mở đầu (primer-mồi), enzyme DNA polymerase và các điều kiện phản ứng khác thích hợp với enzyme. Phản ứng cần có dNTPs bao gồm khoảng 200 µM mỗi loại Adenosine - , Thymidine - , Guanosine - , Cytosine – triphosphate [33]. Hình 3: Các thành phần chính trong phản ứng PCR [33] Mồi (primers) là những đoạn oligonucleotides dài khoảng 18-30 bases mang nhóm 3’–OH tự do và có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA cần được nhân bản. Mồi được bắt cặp bổ sung với khuôn DNA ở điểm khỏi đầu và kết thúc, giúp DNA polymerase có thể nối và tổng hợp sợi đơn DNA mới.
Sự lựa chọn chiều dài và trình tự mồi phụ thuộc ba yếu tố. Đầu tiên đó là nhiệt độ nóng chảy (biến tính) của mồi, đây là nhiệt độ mà trên nó thì mồi sẽ tách ra khỏi mạch khuôn DNA. Nhiệt độ nóng chảy của mồi thường khoảng từ 60-75 °C. Thứ hai đó là hàm lượng GC trong mồi, thường thì hàm lượng GC nên trong khoảng từ 40-60%.
Ở hàm lượng này, nhiệt độ biến tính của mồi sẽ không quá cao, vì có thể sẽ ảnh hưởng đến hoạt động của DNA polymerase. Nhiệt độ nóng chảy của các mồi nên gần nhau, có thể chênh lệch nhau nhưng không quá 5°C. Yếu tố cuối cùng đó là việc hình thành cấu trúc kẹp tóc, hay tự bắt cặp của các mồi, điều này cũng có thể ảnh hưởng đến chất lượng của phản ứng PCR [6]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hỗn hợp phản ứng trong môi trường đệm Tris-HCl có pH từ 7.8, KCl, 500 – 1000 µg/ml gelatin hoặc BSA, 0.
Ngoài ra cũng có thể bổ sung hàm lượng thấp cho số chất khử như Triton X-100, Tween-20, dimethylsulphoxide (DMSO) để làm tăng tính đặc hiệu của mồi [33]. Cuối cùng, quan trọng nhất là DNA polymerase được sử dụng để tổng hợp lên mạch DNA mới. Các loại DNA polymerase thương mại dùng trong phản ứng PCR đều có tính bền nhiệt, nhưng khác nhau ở khả năng đọc sửa, độ chính xác và hiệu suất [33]. Giới thiệu về DNA polymerase 1.
Giới thiệu chung Năm 1956, Arthur Kornberg phát hiện ra DNA polymerase I ở Escherichia coli, đây là enzyme đầu tiên được xác định liên quan đến quá trình nhân đôi DNA. Nguyên lý cơ bản về chức năng của DNA polymerase đó là sao chép một đoạn DNA sử dụng một mạch làm khuôn mẫu và một đoạn DNA hay RNA có kích thước nhỏ làm mồi cho quá trình sao chép và tổng hợp từ đầu 5’ đến đầu 3’-OH. DNA polymerase đóng vai trò tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các monodeoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) [30]. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein Dựa trên trình tự protein tương đồng, DNA polymerase được chia thành 5 họ chính đó là Escherichia coli DNA polymerase I (họ A), DNA polymerase II (họ B), DNA polymerase III (họ C), và những loại khác (họ X) [26].
Các loại DNA polymerase khác nhau có thể tìm thấy ở các sinh vật khác nhau. Ví dụ như DNA polymerase I, II, III được tìm thấy ở E. coli hoặc ở các sinh vật nhân thực có thể tìm thấy cả năm loại DNA polymerase (DNA Pol α, β, γ, δ, ε). Các loại DNA polymerase thương mại Hiện nay, các DNA polymerase sử dụng trong phản ứng PCR hầu hết là các polymerase tái tổ hợp.
Các DNA polymerase thương mại này có nguồn gốc từ các loài khác nhau sẽ có sự khác biệt về cấu trúc, đặc tính như là hiệu suất, độ chính xác do khả năng đọc sửa hay tỉ lệ kéo dài chuỗi polynucleotit. Các loại polymerase 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thường được sử dụng cho phản ứng PCR được thu nhận từ các vi sinh vật bền nhiệt như Thermus aquaticus (Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu polymerase), Thermococcus litoralis (Tli polymerase), Thermus thermophiles (Tth polymerase) và Thermococcus kodakaraensis (KOD polymerase) [9]. Việc lựa chọn polymerase phụ thuộc vào mục đích, loại phản ứng PCR được thực hiện và kích thước của đoạn gen. Vai trò của DNA polymerase trong việc sao chép, tổng hợp và sửa chữa phụ thuộc vào một số đặc tính enzyme quan trọng của polymerase.
Chúng được đánh giá dựa trên các đặc điểm đó là độ đặc hiệu (specificity), tính bền nhiệt (thermostability), hiệu suất (processivity), và độ chính xác (fidelity) [30]. Độ đặc hiệu (specificity) Khuếch đại không đặc hiệu là một trong những trở ngại lớn trong phản ứng PCR, vì nó ảnh hưởng đến năng suất và độ nhạy của việc khuếch đại gen đích. Nếu DNA polymerase có độ đặc hiệu kém thường có thể tạo dimer của mồi hay mồi bám không đặc hiệu trong phản ứng PCR. Để DNA polymerase có độ đặc hiệu tốt hơn nên để enzyme trên đá hoặc bổ sung DNA polymerase ở bước gắn mồi.
Tính bền nhiệt (thermostability) Tính bền nhiệt của DNA polymerase là đặc điểm chính cho phép phản ứng PCR lặp đi lặp lại qua các chu kỳ để khuếch đại các đoạn DNA, do đó đây là một đặc tính quan trọng của DNA polymerase. Khả năng chịu nhiệt của enzyme liên quan đến kết quả của phản ứng PCR qua các chu kỳ. Hiệu suất (processivity) Hiệu suất của PCR số nucleotide trung bình được thêm vào bởi DNA polymerase trong một lần enzyme bám vào khuôn. Hiệu suất tổng hợp của mỗi enzyme quyết định thời gian tổng hợp một đoạn DNA của Polymerase đó.
Một enzyme được cho là có hiệu suất nếu nó duy trì sao chép được một đoạn khuôn dài mà không bị gián đoạn. Hiệu suất của một enzyme có thể được xác định dựa trên những đặc điểm sau: polymerase trap hay tỉ lệ phản ứng bị giới hạn (Limited reaction rate)[23]. Độ chính xác hay tỉ lệ đột biến (fidelity hay error frequency) 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Độ chính xác là một trong những đặc tính quan trọng của polymerase, nó ảnh hưởng đến trình tự đoạn DNA được khuếch đại. DNA polymerase có độ chính xác càng cao thì khả năng đột biến trong quá trình tổng hợp mạch DNA mới càng thấp.
Độ chính xác của phản ứng PCR phụ thuộc vào hoạt tính của vùng 5’- 3’ exonuclease của DNA polymerase, đây là vùng có chức năng đọc sửa trong quá trình tổng hợp sợi DNA mới. Cấu trúc của DNA polymerase Hiện nay, rất nhiều loại DNA polymerase đã được khám phá. Tuy có các trình tự axit amin khác nhau nhưng tất cả các loại DNA polymerase đều có một cấu trúc chung giống bàn tay phải (Hình 4) bao gồm ba phần được gọi là palm (lòng bàn tay), thumb (ngón tay cái) và fingers (ngón tay). Trong đó, cấu trúc của vùng fingers và thumb là khác nhau, còn vùng palm lại tương đồng giữa các loại khác nhau [36].
Trình tự bảo thủ ở vùng palm đóng vai trò là trung tâm hoạt động (là vùng liên kết với kim loại hóa trị 2 thường là Mg2+), với cấu trúc bao gồm 2 chuỗi xoắn α gấp chồng lên nhau và chồng lên gấp β [36]. Vùng fingers giúp xác định chính xác vị trí của khuôn ở trung tâm hoạt động, trong khi đó vùng thumb có liên quan đến việc bám của DNA và đóng vai trò trong hiệu suất của enzyme[36]. Hình 4: Cấu trúc chung của một DNA polymerase [36] 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. KOD DNA polymerase 1.
Tình hình nghiên cứu Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều enzyme thương mại được sử dụng rộng rãi như Taq, Pfu, Phusion hay KOD. Trong đó, KOD là enzyme thế hệ mới với nhiều đặc tính ưu việt so với Taq hay Pfu. Trên thị trường, KOD đã được một số hãng hóa chất trên thế giới đưa vào thương mại như Sigma của Mỹ, TOYOBO của Nhật Bản. Tuy nhiên, để nhập khẩu enzyme này về Việt Nam rất khó khăn về việc vận chuyển, hay giá thành cao.
Việc lựa chọn KOD để nghiên cứu sản xuất tại Việt Nam giúp chủ động hơn về công nghệ sản xuất và nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu. Trên thế giới đã có nghiên cứu về cấu trúc của KOD năm 1997 [32], và một số nghiên cứu tinh sạch enzyme này ở vật chủ E. coli, tuy nhiên kết quả tinh sạch vẫn chưa được công bố cụ thể. Gần đây nhất là nghiên cứu biểu hiện, tinh sạch KOD ở hệ thống biểu hiện nấm men năm 2015 [39].
Như vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme KOD DNA polymerase ở Việt Nam là nhu cầu cấp thiết và cần được triển khai nghiên cứu. Giới thiệu về KOD KOD DNA polymerase thuộc họ DNA polymerases B hay còn gọi là α- DNA polymerase vì nó có trình tự axit amin bảo thủ với DNA polymerase α ở sinh vật nhân thực. KOD được tìm thấy ở vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis hay còn có tên khác là Pyrococcus kodakarensis. Loại vi khuẩn này được phân lập từ khu vực hồ nước nóng gần miệng núi lửa, ở đảo Kodakara, Kagoshima, Nhật Bản [21].
Vi khuẩn này là sinh vật biển, sống trong môi trường kỵ khí, dị dưỡng và chịu nhiệt cao (lên đến 95°C). Tương tự như một số loại enzyme họ B khác, ví dụ như Pfu được phân lập từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus, thì KOD được sử dụng trong các phản ứng PCR, đặc biệt là đối với việc khuếch đại các đoạn DNA dài. Trên thực tế, hoạt tính của KOD DNA polymerase và khả năng ứng dụng của enzyme này trong phản ứng PCR đã được chứng minh trong rất nhiều công bố [20, 31]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng KOD là polymerase có tính bền nhiệt rất tốt, độ chính xác cao nhờ khả năng đọc sửa của vùng 3’ – 5’ exonuclease [32], điều này giúp KOD có sự vượt trội so với Taq và Pfu DNA polymerase.
Cụ thể, qua các số liệu ở Bảng 1 đã cho thấy, KOD có tốc độ kéo dài cao gấp đôi (6-8 kb/phút), số lượng nucleotide trong 1 lần bám của enzyme (>300 base) cao gấp 5 lần so với Taq (50-60 base) và 15 lần so với 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Hơn nữa KOD còn có vùng 3’-5’ exonuclease có khả năng đọc sửa, khiến tỉ lệ đột biến của nó rất thấp giống như ở Pfu đó là 0. Nhiệt độ tối ưu của KOD DNA polymerase là 75°C, tương tự như Pfu [32]. Đặc biệt, KOD DNA polymerase còn có tính bền nhiệt cao hơn gấp khoảng 20 lần so với Taq polymerase ở 95°C.
Do vậy, KOD DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trong các hệ thống PCR yêu cầu nhanh, độ chính xác cao như các phản ứng PCR tạo đột biến, nhân dòng gen hay PCR phát hiện đột biến gây bệnh. Bảng 1: So sánh các đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến [3] AmpliTaq Pfu KOD Tốc độ kéo dài chuỗi 2-4 kb/phút 2-4 kb/phút 6-8 kb/phút Processivitya 50-60 nu 15-20 nu >300 nu 3’-5’ Exonuclease activityb Không Có Có Terminal transferase activityc Có Không Không Độ chính xácd 98.