Luận văn thạc sĩ về nhân dòng và hoạt tính của protein KOD DNA polymerase ở E. coli

• Tác giả: Nguyễn Thị Uyên
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Sáng
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về PCR
• 1.2. Ứng dụng của PCR
• 1.3. Thành phần phản ứng PCR
• 1.4. Giới thiệu về DNA polymerase
• 1.4.1. Giới thiệu chung
• 1.4.2. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein
• 1.4.3. Các loại DNA polymerase thương mại
• 1.5. Cấu trúc của DNA polymerase
• 1.6. KOD DNA polymerase
• 1.7. Tình hình nghiên cứu
• 1.8. Giới thiệu về KOD. Đặc điểm và cấu trúc
• 1.9. Lựa chọn hệ thống biểu hiện
• 1.10. Vật chủ biểu hiện
• 1.11. Phương pháp tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực
• 1.11.1. Sắc ký ái lực Nickel
• 1.11.2. Sắc ký ái lực Glutathione
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Tổng hợp và nhân dòng gen KOD
• 2.3.2. Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD
• 2.3.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 2.3.4. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
• 2.3.5. Thẩm tách protein
• 2.3.6. Thử hoạt tính enzyme
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhân dòng gen KOD
• 3.2. Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD
• 3.3. Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR
• 3.4. Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1
• 3.5. Kết quả tách chiết plasmid DNA
• 3.6. Giải trình tự plasmid
• 3.7. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 3.8. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
• 3.8.1. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel
• 3.8.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST
• 3.9. Thẩm tách protein
• 3.10. Thử hoạt tính enzyme
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp

Nghiên cứu về protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử. KOD DNA polymerase là một enzyme có khả năng khuếch đại DNA với độ chính xác cao và tần suất đột biến thấp. Việc sản xuất enzyme này từ E. coli không chỉ giúp giảm chi phí mà còn đảm bảo tính chủ động trong nghiên cứu. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phát triển quy trình sản xuất enzyme KOD DNA polymerase tái tổ hợp, từ đó ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp và công nghệ sinh học.

1.1. Giới thiệu về KOD DNA polymerase và ứng dụng

KOD DNA polymerase là một enzyme được phát hiện từ vi khuẩn Thermococcus kodakaraensis. Enzyme này có khả năng chịu nhiệt tốt, cho phép thực hiện các phản ứng PCR với độ chính xác cao. Ứng dụng của enzyme này rất đa dạng, từ nghiên cứu gen đến phát hiện bệnh lý di truyền. Việc sản xuất enzyme này từ E. coli sẽ giúp giảm thiểu chi phí và thời gian vận chuyển.

1.2. Tình hình nghiên cứu hiện tại về KOD polymerase

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về DNA polymerase, số lượng công bố liên quan đến KOD polymerase tái tổ hợp vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch enzyme. Việc phát triển quy trình sản xuất enzyme KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu KOD DNA polymerase

Mặc dù KOD DNA polymerase có nhiều ưu điểm, nhưng việc sản xuất enzyme này vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như chi phí cao, thời gian vận chuyển lâu và chất lượng enzyme không ổn định trong quá trình bảo quản là những yếu tố cần được giải quyết. Việc phát triển quy trình sản xuất enzyme KOD DNA polymerase tái tổ hợp từ E. coli sẽ giúp khắc phục những vấn đề này.

2.1. Chi phí sản xuất enzyme KOD DNA polymerase

Chi phí sản xuất enzyme KOD DNA polymerase từ các công ty nước ngoài thường rất cao. Điều này gây khó khăn cho các phòng thí nghiệm và công ty công nghệ sinh học trong nước. Việc phát triển quy trình sản xuất enzyme từ E. coli sẽ giúp giảm thiểu chi phí và tăng tính cạnh tranh.

2.2. Chất lượng enzyme và điều kiện bảo quản

Chất lượng enzyme KOD DNA polymerase có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện bảo quản trong quá trình vận chuyển. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp đảm bảo chất lượng và tính ổn định của enzyme, từ đó nâng cao hiệu quả trong các ứng dụng nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu KOD DNA polymerase tái tổ hợp

Để nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp KOD DNA polymerase, một số phương pháp chính được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm tối ưu hóa mã bộ ba của gen KOD, thiết kế vector biểu hiện, và tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực. Những phương pháp này giúp đảm bảo sản phẩm enzyme đạt chất lượng cao và hiệu suất tốt.

3.1. Tối ưu hóa mã bộ ba của gen KOD

Tối ưu hóa mã bộ ba của gen KOD DNA polymerase là bước quan trọng trong quá trình sản xuất enzyme. Việc sử dụng công cụ tin sinh giúp tối ưu hóa trình tự gen, từ đó nâng cao hiệu suất biểu hiện protein trong E. coli.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện cho KOD polymerase

Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Các vector như pET-M và pGEX-4T-1 được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn. Việc lựa chọn vector phù hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất biểu hiện và tinh sạch protein.

3.3. Tinh sạch protein KOD bằng sắc ký ái lực

Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng để tinh sạch protein KOD DNA polymerase. Các phương pháp như sắc ký ái lực Nickel và GST giúp tách chiết protein với độ tinh khiết cao, đảm bảo enzyme đạt chất lượng tốt nhất cho các ứng dụng nghiên cứu.

IV. Ứng dụng thực tiễn của KOD DNA polymerase tái tổ hợp

KOD DNA polymerase tái tổ hợp có nhiều ứng dụng thực tiễn trong các lĩnh vực như y học, nông nghiệp và công nghệ sinh học. Enzyme này được sử dụng trong các phản ứng PCR để khuếch đại DNA, phát hiện bệnh lý di truyền, và nghiên cứu gen. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp nâng cao hiệu quả và giảm chi phí cho các ứng dụng này.

4.1. Ứng dụng trong y học và chẩn đoán

KOD DNA polymerase được sử dụng trong các xét nghiệm sinh học phân tử để phát hiện các bệnh lý di truyền và các bệnh do virus, vi khuẩn gây ra. Việc sử dụng enzyme này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và nâng cao độ chính xác.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu gen và công nghệ sinh học

Enzyme KOD DNA polymerase cũng được sử dụng trong nghiên cứu gen và phát triển các sản phẩm sinh học. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp tăng cường khả năng nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học tại Việt Nam.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu KOD DNA polymerase

Nghiên cứu về protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli không chỉ giúp giải quyết các vấn đề về chi phí và chất lượng enzyme mà còn mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành sinh học phân tử tại Việt Nam.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu KOD polymerase

Nghiên cứu KOD DNA polymerase tái tổ hợp có tầm quan trọng lớn trong việc phát triển công nghệ sinh học tại Việt Nam. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp nâng cao tính chủ động và giảm thiểu phụ thuộc vào nguồn cung từ nước ngoài.

5.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu về KOD DNA polymerase sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các quy trình sản xuất enzyme hiệu quả hơn. Điều này sẽ góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học tại Việt Nam.