quan đến sự nảy mam bào tử của một số vi khuẩn [2]; tham gia vào chu trình Krebs va chồng lại điều kiện thiếu oxi ở một số vi khuẩn hiếu khí, chồng lại muối mật, áp suất thâm thấu cao [5]. Công thức cau tạo của GABA [6] GABA chủ yếu được hình thành bằng phan ứng ơ-decarboxyl không nghịch đảo của acid L-glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD). Enzyme nay được tìm thấy ở vi sinh vật như: Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus, Aspergillus và Neurospora; ở thực vật như: trà, cà chua, đậu nành, khoai tây, gạo lứt nay mam; và trong não của động vật có vu [4].
Ngoài ra, HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên Luận văn Thạc sĩ 5 GABA còn được tìm thay ở côn trùng như: gián, châu chau, sâu bướm va ong mat [4]. Tuy nhiên hiện nay người ta chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu san xuất GABA hơn là việc chiết tách GABA. Vi khuẩn Lactobacillus va nam men là hai loài quan trọng nhất dé sản xuất GABA vì chúng thường được sử dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm lên men [4]. Cơ chế tổng hợp GABA ở người Trong cơ thể người, GABA được phát hiện trong hệ thống thần kinh trung ương vào khoảng năm 1950 bởi Eugene Roberts nhưng đến năm 1960, GABA mới được đề xuất là chất dẫn truyền thần kinh ức chế trong cơ thể.
Ngoải não, GABA cũng có mặt trong tế bào lympo B tuyến tụy, buông trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa. GABA có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh [7]. Quá trình tong hop va chuyén hóa GABA ở người cũng tương tự như ở thực vat, động vật, được thực hiện theo chu trình “GABA shunt” (hình 2.2) bởi 3 enzyme chính: enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD), GABA d-oxoglutarafte transaminase (GABA-—T) va enzyme succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) [8]. “GABA shunt” là một chu trình khép kin với mục đích là để sản xuất và đảm bảo sự cung cấp GABA.
GABA có ở nông độ cao (mM) trong nhiều vùng não. Nong độ này cao gấp 1.000 lần so với nông độ các chất dẫn truyền thần kinh monoamine thông thường trong cùng một vùng. Diéu này phù hợp với tác động mạnh mẽ và chuyên biệt của các noron thần kinh GABAergic ở các vùng nay. Glucose là tiền thân chính cho sản xuất GABA trong cơ thé người, mặc dù pyruvate và các acid amin khác cũng có thé đóng vai trò tiền thân.
Bước dau tiên trong “GABA shunt” là sự chuyển hóa ơ-ketoglutarate (được hình thành từ chuyển hóa glucose trong chu trình Krebs) bởi GABA a-oxoglutarate transaminase (GABA-T) tạo thành axit L-glutamic. Sau đó enzyme glutamic acid decarboxylase (GAD) xúc tác cho việc khử nhóm cacboxyl cua acid glutamic (hoặc glutamate) dé tao thanh GABA. GAD dường như chi được biểu HVTT: Nguyễn Thị Bích Liên Luận văn Thạc sĩ 6 hiện trong các tế bào sử dụng GABA như một chất dẫn truyền thần kinh. Khi lượng GABA sinh ra vượt quá ngưỡng thì một tín hiệu thần kinh sẽ kích hoạt quá trình chuyển hóa GABA bởi GABA-T để hình thành succinic semialdehyde.
Dé bảo tồn nguồn cung GABA, sự chuyển đổi này thường xảy ra khi có sẵn một phân tử a- ketoglutarate để nhận nhóm amin được loại bỏ khỏi GABA, dé tao thành glutamic acid. Do đó, một phân tử GABA chỉ có thé được chuyển hóa nếu một phân tử glutamic được hình thành. Succinic semialdehyde có thể bị oxy hóa bởi enzyme SSADH tạo thành succinic acid và sau đó có thé quay lại chu ky Krebs, hoàn thành vòng lặp [8]. Mặc dù, GABA-T có thể tham gia tong hop GABA từ succinic semialdehyde nhưng vai trò cơ bản của enzyme này là chuyển hóa GABA tạo thành succinic semialdehyde.
Ngoài ra, những chất ức chế hoạt động của GABA-T cũng làm sinh ra một lượng lớn GABA ở trong não [9]. Hơn nữa, quá trình tạo GABA của GAD cần có sự tham gia của vitamin B6 hay còn được gọi là pyridoxal-5’-phophate (PLP) được xem như một coenzyme [2]. O NH, ° 90 ° HO-C-CHCH,CH,C-OH HO-C-CCH,CH,C-OH Glutamate GABA-T a-Ketoglutarate " ee C-OH Krebs cycie Succinic semialdehyde agape ĐC SSADH y-Aminobutyric acid 0 ° (GABA) HO-CCH,CH,C-OH ~ _= Succinic acid Hình 2. Chu trình chuyển hóa GABA 6 não người (GABA shunt)[8] HVTT: Nguyén Thi Bich Lién Luận văn Thạc sĩ 7 2.
Chức năng sinh lý của GABA đối với cơ thể người 2. Hoạt động của GABA trong hệ thần kinh người GABA được tổng hợp trong não, hoạt động bằng cách ngăn chặn tín hiệu não (các dẫn truyền thần kinh kích thích) thông qua các thụ thể GABA. GABA được tạo ra bởi các tế bào than kinh GABAergic, sau đó được phóng thích ra ngoài khe Synap, khuếch tán trong khe Synap và gắn vào các thụ thể GABA. Các thụ thể GABA, nhận biết và gắn kết GABA, nam tại các màng sau khe Synap.
Có 3 nhóm thụ thé GABA là GABA-A, GABA-B, GABA-C [4]. GABA-A và GABA-C là thụ thé ức chế nhanh, có vai trò ngăn chặn các truyền dẫn co giật, lo lang, hoảng loạn và căng thăng. Thụ thể GABA-A liên kết với một kênh ion. Khi GABA kết hop với thụ thể nó làm mở kênh ion cho phép ion Cl’ xuyên qua mang và đi vào trong tế bào than kinh, làm tăng tinh phân cực của màng tế bào than kinh, do đó các truyền dẫn thần kinh kích thích bị ngăn chặn [4].