Luận văn thạc sĩ về nhân dòng và hoạt tính của protein KOD DNA polymerase ở E. coli

Luận văn thạc sĩ phân tích hus nhân dòng biểu hiện tinh sạch và xác định hoạt tính của protein kod dna polymerase tái tổ hợp ở, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Uyên
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Sáng
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về PCR
• 1.2. Ứng dụng của PCR
• 1.3. Thành phần phản ứng PCR
• 1.4. Giới thiệu về DNA polymerase
• 1.4.1. Giới thiệu chung
• 1.4.2. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein
• 1.4.3. Các loại DNA polymerase thương mại
• 1.5. Cấu trúc của DNA polymerase
• 1.6. KOD DNA polymerase
• 1.7. Tình hình nghiên cứu
• 1.8. Giới thiệu về KOD. Đặc điểm và cấu trúc
• 1.9. Lựa chọn hệ thống biểu hiện
• 1.10. Vật chủ biểu hiện
• 1.11. Phương pháp tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực
• 1.11.1. Sắc ký ái lực Nickel
• 1.11.2. Sắc ký ái lực Glutathione
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Tổng hợp và nhân dòng gen KOD
• 2.3.2. Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD
• 2.3.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 2.3.4. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
• 2.3.5. Thẩm tách protein
• 2.3.6. Thử hoạt tính enzyme
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nhân dòng gen KOD
• 3.2. Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD
• 3.3. Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR
• 3.4. Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1
• 3.5. Kết quả tách chiết plasmid DNA
• 3.6. Giải trình tự plasmid
• 3.7. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 3.8. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
• 3.8.1. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel
• 3.8.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST
• 3.9. Thẩm tách protein
• 3.10. Thử hoạt tính enzyme
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp

Nghiên cứu về protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử. KOD DNA polymerase là một enzyme có khả năng khuếch đại DNA với độ chính xác cao và tần suất đột biến thấp. Việc sản xuất enzyme này từ E. coli không chỉ giúp giảm chi phí mà còn đảm bảo tính chủ động trong nghiên cứu. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phát triển quy trình sản xuất enzyme KOD DNA polymerase tái tổ hợp, từ đó ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp và công nghệ sinh học.

1.1. Giới thiệu về KOD DNA polymerase và ứng dụng

KOD DNA polymerase là một enzyme được phát hiện từ vi khuẩn Thermococcus kodakaraensis. Enzyme này có khả năng chịu nhiệt tốt, cho phép thực hiện các phản ứng PCR với độ chính xác cao. Ứng dụng của enzyme này rất đa dạng, từ nghiên cứu gen đến phát hiện bệnh lý di truyền. Việc sản xuất enzyme này từ E. coli sẽ giúp giảm thiểu chi phí và thời gian vận chuyển.

1.2. Tình hình nghiên cứu hiện tại về KOD polymerase

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về DNA polymerase, số lượng công bố liên quan đến KOD polymerase tái tổ hợp vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch enzyme. Việc phát triển quy trình sản xuất enzyme KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu KOD DNA polymerase

Mặc dù KOD DNA polymerase có nhiều ưu điểm, nhưng việc sản xuất enzyme này vẫn gặp phải một số thách thức. Các vấn đề như chi phí cao, thời gian vận chuyển lâu và chất lượng enzyme không ổn định trong quá trình bảo quản là những yếu tố cần được giải quyết. Việc phát triển quy trình sản xuất enzyme KOD DNA polymerase tái tổ hợp từ E. coli sẽ giúp khắc phục những vấn đề này.

2.1. Chi phí sản xuất enzyme KOD DNA polymerase

Chi phí sản xuất enzyme KOD DNA polymerase từ các công ty nước ngoài thường rất cao. Điều này gây khó khăn cho các phòng thí nghiệm và công ty công nghệ sinh học trong nước. Việc phát triển quy trình sản xuất enzyme từ E. coli sẽ giúp giảm thiểu chi phí và tăng tính cạnh tranh.

2.2. Chất lượng enzyme và điều kiện bảo quản

Chất lượng enzyme KOD DNA polymerase có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện bảo quản trong quá trình vận chuyển. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp đảm bảo chất lượng và tính ổn định của enzyme, từ đó nâng cao hiệu quả trong các ứng dụng nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu KOD DNA polymerase tái tổ hợp

Để nghiên cứu và sản xuất protein tái tổ hợp KOD DNA polymerase, một số phương pháp chính được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm tối ưu hóa mã bộ ba của gen KOD, thiết kế vector biểu hiện, và tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực. Những phương pháp này giúp đảm bảo sản phẩm enzyme đạt chất lượng cao và hiệu suất tốt.

3.1. Tối ưu hóa mã bộ ba của gen KOD

Tối ưu hóa mã bộ ba của gen KOD DNA polymerase là bước quan trọng trong quá trình sản xuất enzyme. Việc sử dụng công cụ tin sinh giúp tối ưu hóa trình tự gen, từ đó nâng cao hiệu suất biểu hiện protein trong E. coli.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện cho KOD polymerase

Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD là một bước quan trọng trong nghiên cứu. Các vector như pET-M và pGEX-4T-1 được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn. Việc lựa chọn vector phù hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất biểu hiện và tinh sạch protein.

3.3. Tinh sạch protein KOD bằng sắc ký ái lực

Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng để tinh sạch protein KOD DNA polymerase. Các phương pháp như sắc ký ái lực Nickel và GST giúp tách chiết protein với độ tinh khiết cao, đảm bảo enzyme đạt chất lượng tốt nhất cho các ứng dụng nghiên cứu.

IV. Ứng dụng thực tiễn của KOD DNA polymerase tái tổ hợp

KOD DNA polymerase tái tổ hợp có nhiều ứng dụng thực tiễn trong các lĩnh vực như y học, nông nghiệp và công nghệ sinh học. Enzyme này được sử dụng trong các phản ứng PCR để khuếch đại DNA, phát hiện bệnh lý di truyền, và nghiên cứu gen. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp nâng cao hiệu quả và giảm chi phí cho các ứng dụng này.

4.1. Ứng dụng trong y học và chẩn đoán

KOD DNA polymerase được sử dụng trong các xét nghiệm sinh học phân tử để phát hiện các bệnh lý di truyền và các bệnh do virus, vi khuẩn gây ra. Việc sử dụng enzyme này giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán và nâng cao độ chính xác.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu gen và công nghệ sinh học

Enzyme KOD DNA polymerase cũng được sử dụng trong nghiên cứu gen và phát triển các sản phẩm sinh học. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp tăng cường khả năng nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học tại Việt Nam.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu KOD DNA polymerase

Nghiên cứu về protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli không chỉ giúp giải quyết các vấn đề về chi phí và chất lượng enzyme mà còn mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành sinh học phân tử tại Việt Nam.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu KOD polymerase

Nghiên cứu KOD DNA polymerase tái tổ hợp có tầm quan trọng lớn trong việc phát triển công nghệ sinh học tại Việt Nam. Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp nâng cao tính chủ động và giảm thiểu phụ thuộc vào nguồn cung từ nước ngoài.

5.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu về KOD DNA polymerase sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các quy trình sản xuất enzyme hiệu quả hơn. Điều này sẽ góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) đóng vai trò nền tảng trong sinh học phân tử, y học chẩn đoán và công nghệ gen. Trong số các enzyme khuếch đại acid nucleic hiện nay, KOD DNA polymerase phân lập từ vi khuẩn cổ chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis nổi bật với tốc độ kéo dài chuỗi đạt từ 6 đến 8 kb/phút, cao gấp 2 lần so với Taq polymerase (2-4 kb/phút). Đồng thời, enzyme này sở hữu hiệu suất gắn liên tục vượt trên 300 nucleotide trong một lần tiếp xúc khuôn mẫu (cao gấp 5 lần Taq và 15 lần Pfu polymerase) cùng hoạt tính đọc sửa 3'-5' exonuclease giúp duy trì độ chính xác lên đến 98,62%.

Mặc dù có nhu cầu ứng dụng rất lớn trong xét nghiệm virus, chẩn đoán ung thư và giải trình tự gen, các cơ sở nghiên cứu tại Việt Nam hiện vẫn phải nhập khẩu enzyme thương mại từ các nhà sản xuất quốc tế như TOYOBO (Nhật Bản) hoặc MilliporeSigma (Mỹ). Quá trình nhập khẩu thường đi kèm chi phí cao, thời gian vận chuyển kéo dài từ 2 đến 4 tuần và nguy cơ suy giảm hoạt tính do điều kiện bảo quản nhiệt độ âm sâu không liên tục.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Di truyền học thực hiện mục tiêu làm chủ công nghệ sản xuất KOD DNA polymerase tái tổ hợp thông qua việc tối ưu mã bộ ba, nhân dòng, biểu hiện trên hệ thống vi khuẩn Escherichia coli BL21 (DE3), tinh sạch bằng sắc ký ái lực và đánh giá hoạt tính sinh học. Đề tài được triển khai trong giai đoạn 2018-2019 tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống và Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, dưới sự tài trợ của Quỹ NAFOSTED (mã số 106-NN 02-2016 58). Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề sản xuất enzyme quy mô phòng thí nghiệm với giá thành ước tính giảm từ 40% đến 60% so với sản phẩm nhập ngoại.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên ba trụ cột lý thuyết sinh học phân tử hiện đại:

• Lý thuyết động học enzyme DNA Polymerase họ B: KOD DNA polymerase thuộc nhóm α-DNA polymerase có cấu trúc không gian ba chiều mô phỏng bàn tay phải gồm 3 vùng chức năng: lòng bàn tay (palm), ngón tay (fingers) và ngón tay cái (thumb). Trung tâm hoạt động liên kết với ion Mg2+ xúc tác tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide theo chiều 5' đến 3', kết hợp miền exonuclease 3'-5' (chứa 196 acid amin từ vị trí 131 đến 326) để loại bỏ nucleotide ghép sai với tỷ lệ đột biến cực thấp khoảng 0,0035%.
• Mô hình biểu hiện gen tái tổ hợp ở sinh vật nhân sơ: Hệ thống điều hòa phiên mã promoter T7 trên vector pET-M và promoter tac trên vector pGEX-4T-1 được cảm ứng bởi Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Dưới tác động của IPTG ở nồng độ từ 0,3 mM đến 1,0 mM, gen mã hóa T7 RNA polymerase trên nhiễm sắc thể của chủng E. coli BL21 (DE3) được hoạt hóa, thúc đẩy phiên mã mạnh mẽ đoạn gen đích mà không cần cơ chế biến đổi sau dịch mã phức tạp.
• Nguyên lý sắc ký ái lực (Affinity Chromatography): Ứng dụng tương tác sinh hóa đặc hiệu giữa đoạn peptide dung hợp 6xHistidine với ion kim loại Ni2+ cố định trên cột IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography), hoặc giữa enzyme Glutathione S-transferase (GST, khối lượng 26 kDa) với cơ chất tripeptide Glutathione cố định trên ma trận Sepharose 4B.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu nghiên cứu bao gồm trình tự gen KOD DNA polymerase (mã ngân hàng gen BAD84190.1, gồm 774 acid amin) từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1. Trình tự này được tối ưu hóa mã bộ ba bằng phần mềm chuyên dụng OptimumGene của GenScript nhằm thích ứng tối đa với hệ thống dịch mã của E. coli. Gen tổng hợp hóa học có kích thước 2341 bp được cung cấp bởi Công ty Phù Sa Biochem trên vector pUC19 với nồng độ 184 ng/µl.

Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm 8 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế riêng biệt, 5 khuẩn lạc tái tổ hợp chọn lọc cho mỗi hệ vector, cùng các mẻ nuôi cấy biểu hiện thể tích 500 ml môi trường Luria-Bertani (LB). Phương pháp chọn mẫu khuẩn lạc ngẫu nhiên có kiểm tra đối chứng thông qua PCR khuẩn lạc sử dụng mồi T7 promoter, T7 terminator và pGEX 5', pGEX 3'.

Phương pháp phân tích được lựa chọn dựa trên tiêu chuẩn sinh học phân tử quốc tế:

• Phương pháp giải trình tự Sanger tại công ty 1st BASE (Malaysia) nhằm kiểm tra độ chính xác 100% của khung đọc mở.
• Điện di biến tính SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10% để định lượng và xác định kích thước phân tử protein tái tổ hợp.
• Thẩm tách đa bước qua 3 hệ đệm loại bỏ muối và chất rửa giải (Imidazole, Glutathione), đưa enzyme về đệm bảo quản chứa 50% glycerol ở nhiệt độ -20°C.
• Thử nghiệm hoạt tính PCR khuếch đại các đoạn gen kích thước từ 260 bp đến 2400 bp trong 35 chu kỳ nhiệt, so sánh trực tiếp với enzyme đối chứng thương mại Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai thực nghiệm đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học quan trọng:

• Tối ưu hóa mã bộ ba đạt thông số lý tưởng: Trình tự gen KOD sau tối ưu đạt chỉ số thích nghi codon CAI tuyệt đối bằng 1,0 (so với mức chuẩn yêu cầu từ 0,8 đến 1,0). Hàm lượng GC đạt 49,55% (nằm trong dải tối ưu 30% - 70%) và chỉ số phân bố tần số codon hiếm CFD giảm về 0%, triệt tiêu hoàn toàn hiện tượng nghẽn dịch mã. Đoạn gen 2341 bp được nhân bản chính xác và chèn thành công vào hai vector pET-M và pGEX-4T-1.
• Mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp vượt trội: Sau 16 giờ cảm ứng bằng IPTG 0,3 mM ở nhiệt độ 37°C, chủng E. coli BL21 (DE3) biểu hiện mạnh mẽ hai dạng protein dung hợp. Điện di SDS-PAGE ghi nhận băng protein KOD-His ở kích thước xấp xỉ 92 kDa và băng KOD-GST ở kích thước xấp xỉ 116 kDa (gồm 90 kDa protein KOD và 26 kDa đuôi GST) với độ đậm vượt trội so với mẫu đối chứng không cảm ứng.
• Hiệu quả tinh sạch khác biệt giữa hai hệ thống sắc ký: Tinh sạch KOD-His qua cột Ni-NTA ở điều kiện tự nhiên cho thấy xuất hiện nhiều băng tạp nhiễm. Khi kết hợp xử lý nhiệt ở 75°C trong 15 phút, phần lớn protein KOD-His bị đồng kết tủa vào pha cặn cùng protein tế bào chủ. Việc biến tính bằng Urea (2M, 4M, 6M) làm giảm tạp nhiễm nhưng làm suy giảm đáng kể lượng enzyme thu hồi. Ngược lại, phương pháp sắc ký ái lực Glutathione Sepharose 4B đối với KOD-GST cho kết quả tinh sạch cao, thu được một băng protein đơn nhất ở kích thước 116 kDa.
• Hoạt tính sinh học mạnh mẽ tương đương đối chứng quốc tế: Enzyme KOD-GST sau thẩm tách thể hiện hoạt tính xúc tác cao trong phản ứng PCR. Với thể tích sử dụng từ 0,3 µl đến 0,5 µl trong phản ứng 10 µl, enzyme khuếch đại thành công các đoạn DNA kích thước ngắn (260 bp, 400 bp), trung bình (500 bp, 1100 bp) và dài (2400 bp) trên gel agarose 1,5% - 2,0%, tạo các băng sản phẩm sáng rõ, sắc nét, tương đương với enzyme Phusion DNA Polymerase thương mại.

Thảo luận kết quả

Hiện tượng KOD-His bị mất hoạt tính và kết tủa khi xử lý nhiệt 75°C là một phát hiện đáng chú ý. Mặc dù bản thân KOD DNA polymerase có tính bền nhiệt cao gấp 20 lần Taq ở 95°C, nhưng khi biểu hiện dưới dạng protein tái tổ hợp mang đuôi 6xHis trong E. coli, sự biến tính và vón cục của hàng nghìn protein tạp nội bào đã cuốn theo KOD-His vào pha tủa.

Trong khi đó, đuôi dung hợp GST đóng vai trò như một chaperone phân tử, làm tăng độ tan và ổn định cấu trúc bậc bốn của KOD trong tế bào chất. Dữ liệu thực nghiệm qua biểu đồ điện di và đo mật độ quang học Nanodrop (A260/A280 đạt tỷ lệ 1,8) chứng minh hệ thống vector pGEX-4T-1 kết hợp cột Glutathione Sepharose 4B là giải pháp tối ưu nhất cho quy trình sản xuất KOD tái tổ hợp. Về mặt động học, enzyme KOD-GST duy trì hiệu suất nhân bản cao nhất trong môi trường đệm 10x chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 2 mM MgSO4, 10 mM KCl, 1 mM (NH4)2SO4 và 0,1 mg/ml BSA.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm, bốn giải pháp mang tính hành động cao được đề xuất nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất và ứng dụng enzyme:

• Chuẩn hóa quy trình cắt loại bỏ đuôi dung hợp: Tiến hành tối ưu hóa phản ứng phân cắt trực tiếp trên cột bằng enzyme protease Thrombin với tỷ lệ 1 đơn vị Thrombin cho 100 µg protein KOD-GST ở 22°C trong 4 đến 6 giờ. Mục tiêu đạt độ tinh sạch trên 98% đối với protein KOD tự do (90 kDa), do Nhóm nghiên cứu Sinh học phân tử thực hiện trong vòng 6 tháng.
• Nâng cấp quy mô nuôi cấy lên hệ thống Bioreactor: Chuyển đổi phương pháp nuôi cấy lắc bình tam giác 500 ml sang hệ thống lên men sinh khối liên tục Bioreactor dung tích từ 10 đến 50 lít. Thiết lập chế độ cấp bù cơ chất nồng độ cao (fed-batch) nhằm tăng mật độ tế bào OD600 từ 0,6 lên 15-20, nâng hiệu suất thu hồi protein đạt từ 300 mg đến 500 mg/lít dịch lên men, hoàn thành trong 12 tháng bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phối hợp với doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm.
• Nghiên cứu công thức đệm bảo quản dài hạn: Thử nghiệm bổ sung các hợp chất bảo vệ nhiệt như Trehalose 0,1 M, DTT 1 mM, Nonidet P-40 0,5% và Tween-20 0,5% trong nền dung dịch đệm chứa 50% glycerol. Đích đến là duy trì hoạt tính enzyme trên 95% sau 24 tháng bảo quản ở nhiệt độ -20°C, thực hiện bởi Nhóm phát triển sản phẩm trong 9 tháng.
• Mở rộng đánh giá ứng dụng chuyên sâu: Ứng dụng KOD DNA polymerase tái tổ hợp vào các kỹ thuật phân tích hiện đại như Long-range PCR (khuếch đại các đoạn gen trên 10 kb), giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và chẩn đoán đột biến điểm kháng thuốc của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Mục tiêu đạt giới hạn phát hiện dưới 10 bản sao DNA đích trong 18 tháng, do Viện Nghiên cứu Y sinh và các Trung tâm Xét nghiệm triển khai.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn mang lại giá trị học thuật và thực tiễn phong phú cho bốn nhóm bạn đọc:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học: Nắm bắt quy trình thực nghiệm chuẩn từ bước tối ưu hóa codon in silico bằng phần mềm chuyên dụng đến kỹ thuật thiết kế vector pET/pGEX, biến nạp và xử lý biểu hiện protein dung hợp trong vi khuẩn.
• Kỹ thuật viên tại các trung tâm xét nghiệm y tế và viện pháp y: Tiếp cận cơ chế hoạt động và thông số tối ưu của enzyme KOD chịu nhiệt độ chính xác cao, phục vụ thiết lập các kit chẩn đoán phân tử phát hiện virus (như HPV, HBV), vi khuẩn gây bệnh và phân tích giám định ADN cá thể.
• Chuyên viên nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các công ty sinh phẩm: Sử dụng số liệu thực nghiệm về sắc ký ái lực và công thức hệ đệm PCR để xây dựng dây chuyền sản xuất nội địa hóa enzyme sinh học, giúp giảm thiểu rủi ro đứt gãy chuỗi cung ứng vật tư nhập khẩu.
• Giảng viên các trường đại học khối ngành Khoa học Tự nhiên, Y - Dược: Sử dụng tài liệu như một giáo trình tham khảo chuyên sâu, cung cấp các ví dụ thực tế và dữ liệu ảnh điện di trực quan phục vụ giảng dạy các học phần Kỹ thuật Di truyền, Công nghệ Protein và Sinh học phân tử.

Câu hỏi thường gặp

KOD DNA polymerase có ưu thế gì vượt trội so với Taq polymerase truyền thống?

KOD DNA polymerase sở hữu tốc độ kéo dài chuỗi đạt từ 6 đến 8 kb/phút, nhanh gấp 2 đến 3 lần Taq polymerase. Đặc biệt, enzyme có hoạt tính đọc sửa 3'-5' exonuclease giúp độ chính xác cao hơn 50 lần so với Taq, tỷ lệ gắn sai nucleotide dưới 0,0035%, rất thích hợp cho nhân bản gen kích thước lớn và giải trình tự.

Tại sao việc xử lý nhiệt ở 75°C lại làm mất enzyme KOD-His dù KOD là enzyme bền nhiệt?

Bản thân KOD có tính bền nhiệt cao, nhưng khi biểu hiện trong tế bào chất E. coli, nó nằm xen kẽ với hàng nghìn protein kém bền nhiệt của vi khuẩn chủ. Khi gia nhiệt ở 75°C trong 15 phút, các protein tạp của vi khuẩn bị biến tính, kết tụ hàng loạt và kéo theo phân tử KOD-His vào pha tủa, khiến dịch nổi sau ly tâm không còn giữ được enzyme.

Vì sao hệ thống vector pGEX-4T-1 lại mang lại hiệu quả tinh sạch tốt hơn pET-M trong đề tài này?

Đuôi dung hợp GST (26 kDa) trong vector pGEX-4T-1 hoạt động như một chất trợ tan mạnh mẽ, giúp protein tái tổ hợp KOD cuộn gập đúng cấu trúc không gian trong E. coli. Ngoài ra, liên kết ái lực giữa GST và hạt Glutathione Sepharose 4B có tính đặc hiệu rất cao, cho phép rửa trôi triệt để protein tạp chỉ qua một bước sắc ký đơn giản.

Nồng độ IPTG và điều kiện cảm ứng biểu hiện nào được xác định là tối ưu?

Điều kiện biểu hiện tối ưu được xác định là nuôi cấy tế bào E. coli BL21 (DE3) trong môi trường LB ở 37°C đến khi mật độ quang học OD600 đạt mức 0,6, sau đó bổ sung chất cảm ứng IPTG ở nồng độ cuối cùng là 0,3 mM và tiếp tục nuôi lắc ở 37°C trong vòng 16 giờ liên tục.

Enzyme KOD tái tổ hợp sau tinh sạch có thể khuếch đại những đoạn gen kích thước bao nhiêu?

Thực nghiệm chứng minh enzyme KOD-GST sau thẩm tách có khả năng khuếch đại ổn định và hiệu quả các đoạn DNA đích có kích thước đa dạng từ ngắn (260 bp, 400 bp), trung bình (500 bp, 1100 bp) cho đến đoạn dài (2400 bp) qua 35 chu kỳ nhiệt với độ đặc hiệu băng sản phẩm rất cao.

Kết luận

Nghiên cứu đã giải quyết thành công bài toán công nghệ về sản xuất KOD DNA polymerase tái tổ hợp thông qua các kết quả cốt lõi:

• Tối ưu hóa hoàn chỉnh trình tự mã hóa 774 acid amin của gen KOD với chỉ số thích ứng codon CAI đạt mức tuyệt đối 1,0 và hàm lượng GC 49,55%.
• Nhân dòng và chèn chính xác đoạn gen 2341 bp vào hai hệ vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1 với khung đọc mở chuẩn xác 100%.
• Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp KOD-His (92 kDa) và KOD-GST (116 kDa) trong tế bào chủ E. coli BL21 (DE3) dưới cảm ứng của IPTG 0,3 mM.
• Xác định phương pháp sắc ký ái lực Glutathione Sepharose 4B là quy trình tinh sạch tối ưu, loại bỏ hoàn toàn protein tạp nội bào.
• Khẳng định hoạt tính sinh học của enzyme KOD tái tổ hợp có khả năng khuếch đại đa dạng các đoạn DNA từ 260 bp đến 2400 bp tương đương với các dòng enzyme thương mại quốc tế.

Lộ trình phát triển tiếp theo trong 6 đến 12 tháng tới sẽ tập trung vào việc loại bỏ đuôi GST bằng protease Thrombin và nâng cấp quy mô lên men 10 lít. Các đơn vị nghiên cứu, phòng xét nghiệm y sinh và doanh nghiệp công nghệ sinh học quan tâm đến việc thử nghiệm hoặc chuyển giao quy trình sản xuất enzyme KOD nội địa có thể liên hệ hợp tác để cùng thúc đẩy các giải pháp sinh phẩm chất lượng cao, tự chủ công nghệ tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu (primer-mồi), enzyme DNA polymerase và các điều kiện phản ứng khác thích hợp với enzyme. Phản ứng cần có dNTPs bao gồm khoảng 200 µM mỗi loại Adenosine - , Thymidine - , Guanosine - , Cytosine – triphosphate [33]. Hình 3: Các thành phần chính trong phản ứng PCR [33] Mồi (primers) là những đoạn oligonucleotides dài khoảng 18-30 bases mang nhóm 3’–OH tự do và có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA cần được nhân bản. Mồi được bắt cặp bổ sung với khuôn DNA ở điểm khỏi đầu và kết thúc, giúp DNA polymerase có thể nối và tổng hợp sợi đơn DNA mới.

Sự lựa chọn chiều dài và trình tự mồi phụ thuộc ba yếu tố. Đầu tiên đó là nhiệt độ nóng chảy (biến tính) của mồi, đây là nhiệt độ mà trên nó thì mồi sẽ tách ra khỏi mạch khuôn DNA. Nhiệt độ nóng chảy của mồi thường khoảng từ 60-75 °C. Thứ hai đó là hàm lượng GC trong mồi, thường thì hàm lượng GC nên trong khoảng từ 40-60%.

Ở hàm lượng này, nhiệt độ biến tính của mồi sẽ không quá cao, vì có thể sẽ ảnh hưởng đến hoạt động của DNA polymerase. Nhiệt độ nóng chảy của các mồi nên gần nhau, có thể chênh lệch nhau nhưng không quá 5°C. Yếu tố cuối cùng đó là việc hình thành cấu trúc kẹp tóc, hay tự bắt cặp của các mồi, điều này cũng có thể ảnh hưởng đến chất lượng của phản ứng PCR [6]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Hỗn hợp phản ứng trong môi trường đệm Tris-HCl có pH từ 7.8, KCl, 500 – 1000 µg/ml gelatin hoặc BSA, 0.

Ngoài ra cũng có thể bổ sung hàm lượng thấp cho số chất khử như Triton X-100, Tween-20, dimethylsulphoxide (DMSO) để làm tăng tính đặc hiệu của mồi [33]. Cuối cùng, quan trọng nhất là DNA polymerase được sử dụng để tổng hợp lên mạch DNA mới. Các loại DNA polymerase thương mại dùng trong phản ứng PCR đều có tính bền nhiệt, nhưng khác nhau ở khả năng đọc sửa, độ chính xác và hiệu suất [33]. Giới thiệu về DNA polymerase 1.

Giới thiệu chung Năm 1956, Arthur Kornberg phát hiện ra DNA polymerase I ở Escherichia coli, đây là enzyme đầu tiên được xác định liên quan đến quá trình nhân đôi DNA. Nguyên lý cơ bản về chức năng của DNA polymerase đó là sao chép một đoạn DNA sử dụng một mạch làm khuôn mẫu và một đoạn DNA hay RNA có kích thước nhỏ làm mồi cho quá trình sao chép và tổng hợp từ đầu 5’ đến đầu 3’-OH. DNA polymerase đóng vai trò tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các monodeoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) [30]. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein Dựa trên trình tự protein tương đồng, DNA polymerase được chia thành 5 họ chính đó là Escherichia coli DNA polymerase I (họ A), DNA polymerase II (họ B), DNA polymerase III (họ C), và những loại khác (họ X) [26].

Các loại DNA polymerase khác nhau có thể tìm thấy ở các sinh vật khác nhau. Ví dụ như DNA polymerase I, II, III được tìm thấy ở E. coli hoặc ở các sinh vật nhân thực có thể tìm thấy cả năm loại DNA polymerase (DNA Pol α, β, γ, δ, ε). Các loại DNA polymerase thương mại Hiện nay, các DNA polymerase sử dụng trong phản ứng PCR hầu hết là các polymerase tái tổ hợp.

Các DNA polymerase thương mại này có nguồn gốc từ các loài khác nhau sẽ có sự khác biệt về cấu trúc, đặc tính như là hiệu suất, độ chính xác do khả năng đọc sửa hay tỉ lệ kéo dài chuỗi polynucleotit. Các loại polymerase 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] thường được sử dụng cho phản ứng PCR được thu nhận từ các vi sinh vật bền nhiệt như Thermus aquaticus (Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu polymerase), Thermococcus litoralis (Tli polymerase), Thermus thermophiles (Tth polymerase) và Thermococcus kodakaraensis (KOD polymerase) [9]. Việc lựa chọn polymerase phụ thuộc vào mục đích, loại phản ứng PCR được thực hiện và kích thước của đoạn gen. Vai trò của DNA polymerase trong việc sao chép, tổng hợp và sửa chữa phụ thuộc vào một số đặc tính enzyme quan trọng của polymerase.

Chúng được đánh giá dựa trên các đặc điểm đó là độ đặc hiệu (specificity), tính bền nhiệt (thermostability), hiệu suất (processivity), và độ chính xác (fidelity) [30]. Độ đặc hiệu (specificity) Khuếch đại không đặc hiệu là một trong những trở ngại lớn trong phản ứng PCR, vì nó ảnh hưởng đến năng suất và độ nhạy của việc khuếch đại gen đích. Nếu DNA polymerase có độ đặc hiệu kém thường có thể tạo dimer của mồi hay mồi bám không đặc hiệu trong phản ứng PCR. Để DNA polymerase có độ đặc hiệu tốt hơn nên để enzyme trên đá hoặc bổ sung DNA polymerase ở bước gắn mồi.

Tính bền nhiệt (thermostability) Tính bền nhiệt của DNA polymerase là đặc điểm chính cho phép phản ứng PCR lặp đi lặp lại qua các chu kỳ để khuếch đại các đoạn DNA, do đó đây là một đặc tính quan trọng của DNA polymerase. Khả năng chịu nhiệt của enzyme liên quan đến kết quả của phản ứng PCR qua các chu kỳ. Hiệu suất (processivity) Hiệu suất của PCR số nucleotide trung bình được thêm vào bởi DNA polymerase trong một lần enzyme bám vào khuôn. Hiệu suất tổng hợp của mỗi enzyme quyết định thời gian tổng hợp một đoạn DNA của Polymerase đó.

Một enzyme được cho là có hiệu suất nếu nó duy trì sao chép được một đoạn khuôn dài mà không bị gián đoạn. Hiệu suất của một enzyme có thể được xác định dựa trên những đặc điểm sau: polymerase trap hay tỉ lệ phản ứng bị giới hạn (Limited reaction rate)[23]. Độ chính xác hay tỉ lệ đột biến (fidelity hay error frequency) 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Độ chính xác là một trong những đặc tính quan trọng của polymerase, nó ảnh hưởng đến trình tự đoạn DNA được khuếch đại. DNA polymerase có độ chính xác càng cao thì khả năng đột biến trong quá trình tổng hợp mạch DNA mới càng thấp.

Độ chính xác của phản ứng PCR phụ thuộc vào hoạt tính của vùng 5’- 3’ exonuclease của DNA polymerase, đây là vùng có chức năng đọc sửa trong quá trình tổng hợp sợi DNA mới. Cấu trúc của DNA polymerase Hiện nay, rất nhiều loại DNA polymerase đã được khám phá. Tuy có các trình tự axit amin khác nhau nhưng tất cả các loại DNA polymerase đều có một cấu trúc chung giống bàn tay phải (Hình 4) bao gồm ba phần được gọi là palm (lòng bàn tay), thumb (ngón tay cái) và fingers (ngón tay). Trong đó, cấu trúc của vùng fingers và thumb là khác nhau, còn vùng palm lại tương đồng giữa các loại khác nhau [36].

Trình tự bảo thủ ở vùng palm đóng vai trò là trung tâm hoạt động (là vùng liên kết với kim loại hóa trị 2 thường là Mg2+), với cấu trúc bao gồm 2 chuỗi xoắn α gấp chồng lên nhau và chồng lên gấp β [36]. Vùng fingers giúp xác định chính xác vị trí của khuôn ở trung tâm hoạt động, trong khi đó vùng thumb có liên quan đến việc bám của DNA và đóng vai trò trong hiệu suất của enzyme[36]. Hình 4: Cấu trúc chung của một DNA polymerase [36] 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. KOD DNA polymerase 1.

Tình hình nghiên cứu Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều enzyme thương mại được sử dụng rộng rãi như Taq, Pfu, Phusion hay KOD. Trong đó, KOD là enzyme thế hệ mới với nhiều đặc tính ưu việt so với Taq hay Pfu. Trên thị trường, KOD đã được một số hãng hóa chất trên thế giới đưa vào thương mại như Sigma của Mỹ, TOYOBO của Nhật Bản. Tuy nhiên, để nhập khẩu enzyme này về Việt Nam rất khó khăn về việc vận chuyển, hay giá thành cao.

Việc lựa chọn KOD để nghiên cứu sản xuất tại Việt Nam giúp chủ động hơn về công nghệ sản xuất và nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu. Trên thế giới đã có nghiên cứu về cấu trúc của KOD năm 1997 [32], và một số nghiên cứu tinh sạch enzyme này ở vật chủ E. coli, tuy nhiên kết quả tinh sạch vẫn chưa được công bố cụ thể. Gần đây nhất là nghiên cứu biểu hiện, tinh sạch KOD ở hệ thống biểu hiện nấm men năm 2015 [39].

Như vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme KOD DNA polymerase ở Việt Nam là nhu cầu cấp thiết và cần được triển khai nghiên cứu. Giới thiệu về KOD KOD DNA polymerase thuộc họ DNA polymerases B hay còn gọi là α- DNA polymerase vì nó có trình tự axit amin bảo thủ với DNA polymerase α ở sinh vật nhân thực. KOD được tìm thấy ở vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis hay còn có tên khác là Pyrococcus kodakarensis. Loại vi khuẩn này được phân lập từ khu vực hồ nước nóng gần miệng núi lửa, ở đảo Kodakara, Kagoshima, Nhật Bản [21].

Vi khuẩn này là sinh vật biển, sống trong môi trường kỵ khí, dị dưỡng và chịu nhiệt cao (lên đến 95°C). Tương tự như một số loại enzyme họ B khác, ví dụ như Pfu được phân lập từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus, thì KOD được sử dụng trong các phản ứng PCR, đặc biệt là đối với việc khuếch đại các đoạn DNA dài. Trên thực tế, hoạt tính của KOD DNA polymerase và khả năng ứng dụng của enzyme này trong phản ứng PCR đã được chứng minh trong rất nhiều công bố [20, 31]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng KOD là polymerase có tính bền nhiệt rất tốt, độ chính xác cao nhờ khả năng đọc sửa của vùng 3’ – 5’ exonuclease [32], điều này giúp KOD có sự vượt trội so với Taq và Pfu DNA polymerase.

Cụ thể, qua các số liệu ở Bảng 1 đã cho thấy, KOD có tốc độ kéo dài cao gấp đôi (6-8 kb/phút), số lượng nucleotide trong 1 lần bám của enzyme (>300 base) cao gấp 5 lần so với Taq (50-60 base) và 15 lần so với 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Hơn nữa KOD còn có vùng 3’-5’ exonuclease có khả năng đọc sửa, khiến tỉ lệ đột biến của nó rất thấp giống như ở Pfu đó là 0. Nhiệt độ tối ưu của KOD DNA polymerase là 75°C, tương tự như Pfu [32]. Đặc biệt, KOD DNA polymerase còn có tính bền nhiệt cao hơn gấp khoảng 20 lần so với Taq polymerase ở 95°C.

Do vậy, KOD DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trong các hệ thống PCR yêu cầu nhanh, độ chính xác cao như các phản ứng PCR tạo đột biến, nhân dòng gen hay PCR phát hiện đột biến gây bệnh. Bảng 1: So sánh các đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến [3] AmpliTaq Pfu KOD Tốc độ kéo dài chuỗi 2-4 kb/phút 2-4 kb/phút 6-8 kb/phút Processivitya 50-60 nu 15-20 nu >300 nu 3’-5’ Exonuclease activityb Không Có Có Terminal transferase activityc Có Không Không Độ chính xácd 98.