Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống tu hài lutraria rhynchaena jonas 1844 theo hướng tăng trưởng

Nghiên cứu về chỉ thị phân tử trong chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena) theo hướng tăng trưởng là một… 149 trang · Trường Đại học Sư phạm Hà Nội · 2023.

• Tác giả: Triệu Anh Tuấn
• Người hướng dẫn: PGS. TS Nguyễn Xuân Viết
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Triển Chỉ Thị Phân Tử Cho Chọn Giống Tu Hải Tăng Trưởng
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.5. Đối tượng, phạm vi giới hạn của luận án
• 1.6. Những đóng góp mới của luận án
• 1.7. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Điều tra thành phần loài tu hài, hiện trạng nghề nuôi tu hài tại Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài
• 2.3.2. Phương pháp xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L.
• 2.3.3. Phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gene tu hài L.
• 2.3.4. Phương pháp giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài L.
• 2.3.5. Phương pháp phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài
• 2.3.6. Phương pháp phân tích, xử lý dữ liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn, hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh
• 3.1.1. Khảo sát thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn
• 3.1.2. Đánh giá hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn hiện nay
• 3.2. Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L.
• 3.2.1. Khảo sát dữ liệu để xây dựng mã vạch DNA vùng gen 16S rRNA, COI của giống Lutraria trên hệ thống mã vạch quốc tế
• 3.2.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho các loài tu hài
• 3.2.3. Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài L.
• 3.3. Giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã của tu hài L.
• 3.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA
• 3.3.2. Thiết lập thư viện và giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã tu hài
• 3.3.3. Ước lượng kích thước hệ gene tu hài
• 3.3.4. Lắp ráp hệ gene của tu hài L.
• 3.3.5. Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp lại và tìm kiếm đa hình
• 3.3.6. Lắp ráp hệ gene phiên mã
• 3.3.7. Dự đoán và chú thích hệ gene tu hài. So sánh đặc điểm hệ gene L. rhynchaena với các loài hai mảnh vỏ
• 3.4. Sàng lọc, tuyển chọn và phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài
• 3.4.1. Giải trình tự ezRAD-Seq ở tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm
• 3.4.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu, sàng lọc các SNP ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm
• 3.4.3. Sàng lọc outlier loci ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm
• 3.4.4. Sàng lọc chỉ thị SNP tiềm năng ở tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm
• 3.4.5. Thiết kế mồi và nhân đoạn trình tự chứa chỉ thị SNP tiềm năng sàng lọc được ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm
• 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Chỉ Thị Phân Tử Cho Tu Hài Tăng Trưởng

Nghiên cứu về chỉ thị phân tử trong chọn giống tu hài (Lutraria rhynchaena) theo hướng tăng trưởng là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Tu hài, một loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ có giá trị kinh tế cao, đang ngày càng được ưa chuộng. Tuy nhiên, việc sản xuất giống vẫn còn nhiều hạn chế, dẫn đến thoái hóa giống và tăng trưởng chậm. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển các chỉ thị phân tử, đặc biệt là SNP, để hỗ trợ chọn giống, cải thiện năng suất và chất lượng tu hài. Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới (NGS) mở ra cơ hội lớn để khám phá hệ gene của tu hài và xác định các marker liên quan đến tính trạng tăng trưởng. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả nuôi trồng và đáp ứng nhu cầu thị trường ngày càng tăng. Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, thị trường cần khoảng 100 triệu con giống cấp I mỗi năm [13].

1.1. Giới Thiệu Chung Về Tu Hài Lutraria rhynchaena

Tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ sống ở vùng nước biển ấm, độ mặn 25-30‰ [11]. Chúng lọc ăn mùn bã hữu cơ, tảo khuê và sinh vật phù du [10]. Tại Việt Nam, tu hài phân bố và được nuôi nhiều ở Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa. Thịt tu hài giàu dinh dưỡng, đạm và khoáng chất, đặc biệt là các axit amin không thay thế [5]. Tổng diện tích nuôi tu hài ước tính khoảng 1.000 ha, sản lượng đạt 2.621,6 tấn, thu nhập trên 200 tỷ đồng/năm [13]. Nhu cầu tiêu thụ tu hài tăng cao thúc đẩy mở rộng diện tích nuôi, kéo theo nhu cầu lớn về con giống chất lượng.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Chọn Giống Trong Nuôi Tu Hài

Chọn giống đóng vai trò then chốt trong việc cải thiện năng suất và chất lượng tu hài. Phương pháp sản xuất giống truyền thống dẫn đến thoái hóa giống, tăng trưởng chậm và dễ nhiễm bệnh [8]. Quyết định 1664/QĐ-Tg ngày 04/10/2021 nhấn mạnh phát triển nuôi trồng thủy sản bền vững, hạn chế tác động tiêu cực đến môi trường [2]. Điều này đòi hỏi khai thác và phát triển giống bản địa, ứng dụng các chương trình chọn giống khoa học để tăng tỷ lệ sống, tăng trưởng nhanh và khả năng chống chịu. Chọn giống với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử là hướng đi đầy hứa hẹn.

II. Thách Thức Thoái Hóa Giống Tu Hài Giải Pháp Chỉ Thị SNP

Một trong những thách thức lớn nhất trong nuôi tu hài là tình trạng thoái hóa giống do phương pháp sản xuất truyền thống. Giao phối cận huyết dẫn đến tăng trưởng chậm, không đồng đều và dễ bị nhiễm bệnh. Để giải quyết vấn đề này, việc ứng dụng các kỹ thuật chọn giống hiện đại, đặc biệt là sử dụng chỉ thị phân tử, là vô cùng cần thiết. Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphism) được xem là một trong những công cụ hiệu quả và chính xác nhất để xác định các gene liên quan đến tính trạng tăng trưởng. Việc phát triển và ứng dụng chỉ thị SNP sẽ giúp các nhà chọn giống nhanh chóng tạo ra những giống tu hài mới có năng suất và chất lượng cao hơn. Theo nghiên cứu [89], chỉ thị SNP có thể xuất hiện ở vùng gen mã hóa, tác động trực tiếp đến tính trạng quan tâm.

2.1. Hậu Quả Của Thoái Hóa Giống Trong Nuôi Tu Hài

Thoái hóa giống gây ra nhiều hệ lụy cho nghề nuôi tu hài. Tăng trưởng chậm làm kéo dài thời gian nuôi, tăng chi phí và giảm lợi nhuận. Sự không đồng đều về kích thước gây khó khăn trong thu hoạch và chế biến. Tu hài thoái hóa dễ bị nhiễm bệnh, gây thiệt hại lớn về kinh tế. Việc duy trì và cải thiện chất lượng giống là yếu tố then chốt để đảm bảo sự phát triển bền vững của ngành nuôi tu hài.

2.2. Ưu Điểm Của Chỉ Thị SNP Trong Chọn Giống

Chỉ thị SNP có nhiều ưu điểm so với các loại chỉ thị phân tử khác. Chúng có độ chính xác cao, dễ dàng phân tích và có thể được sử dụng để đánh giá di truyền ở quy mô lớn. Chỉ thị SNP cũng có thể được sử dụng để xác định các gene liên quan đến các tính trạng phức tạp, chẳng hạn như tăng trưởng và khả năng chống bệnh. Việc sử dụng chỉ thị SNP trong chọn giống giúp tăng tốc quá trình chọn lọc và cải thiện hiệu quả chọn giống.

2.3. Ứng Dụng Kỹ Thuật Giải Trình Tự Gene Thế Hệ Mới NGS

Kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới (NGS) đã mở ra một kỷ nguyên mới cho nghiên cứu di truyền và chọn giống. NGS cho phép giải trình tự toàn bộ hệ gene của một sinh vật trong thời gian ngắn và với chi phí thấp. Dữ liệu từ NGS có thể được sử dụng để phát hiện các chỉ thị SNP, xác định các gene liên quan đến các tính trạng quan trọng và đánh giá đa dạng di truyền. Việc ứng dụng NGS trong nghiên cứu tu hài sẽ giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ sở di truyền của các tính trạng quan trọng và phát triển các phương pháp chọn giống hiệu quả hơn.

III. Phương Pháp Xây Dựng Mã Vạch DNA Cho Tu Hài Lutraria rhynchaena

Xây dựng mã vạch DNA là một phương pháp quan trọng để nhận dạng chính xác loài tu hài (Lutraria rhynchaena). Mã vạch DNA sử dụng các đoạn gene đặc trưng để phân biệt các loài khác nhau. Trong nghiên cứu này, các vùng gene COI và 16S rRNA được sử dụng để xây dựng mã vạch DNA cho tu hài. Việc xây dựng mã vạch DNA giúp xác định chính xác loài tu hài trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống, đồng thời hỗ trợ truy xuất nguồn gốc sản phẩm. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học quan trọng để nhận dạng chính xác loài tu hài phục vụ trực tiếp cho đề tài luận án về lấy mẫu nghiên cứu giải trình tự hệ gene.

3.1. Lựa Chọn Vùng Gene COI Và 16S rRNA

Vùng gene COI (Cytochrome C Oxidase subunit I) và 16S rRNA là hai vùng gene phổ biến được sử dụng trong xây dựng mã vạch DNA. COI có tốc độ tiến hóa nhanh, phù hợp để phân biệt các loài gần nhau. 16S rRNA có tốc độ tiến hóa chậm hơn, phù hợp để phân biệt các nhóm loài lớn hơn. Việc sử dụng cả hai vùng gene giúp tăng độ chính xác của mã vạch DNA.

3.2. Quy Trình Xây Dựng Mã Vạch DNA

Quy trình xây dựng mã vạch DNA bao gồm các bước sau: thu thập mẫu, tách chiết DNA, khuếch đại vùng gene mục tiêu bằng PCR, giải trình tự DNA và phân tích dữ liệu. Trình tự DNA thu được được so sánh với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu để xác định loài. Mã vạch DNA được tạo ra có thể được sử dụng để nhận dạng loài một cách nhanh chóng và chính xác.

3.3. Ứng Dụng Của Mã Vạch DNA Trong Nghiên Cứu Tu Hài

Mã vạch DNA có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu tu hài. Nó có thể được sử dụng để xác định chính xác loài tu hài trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống. Mã vạch DNA cũng có thể được sử dụng để truy xuất nguồn gốc sản phẩm tu hài, giúp bảo vệ người tiêu dùng và ngăn chặn gian lận thương mại. Ngoài ra, mã vạch DNA có thể được sử dụng để theo dõi sự phân bố và đa dạng di truyền của tu hài trong tự nhiên.

IV. Giải Pháp Phát Triển Chỉ Thị SNP Liên Quan Tăng Trưởng Tu Hài

Phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng là một bước quan trọng trong việc cải thiện năng suất tu hài. Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật giải trình tự ezRAD-Seq để xác định các SNP khác nhau giữa nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Các SNP này sau đó được sàng lọc và đánh giá để xác định những SNP có liên quan chặt chẽ đến tính trạng tăng trưởng. Việc sử dụng chỉ thị SNP giúp các nhà chọn giống chọn lọc những cá thể có tiềm năng tăng trưởng cao, từ đó cải thiện năng suất của quần thể tu hài. Một số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tu hài được phát hiện là có giá trị khoa học ứng dụng đối với công tác chọn giống tu hài theo hướng tăng trưởng ở Việt Nam.

4.1. Kỹ Thuật Giải Trình Tự ezRAD Seq

ezRAD-Seq (Enzyme Restriction-site Associated DNA sequencing) là một kỹ thuật giải trình tự DNA cho phép xác định các SNP trên toàn bộ hệ gene một cách hiệu quả và tiết kiệm chi phí. Kỹ thuật này sử dụng enzyme giới hạn để cắt DNA thành các đoạn nhỏ, sau đó chọn lọc các đoạn DNA có kích thước phù hợp và giải trình tự. Dữ liệu giải trình tự được sử dụng để xác định các SNP khác nhau giữa các cá thể hoặc nhóm cá thể.

4.2. Sàng Lọc Và Đánh Giá Chỉ Thị SNP

Sau khi xác định được các SNP, cần tiến hành sàng lọc và đánh giá để xác định những SNP có liên quan chặt chẽ đến tính trạng tăng trưởng. Các phương pháp thống kê và tin sinh học được sử dụng để phân tích dữ liệu và xác định các SNP có ảnh hưởng đáng kể đến tính trạng tăng trưởng. Các SNP này sau đó được sử dụng để phát triển các marker di truyền có thể được sử dụng trong chọn giống.

4.3. Ứng Dụng Chỉ Thị SNP Trong Chọn Giống Tu Hài

Chỉ thị SNP có thể được sử dụng để chọn lọc những cá thể tu hài có tiềm năng tăng trưởng cao. Các nhà chọn giống có thể sử dụng các marker di truyền dựa trên SNP để xác định những cá thể mang các allele có lợi cho tăng trưởng. Những cá thể này sau đó được sử dụng để tạo ra thế hệ con có năng suất cao hơn. Việc sử dụng chỉ thị SNP giúp tăng tốc quá trình chọn lọc và cải thiện hiệu quả chọn giống.

V. Kết Quả Cơ Sở Dữ Liệu Phân Tử Hệ Gene Tham Chiếu Tu Hài

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử và hệ gene tham chiếu cho tu hài (Lutraria rhynchaena). Dữ liệu trình tự hệ gene của tu hài trong kết quả của đề tài luận án là có giá trị đối với khoa học nghiên cứu hệ gene, là cơ sở để khai thác và phát triển bộ chỉ thị phân tử cho các nhà nghiên cứu chọn tạo giống tu hài. Với bộ dữ liệu hệ gene lần đầu tiên cung cấp được hệ gene tham chiếu tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844).

5.1. Ý Nghĩa Của Hệ Gene Tham Chiếu

Hệ gene tham chiếu là một bản đồ hoàn chỉnh của hệ gene của một loài. Nó cung cấp thông tin về vị trí và chức năng của tất cả các gene trong hệ gene. Hệ gene tham chiếu là một công cụ quan trọng cho các nhà nghiên cứu di truyền và chọn giống. Nó có thể được sử dụng để xác định các gene liên quan đến các tính trạng quan trọng, phát triển các marker di truyền và đánh giá đa dạng di truyền.

5.2. Ứng Dụng Của Cơ Sở Dữ Liệu Phân Tử

Cơ sở dữ liệu phân tử chứa thông tin về các chỉ thị phân tử, trình tự DNA và các dữ liệu di truyền khác. Cơ sở dữ liệu này có thể được sử dụng để xác định các gene liên quan đến các tính trạng quan trọng, phát triển các marker di truyền và đánh giá đa dạng di truyền. Cơ sở dữ liệu phân tử là một công cụ quan trọng cho các nhà nghiên cứu di truyền và chọn giống.

VI. Kết Luận Tiềm Năng Ứng Dụng Chỉ Thị Phân Tử Trong Chọn Giống

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng ứng dụng của chỉ thị phân tử, đặc biệt là chỉ thị SNP, trong chọn giống tu hài. Việc phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng sẽ giúp các nhà chọn giống tạo ra những giống tu hài mới có năng suất và chất lượng cao hơn. Nghiên cứu này cũng cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử và hệ gene tham chiếu cho tu hài, mở ra nhiều cơ hội cho các nghiên cứu di truyền và chọn giống trong tương lai. Một số chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng được phát triển có ý nghĩa phục vụ công tác chọn tạo giống tu hài theo hướng tăng trưởng nhờ chỉ thị phân tử.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc xác định các gene liên quan đến các tính trạng quan trọng khác, chẳng hạn như khả năng chống bệnh và chất lượng thịt. Cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của việc sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống tu hài ở quy mô lớn. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu để phát triển các phương pháp chọn giống hiệu quả hơn, chẳng hạn như chọn giống dựa trên toàn bộ hệ gene (GWS).

6.2. Đề Xuất Cho Ngành Nuôi Tu Hài

Ngành nuôi tu hài cần đầu tư vào nghiên cứu và phát triển các phương pháp chọn giống hiện đại, đặc biệt là sử dụng chỉ thị phân tử. Cần có các chương trình đào tạo để nâng cao năng lực của các nhà chọn giống và người nuôi tu hài. Ngoài ra, cần có các chính sách hỗ trợ để khuyến khích việc ứng dụng các công nghệ mới trong ngành nuôi tu hài.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844), còn gọi là tu hài vòi trắng (tên tiếng Anh: Snout Otter Clam hay Otter Clam), là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, phân bố tự nhiên và được nuôi tại các vùng biển nhiệt đới ấm (18–30°C, độ mặn 25–30‰) như Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa. Tại Việt Nam, diện tích nuôi tu hài đạt khoảng 1.000 ha với sản lượng khoảng 2.621,6 tấn/năm và giá trị kinh tế trên 200 tỷ đồng/năm. Thị trường nuôi thương phẩm đòi hỏi khoảng 100 triệu con giống cấp I mỗi năm.

Tuy nhiên, nghề nuôi tu hài đối mặt với nhiều trở ngại:

• Công tác sản xuất con giống phần lớn dựa vào phương pháp truyền thống, chưa áp dụng các quy trình chọn giống phân tử, dẫn đến tình trạng cận huyết, thoái hóa giống, sinh trưởng không đồng đều và suy giảm sức đề kháng trước dịch bệnh (điển hình là dịch bệnh sưng vòi bùng phát giai đoạn 2012–2013).
• Nguồn giống phụ thuộc vào đánh bắt tự nhiên hoặc nhập tiểu ngạch không rõ nguồn gốc, tỉ lệ sống thấp.
• Về mặt di truyền học, dữ liệu hệ gene tham chiếu hoàn chỉnh (reference genome) của loài Lutraria rhynchaena chưa được giải mã đầy đủ; các nghiên cứu chỉ thị phân tử trước đây mới dừng lại ở phân tích đa dạng di truyền quần thể bằng chỉ thị ty thể hoặc microsatellite, chưa phát triển được hệ thống chỉ thị đa hình nucleotide đơn (SNP) gắn với các tính trạng kinh tế cụ thể như tốc độ tăng trưởng để phục vụ chọn giống hiện đại.

Đề tài được thực hiện nhằm đáp ứng định hướng tại Quyết định số 1664/QĐ-TTg ngày 04/10/2021 của Thủ tướng Chính phủ về Đề án phát triển nuôi trồng thủy sản trên biển đến năm 2030, tầm nhìn đến năm 2045, chú trọng khai thác nguồn giống bản địa qua các chương trình chọn giống khoa học.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 4 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Đánh giá được thành phần loài tu hài, tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài của huyện Vân Đồn – tỉnh Quảng Ninh.
2. Xây dựng được mã vạch DNA phục vụ nhận dạng chính xác tu hài (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844).
3. Giải trình tự hệ gene tu hài và phát triển được bộ chỉ thị SNP để phục vụ xây dựng cơ sở dữ liệu phân tử của tu hài (Lutraria rhynchaena).
4. Phát triển được một số chỉ thị SNP liên quan đến tăng trưởng ở tu hài góp phần phục vụ công tác chọn tạo giống.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Loài tu hài vòi trắng (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844), thuộc chi Lutraria, họ Vọp (Mactridae), bộ Ngao (Veneroida), lớp Hai mảnh vỏ (Bivalvia), ngành Thân mềm (Mollusca).
• Phạm vi không gian: Vùng biển huyện đảo Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh (thu mẫu thực địa tại 8 xã, thị trấn); các thí nghiệm sinh học phân tử được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học - Trường Cao đẳng Kinh tế, Kỹ thuật và Thủy sản (Bắc Ninh) và Trung tâm Công nghệ Genomics - Đại học Deakin (Geelong, Victoria, Australia).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai từ tháng 3/2018 đến tháng 12/2021.
• Phạm vi nội dung: Điều tra sinh thái quần thể tự nhiên và nghề nuôi; xây dựng mã vạch DNA từ vùng gene 16S rRNA và COI; giải trình tự toàn bộ hệ gene (WGS) và hệ gene phiên mã (transcriptome); sàng lọc biến dị di truyền SNP liên kết tính trạng tăng trưởng trên hai nhóm cá thể phân tách theo giá trị chọn giống ước tính (EBV).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Tác giả đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế theo các nhóm nội dung:

1. Nghiên cứu về phân loại học và mã vạch DNA (DNA barcoding):

   • Paul Hebert (2003) khởi xướng phương pháp mã vạch DNA sử dụng vùng gene COI ty thể (~650 bp) để định danh gần 200 loài bộ Cánh vảy với độ chính xác cao; tổ chức CBOL (2004) chuẩn hóa hệ thống dữ liệu mã vạch toàn cầu.
   • Taberlet và cs. (2007) xác lập 4 tiêu chí cho mã vạch DNA chuẩn.
   • Liu và cs. (2018) kết hợp gene ty thể (COI, 16S rRNA) và gene nhân (18S, 28S, Histone H3) để phân loại 56 loài ngao, áp dụng ngưỡng sai khác di truyền 3% đối với động vật thân mềm.
   • Setiamarga và cs. (2019) phân tích phát sinh loài cho 5 loài sò tại vùng biển Nada (Nhật Bản) bằng gene COI và Histone.
   • Ứng dụng mã vạch trong giám định và truy xuất nguồn gốc các loài hai mảnh vỏ thuộc họ Mytilidae, Pectinidae, Ostreidae được phát triển nhằm chống gian lận thương mại thực phẩm.

2. Nghiên cứu chọn giống theo kiểu gene và chỉ thị SNP liên quan đến tăng trưởng:

   • Feng và cs. (2014) giải trình tự đoạn gene PyIGFBP dài 10.193 bp ở sò điệp, xác định SNP 1054 A > G liên quan đến kích thước vỏ và khối lượng thân (kiểu gene GG có giá trị tăng trưởng cao nhất, AG thấp nhất).
   • Nghiên cứu gene Myostatin (CfMSTN) ở sò điệp Zhikong (Chlamys farreri) phát hiện SNP g-1162 G > T vùng 5' điều hòa phát triển cơ vân, trong đó kiểu gene TT có các chỉ tiêu sinh trưởng vượt trội so với GT và GG.
   • Nghiên cứu các SNP trên gene PyE2F3-1 và PyE2F3-2 ở sò; phân tích haplotype vùng điều hòa gene CgTPH ở hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) xác định SNP -272 C/T tác động đến vị trí gắn yếu tố phiên mã FoxO và CUX, ảnh hưởng đến tổng hợp 5-HT và tốc độ lớn.
   • Chỉ thị SNP trong gene amylase liên quan đến sinh trưởng ở Crassostrea gigas, và SNP trong gene Hsp70 liên quan đến tính kháng bệnh ở bào ngư Haliotis rubra.

3. Nghiên cứu giải trình tự hệ gene ở động vật hai mảnh vỏ:

   • Đến thời điểm nghiên cứu, hệ gene của 13 loài thân mềm hai mảnh vỏ đã được công bố: Scapharca broughtonii, Pinctada fucata, Chlamys farreri, Argopecten purpuratus, Ruditapes philippinarum, Mytilus galloprovincialis, Saccostrea glomerata, Venustaconcha ellipsiformis, Modiolus philippinarum, Bathymodiolus platifrons, Limnoperna fortunei, Patinopecten yessoensis, và Crassostrea gigas.

4. Nghiên cứu di truyền phân tử trên đối tượng tu hài:

   • Gan và cs. (2016) công bố hệ gene ty thể của Lutraria rhynchaena (kích thước ghi nhận chứa 12 gene mã hóa protein, 22 tRNA, tỉ lệ A+T chiếm 69%, G+C chiếm 31%).
   • Thái Thanh Bình và cs. (2015, 2016) sử dụng đoạn gene 16S rRNA phân tích 30 mẫu tu hài tại Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa, phát hiện 4 haplotype (đa dạng haplotype 0,570 ± 0,09) và phát triển 12 chỉ thị microsatellite.
   • Trần Thị Trang và cs. (2017) đánh giá đa dạng di truyền tu hài bằng microsatellite: số alen từ 6–12 (trung bình 9 alen/locus), $H_o = 0,371–0,459$, $H_e = 0,402–0,598$, hệ số cận huyết $F_{is} = 0,058–0,248$, sai khác quần thể $F_{st} = 0,015–0,121$.
   • Năm 2020, hệ gene metagenome của Lutraria philippinarum tại Cát Bà được lắp ráp với kích thước khoảng 542 Mbp, gồm 2.405 scaffolds ($N_{50} = 0,9\text{ Mbp}$), dự đoán 30.533 gene.

Khoảng trống luận án giải quyết

Mặc dù đã có các nghiên cứu sơ khởi về chỉ thị microsatellite và hệ gene ty thể, loài tu hài Lutraria rhynchaena chưa có hệ gene tham chiếu chuẩn phục vụ cho các phân tích di truyền học số lượng và chức năng. Đồng thời, chưa có công trình nào sàng lọc hệ thống chỉ thị SNP quy mô toàn hệ gene liên kết trực tiếp với giá trị chọn giống tăng trưởng (EBV) ở tu hài. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách cung cấp dữ liệu hệ gene nhân, hệ gene phiên mã và phát triển tập hợp các chỉ thị SNP tiềm năng phục vụ chọn giống phân tử.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm áp dụng

• Lý thuyết di truyền số lượng: Tính trạng tăng trưởng ở thân mềm là tính trạng số lượng chịu sự kiểm soát của đa gene và tương tác với môi trường, có hệ số di truyền từ trung bình đến cao (hệ số di truyền thường cho phép cải thiện 10–20% qua mỗi thế hệ chọn lọc). Cá thể dị hợp tử thường có ưu thế trao đổi chất và tốc độ lớn nhanh hơn cá thể đồng hợp tử.
• Lý thuyết phân loại phân tử và mã vạch DNA: Dựa trên mức độ biến dị và bảo tồn của các đoạn DNA ty thể (16S rRNA và COI) để phân định loài độc lập với các biến đổi hình thái do môi trường.
• Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và kỹ thuật ezRAD: Sử dụng enzyme cắt giới hạn kết hợp giải trình tự thông lượng cao để phân tích đa hình toàn hệ gene mà không cần biết trước toàn bộ thông tin trình tự.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

                             QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG THỂ
[Điều tra sinh thái & nghề nuôi]   [Xây dựng mã vạch DNA]              [Giải trình tự WGS & RNA-Seq]
  - 40 điểm tại 8 xã/thị trấn        - Vùng gene 16S rRNA (437 bp)       - Mô cơ màng áo (DNA: WGS)
  - Khung định lượng 10 m²           - Vùng gene COI (615 bp)            - Mô tiêu hóa (RNA: RNA-Seq)
  - Mật độ (A) & Trữ lượng (B)       - Cây phát sinh loài (ML, BI)       - Đánh giá BUSCO, k-mers
                                     - Mã QR tích hợp                    - Lắp ráp & Chú thích gene
                                                                       [Sàng lọc SNP Tăng trưởng]
                                                                         - 30 mẫu nhanh (EBV cao)
                                                                         - 30 mẫu chậm (EBV thấp)
                                                                         - ezRAD-Seq (MboI + Sau3AI)
                                                                         - Pipeline dDocent & Stacks
                                                                         - Xác định 11 SNP tiềm năng
                                                                         - Thiết kế mồi PCR kiểm chứng

1. Phương pháp điều tra thực địa:

   • Thiết lập 40 điểm khảo sát tại 8 xã/thị trấn huyện Vân Đồn theo phương pháp vùng triều (English S., 1994).
   • Dùng khung định lượng $10\text{ m}^2$ để thu mẫu, xác định mật độ $A$ ($\text{con/m}^2$) và trữ lượng tức thời $W = B \times S$ (với $B$ là trữ lượng trung bình $\text{g/m}^2$, $S$ là diện tích bãi triều).
   • Đánh giá mức độ suy giảm nguồn lợi $D = P_t / P_n$.

2. Phương pháp xây dựng mã vạch DNA:

   • Thu thập và đối chiếu trình tự 16S rRNA và COI của chi Lutraria trên GenBank bằng Megablast.
   • Căn chỉnh trình tự bằng Clustal Omega.
   • Xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML trên MEGA X) và Bayesian Inference (BI trên BEAST).
   • Tạo lập mã QR tích hợp thông tin mã vạch DNA nhận dạng loài.

3. Phương pháp giải trình tự WGS và Transcriptome:

   • Chiết xuất DNA từ 50 mg mô cơ màng áo và RNA từ 50 mg mô tiêu hóa của 01 cá thể tu hài.
   • Chuẩn bị thư viện TruSeq Nano DNA và RNA; giải trình tự trên hệ thống Illumina tại Đại học Deakin (Australia).
   • Ước lượng kích thước hệ gene qua phân tích tần số $k\text{-mers}$, kiểm tra độ hoàn chỉnh bằng BUSCO, lắp ráp de novo và chú giải chức năng gene.

4. Phương pháp ezRAD-Seq phát hiện SNP liên quan tăng trưởng:

   • Vật liệu mẫu: 30 cá thể nhóm tăng trưởng nhanh (chọn ngẫu nhiên từ 63 gia đình có EBV cao nhất) và 30 cá thể nhóm tăng trưởng chậm (chọn từ 43 gia đình có EBV thấp nhất) từ đàn chọn giống của Trường Cao đẳng Kinh tế, Kỹ thuật và Thủy sản tại Vân Đồn.
   • Quy trình thư viện: DNA được xử lý methyl hóa Dam, phân cắt bằng hai enzyme giới hạn MboI và Sau3AI, tinh sạch và chọn kích thước đoạn chèn 350–550 bp bằng hạt từ SPB (Sample Purification Beads), gắn adapter Illumina và khuếch đại thư viện bằng PCR.
   • Xử lý tin sinh: Kiểm tra chất lượng dữ liệu bằng FastQC; dóng hàng lên hệ gene tham chiếu bằng BWA; gọi biến dị và lọc locus ngoại lai (outlier loci) bằng pipeline dDocent và Stacks; xác định các SNP đặc thù và thiết kế mồi PCR kiểm chứng.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Chương 1 tổng thuật các kiến thức nền tảng về sinh học, phân loại học, hiện trạng phân bố và khai thác tu hài trên thế giới và tại Việt Nam. Về mặt phân loại, tu hài Lutraria rhynchaena (tên đồng danh L. philippinarum) thuộc họ Mactridae. Về sinh thái, loài phân bố ở vùng triều đáy cát, sỏi, mùn bã hữu cơ, lọc ăn sinh vật phù du và có khả năng vùi sâu 5–7 cm dưới đáy biển.

Chương này phân tích các yếu tố tự nhiên tại huyện Vân Đồn: diện tích mặt nước rộng, nguồn thức ăn thực vật phù du phong phú gồm 76 loài (thuộc hai ngành Bacillariophyta và Pyrrophyta với mật độ $2,5 \times 10^6$ đến $8 \times 10^6\text{ tế bào/m}^3$), biên độ triều đạt tối đa 4,8 m, tạo môi trường thuận lợi cho nuôi nhuyễn thể. Tuy nhiên, các yếu tố rủi ro gồm hiện tượng ngọt hóa đột ngột do mưa bão mùa hè và rét đậm mùa đông kèm bão lớn ảnh hưởng đến tỉ lệ sống.

Phần tổng quan lý thuyết di truyền chỉ ra rằng chọn lọc tính trạng số lượng qua kiểu hình bị giới hạn bởi tương tác môi trường, do đó cần tiếp cận qua kiểu gene bằng các công nghệ chỉ thị DNA (từ RFLP, RAPD, AFLP, SSR đến SNP và kỹ thuật RAD-Seq/ezRAD) nhằm nâng cao độ chính xác chọn giống.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn vật liệu sinh học, địa điểm thu mẫu và quy trình kỹ thuật phòng thí nghiệm và tin sinh học:

• Địa bàn và mẫu điều tra: 40 điểm khảo sát tại 8 xã/thị trấn ven biển Vân Đồn.
• Mẫu giải trình tự hệ gene: Sử dụng mô cơ màng áo và mô đường tiêu hóa của tu hài vòi trắng thu tại Vân Đồn.
• Mẫu phân tích SNP tăng trưởng: 60 cá thể phân chia thành 2 nhóm hình thái - di truyền đối lập dựa trên giá trị EBV (30 mẫu sinh trưởng nhanh từ 63 gia đình EBV cao; 30 mẫu sinh trưởng chậm từ 43 gia đình EBV thấp).
• Quy trình kỹ thuật: Mô tả chi tiết các phản ứng hóa sinh gồm tách chiết DNA/RNA, phản ứng Dam methyl hóa, cắt hạn chế MboI/Sau3AI, gắn adapter TruSeq, quy trình PCR khuếch đại thư viện ezRAD và các tham số vận hành phần mềm chuyên dụng (Megablast, Clustal Omega, MEGA X, BEAST, dDocent, Stacks, BWA, SAMtools, BUSCO).

Thông số nghiên cứu	Quy mô / Đặc tính kỹ thuật
Số điểm khảo sát thực địa	40 điểm tại 8 xã/thị trấn thuộc huyện Vân Đồn
Mẫu giải mã hệ gene (WGS & Transcriptome)	01 cá thể (50 mg mô cơ màng áo; 50 mg mô tiêu hóa)
Mẫu sàng lọc SNP liên quan tăng trưởng	60 cá thể (30 cá thể nhóm EBV cao; 30 cá thể nhóm EBV thấp)
Enzyme cắt hạn chế sử dụng trong ezRAD	MboI và Sau3AI
Kích thước đoạn DNA thư viện ezRAD chọn lọc	350 – 550 bp
Công cụ dóng hàng và xử lý SNP	dDocent, Stacks, BWA, SAMtools

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thành phần loài, hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn

Kết quả điều tra ghi nhận loài phân bố tự nhiên và nuôi thương phẩm chủ yếu tại Vân Đồn là tu hài vòi trắng Lutraria rhynchaena. Tổng diện tích quy hoạch phát triển nuôi trồng thủy sản của huyện đạt 14.886 ha, trong đó nuôi nhuyễn thể chiếm 3.927 ha (diện tích nuôi tu hài chiếm khoảng 32%). Các hình thức nuôi chính gồm: nuôi rải đáy bãi triều, nuôi lồng (rổ) treo trên bè và nuôi lồng đặt đáy.

Nghề nuôi tu hài mang lại hiệu quả kinh tế cao nhưng đối mặt với thách thức lớn về thiếu hụt con giống tại chỗ (nguồn sản xuất tại địa phương chỉ đáp ứng 5–10% nhu cầu, phần còn lại phải nhập từ các tỉnh khác hoặc tiểu ngạch không kiểm soát được chất lượng) và nguy cơ dịch bệnh bùng phát.

3.2. Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài Lutraria rhynchaena

Nghiên cứu đã khảo sát và phân tích trình tự hai vùng gene ty thể đặc trưng của chi Lutraria:

• Vùng gene 16S rRNA (chiều dài phân tích 437 bp).
• Vùng gene COI (chiều dài phân tích 615 bp).

So sánh mức độ tương đồng và sai khác nucleotide giữa L. rhynchaena với các loài khác trong cùng chi (L. australis, L. philippinarum, v.v.) trên cơ sở dữ liệu GenBank cho thấy độ đặc hiệu phân loại cao. Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo hai thuật toán độc lập (Maximum Likelihood - ML và Bayesian Inference - BI) đều phân tách rõ ràng loài L. rhynchaena thành một nhánh đơn ngành độc lập với độ tin cậy thống kê cao. Dữ liệu trình tự mã vạch đã được số hóa và tích hợp thành công vào cấu trúc mã QR phục vụ nhận dạng và truy xuất nguồn gốc.

Vùng gene mã vạch	Kích thước phân tích (bp)	Phương pháp phân tích phát sinh loài	Ứng dụng nhận dạng
16S rRNA	437 bp	Maximum Likelihood (ML) & Bayesian (BI)	Phân định loài, tích hợp mã QR
COI	615 bp	Maximum Likelihood (ML) & Bayesian (BI)	Giám định phân tử, phân loại học

3.3. Giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã của Lutraria rhynchaena

• Hệ gene nhân (WGS): Dữ liệu giải trình tự NGS toàn bộ hệ gene đạt chất lượng cao; phân tích phân bố $k\text{-mers}$ cho phép ước lượng kích thước hệ gene và mức độ dị hợp tử. Dữ liệu lắp ráp de novo được đánh giá độ hoàn chỉnh thông qua bộ chuẩn BUSCO. Kết quả dự đoán và chú giải chức năng gene cung cấp bộ dữ liệu hệ gene tham chiếu chuẩn cho loài L. rhynchaena trên ngân hàng gene quốc tế GenBank.
• Hệ gene phiên mã (Transcriptome): Giải trình tự RNA-Seq từ mô tiêu hóa thu được tập hợp contig biểu hiện cao, hỗ trợ việc chú thích chính xác các vùng mã hóa protein và các con đường chuyển hóa liên quan đến dinh dưỡng và tăng trưởng.

3.4. Sàng lọc, tuyển chọn và phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng

• Dữ liệu ezRAD-Seq: Quá trình giải trình tự ezRAD-Seq trên 60 cá thể thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh ($N = 30$) và tăng trưởng chậm ($N = 30$) tạo ra bộ dữ liệu đọc chất lượng cao ở cả hai chiều đọc xuôi và ngược.
• Xử lý biến dị: Dữ liệu được dóng hàng lên hệ gene tham chiếu thông qua hai công cụ dDocent và Stacks. Kết quả ghi nhận hàng nghìn biến dị phân tử phân bố trên toàn hệ gene.
• Sàng lọc Locus ngoại lai và SNP chức năng: Phân tích tần số alen và sàng lọc outlier loci giữa hai nhóm kiểu hình cực đoan đã phát hiện các biến dị có sự sai khác mang ý nghĩa thống kê. Trong đó, nghiên cứu tập trung phân tích biến dị trong 12 gene chức năng liên quan trực tiếp đến các con đường điều hòa sinh trưởng, phát triển cơ và chuyển hóa năng lượng.
• Phát hiện SNP tiềm năng: Luận án đã xác định được 11 chỉ thị SNP tiềm năng có mối liên kết chặt chẽ với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tu hài.
• Thiết kế mồi kiểm chứng: Đã thiết kế thành công các cặp mồi PCR đặc hiệu bao quanh các vị trí SNP tiềm năng, tiến hành khuếch đại và kiểm chứng sản phẩm PCR, tạo công cụ phân tử sẵn sàng ứng dụng cho chọn lọc cá thể mang kiểu gene mong muốn.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Dữ liệu phân loại và phát sinh chủng loại: Cung cấp dẫn liệu khoa học chuẩn xác về mã vạch DNA của loài tu hài Lutraria rhynchaena dựa trên hai đoạn gene ty thể 16S rRNA (437 bp) và COI (615 bp), làm rõ mối quan hệ phát sinh loài trong giống Lutraria.
2. Dữ liệu hệ gene tham chiếu: Lần đầu tiên giải mã và công bố dữ liệu toàn bộ hệ gene (WGS) và hệ gene phiên mã (Transcriptome) của tu hài vòi trắng Lutraria rhynchaena trên cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank, bổ sung nguồn tư liệu genomic cho lớp Hai mảnh vỏ (Bivalvia).
3. Phát hiện chỉ thị phân tử tăng trưởng: Ứng dụng kỹ thuật ezRAD-Seq xác định được 11 chỉ thị SNP tiềm năng liên kết với tính trạng tốc độ tăng trưởng ở tu hài, đóng góp cơ sở lý luận cho di truyền học chức năng ở động vật thân mềm.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Công cụ định danh và truy xuất nguồn gốc: Bộ mã vạch DNA và mã QR tương ứng cung cấp công cụ kỹ thuật chính xác phục vụ công tác giám định loài, quản lý nguồn lợi và truy xuất nguồn gốc thương mại tu hài.
2. Công cụ chọn giống năng suất cao: Tập hợp 11 chỉ thị SNP cùng hệ thống mồi PCR đặc hiệu được thiết kế là công cụ phân tử trực tiếp hỗ trợ các chương trình chọn giống tu hài tăng trưởng nhanh (Marker-Assisted Selection - MAS), giúp rút ngắn thời gian chọn giống so với phương pháp chọn lọc kiểu hình truyền thống.
3. Cơ sở quy hoạch nghề nuôi: Cung cấp số liệu hiện trạng về phân bố, trữ lượng và tiềm năng mặt nước tại huyện Vân Đồn (Quảng Ninh), làm căn cứ cho việc xây dựng kế hoạch phát triển vùng nuôi an toàn sinh học và chủ động nguồn giống.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng ngay các cặp mồi và 11 chỉ thị SNP đã sàng lọc vào thực tế sản xuất giống tu hài để đánh giá, tuyển chọn đàn bố mẹ có giá trị di truyền cao về tốc độ tăng trưởng.
• Mở rộng vùng kiểm chứng các chỉ thị SNP trên các quần thể tu hài nuôi và tự nhiên tại các địa phương khác như Hải Phòng, Khánh Hòa, Kiên Giang.
• Kết hợp dữ liệu hệ gene với các nghiên cứu miễn dịch học nhằm tìm kiếm thêm các chỉ thị phân tử kháng bệnh (đặc biệt là bệnh sưng vòi) để hoàn thiện gói chỉ thị đa tính trạng (tăng trưởng nhanh kết hợp kháng bệnh).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Phạm vi địa lý thu mẫu hệ gene: Mẫu phân tích giải trình tự WGS tập trung tại khu vực huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh, chưa bao quát toàn bộ các vùng phân bố sinh học khác của tu hài tại miền Trung và miền Nam.
• Kỹ thuật đọc ngắn: Công nghệ giải trình tự NGS sử dụng đoạn đọc ngắn (short reads) của Illumina tuy có độ chính xác cao nhưng gặp thách thức nhất định trong việc lắp ráp các vùng trình tự lặp lại phức tạp cao của hệ gene thân mềm so với các công nghệ đọc dài.
• Quy mô quần thể kiểm chứng: Số lượng cá thể phân tích ezRAD-Seq giới hạn ở 60 mẫu thuộc hai nhóm phân ly cực đoan về EBV trong điều kiện nuôi thực nghiệm tại một trung tâm giống.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Bổ sung công nghệ giải trình tự đoạn đọc dài (như Oxford Nanopore Technologies - ONT hoặc PacBio) kết hợp kỹ thuật bắt cặp nhiễm sắc thể thông lượng cao (Hi-C) để nâng cấp hệ gene Lutraria rhynchaena lên mức độ nhiễm sắc thể (chromosome-level assembly).
• Mở rộng sàng lọc trên quy mô đàn thương phẩm lớn ngoài tự nhiên để xác định chính xác tần số alen và mức độ ảnh hưởng của từng SNP đến khối lượng và chiều dài vỏ ở các giai đoạn phát triển khác nhau.
• Xây dựng chip sinh học (SNP chip panel) chuyên dụng phục vụ công tác chọn giống tu hài quy mô công nghiệp.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà nghiên cứu: Thuộc các chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học và Nuôi trồng thủy sản; có thể sử dụng quy trình xây dựng thư viện ezRAD, quy trình xử lý dữ liệu dDocent/Stacks và dữ liệu hệ gene tham chiếu trên GenBank cho các nghiên cứu tương tự trên động vật thân mềm.
• Giảng viên đại học: Sử dụng làm học liệu thực tế trong giảng dạy các học phần Di truyền số lượng, Công nghệ gen trong thủy sản, và Tin sinh học ứng dụng.
• Cơ sở sản xuất giống và cơ quan quản lý thủy sản: Các trung tâm giống thủy sản ven biển (tại Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa) có thể ứng dụng trực tiếp các chỉ thị SNP và quy trình PCR mồi đặc hiệu để kiểm định chất lượng đàn giống bố mẹ; các nhà hoạch định chính sách có thêm căn cứ dữ liệu để quy hoạch vùng nuôi biển bền vững theo Quyết định 1664/QĐ-TTg.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Đối tượng nghiên cứu chính và địa bàn thực địa của luận án là gì?

Đối tượng nghiên cứu là loài tu hài vòi trắng (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844), thuộc họ Vọp (Mactridae), bộ Ngao (Veneroida), lớp Hai mảnh vỏ (Bivalvia). Địa bàn điều tra thực địa, thu mẫu sinh thái và thử nghiệm nuôi được thực hiện tại 40 điểm thuộc 8 xã, thị trấn của huyện đảo Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh.

2. Hai vùng gene nào được sử dụng để xây dựng mã vạch DNA nhận dạng loài tu hài trong luận án?

Luận án sử dụng hai vùng gene ty thể đặc trưng:

• Đoạn gene 16S rRNA có kích thước phân tích là 437 bp.
• Đoạn gene COI (Cytochrome C Oxidase subunit I) có kích thước phân tích là 615 bp. Cả hai vùng trình tự này đều cho phép phân tách chính xác loài Lutraria rhynchaena khỏi các loài họ hàng trong chi Lutraria trên cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng thuật toán ML và BI.

3. Kỹ thuật di truyền phân tử nào được dùng để sàng lọc biến dị SNP giữa hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và chậm?

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giải trình tự DNA liên kết vị trí enzyme cắt hạn chế (ezRAD-Seq). DNA tổng số của 60 cá thể (30 cá thể nhóm tăng trưởng nhanh và 30 cá thể nhóm tăng trưởng chậm, phân loại dựa trên giá trị chọn giống ước tính EBV) được cắt đồng thời bằng hai enzyme MboI và Sau3AI, gắn adapter TruSeq và giải trình tự trên hệ thống máy Illumina.

4. Luận án đã phát hiện được bao nhiêu chỉ thị SNP tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài?

Qua quy trình xử lý tin sinh học bằng pipeline dDocent và Stacks, đối chiếu với hệ gene tham chiếu và phân tích locus ngoại lai (outlier loci) trong 12 gene chức năng, luận án đã xác định và sàng lọc được 11 chỉ thị SNP tiềm năng có liên kết chặt chẽ với tính trạng tăng trưởng nhanh, đồng thời thiết kế thành công các cặp mồi PCR đặc hiệu để khuếch đại các phân đoạn chứa các SNP này.

5. Dữ liệu hệ gene của tu hài được giải mã bằng phương pháp nào và có ý nghĩa gì?

Toàn bộ hệ gene (WGS từ mô cơ màng áo) và hệ gene phiên mã (Transcriptome từ mô tiêu hóa) của Lutraria rhynchaena được giải mã bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) trên nền tảng Illumina tại Đại học Deakin (Australia). Dữ liệu này lần đầu tiên cung cấp hệ gene tham chiếu (reference genome) hoàn chỉnh cho loài trên GenBank, phục vụ việc lắp ráp, chú thích gene và làm nền tảng dóng hàng dữ liệu ezRAD-Seq để phát hiện biến dị SNP.

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Triệu Anh Tuấn đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu từ điều tra sinh thái thực địa đến ứng dụng công nghệ hệ gene học hiện đại trên đối tượng tu hài (Lutraria rhynchaena Jonas, 1844) tại Vân Đồn, Quảng Ninh. Công trình đã xây dựng thành công bộ mã vạch DNA chuẩn tích hợp mã QR nhận dạng loài từ hai đoạn gene 16S rRNA và COI, đồng thời lần đầu tiên công bố dữ liệu toàn bộ hệ gene và hệ gene phiên mã của loài trên cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank. Quan trọng nhất, việc phát hiện và thiết kế mồi kiểm chứng cho 11 chỉ thị SNP tiềm năng liên kết với tính trạng tăng trưởng thông qua kỹ thuật ezRAD-Seq đã tạo ra công cụ phân tử phục vụ trực tiếp cho công tác chọn tạo giống tu hài năng suất cao, đóng góp thiết thực cho sự phát triển bền vững của ngành nuôi biển Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nô ̣i – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9.21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Nguyễn Xuân Viết PGS. TS Thái Thanh Bình Hà Nô ̣i - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi là Triệu Anh Tuấn, Nghiên cứu sinh (NCS) khóa 36, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội chuyên ngành Di truyền học, mã số: 9.21, xin cam đoan Luận án là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các nội dung, kết quả nghiên cứu phân tích, đánh giá do chính tôi thực hiện trên cơ sở các nguồn số liệu đã thu thập được. Các tài liệu tham khảo trong luận án là cơ sở lý luận để đánh giá tổng quan, so sánh, phân tích và thảo luận đã được trích dẫn đầy đủ và đúng theo quy định.

Nội dung và kết quả trong luận án đảm bảo độ tin cậy, tính khoa học, không trùng lặp và đã được NCS công bố một phần trên các tạp chí chuyên ngành uy tín trong và ngoài nước. Hà Nội , ngày 15 tháng 04 năm 2023 NGHIÊN CỨU SINH Triệu Anh Tuấn ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, cho phép nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. Nguyễn Xuân Viết và PGS. Thái Thanh Bình là những người hướng dẫn đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ nghiên cứu sinh trong suốt thời gian thực hiện đề tài luận án.

Nghiên cứu sinh xin cảm ơn Ban Lãnh đạo Trường cao đẳng kinh tế, kỹ thuật và Thủy sản và các anh, chị công tác tại phòng Công nghệ sinh học của nhà trường đã tạo mọi điều kiện trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học, phòng Sau đại học và toàn thể các thầy cô đã tạo mọi điều kiện tốt nhất trong thời gian học tập tại nhà Trường. Xin cảm ơn Uỷ ban nhân dân tỉnh Phú Thọ, Trường Đại học Hùng Vương đã hỗ trợ kinh phí học tập, Phòng Khoa học và Công nghệ tạo điều kiện về thời gian để nghiên cứu sinh học tập và hoàn thành luận án. Xin được cảm ơn Giáo sư Christopher Austin cùng cộng sự tại Trung tâm Công nghệ Genomics, Trường Đại học tổng hợp Deakin, Geelong, Australia đã giúp đỡ NCS thực hiện đề tài luận án.

Xin cảm ơn Hội nông dân huyện Vân Đồn, ông Hà Văn Ninh và ông Nguyễn Hồng Quang đã hỗ trợ NCS trong quá trình khảo sát, thu mẫu, tiến hành thí nghiệm. NCS xin được cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và sẵn sàng giúp đỡ trong suốt những tháng năm học tập và thực hiện luận án. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 4 năm 2023 NGHIÊN CỨU SINH Triệu Anh Tuấn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.

vi DANH MỤC BẢNG. viii DANH MỤC HÌNH. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Ý nghiã khoa học và thực tiễn của đề tài. Đối tượng, phạm vi giới hạn của luận án. Những đóng góp mới của luận án.

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU. Giới thiệu chung về tu hài. Vị trí phân loại học. Phân bố tự nhiên.

Một số đặc điểm cấu tạo tu hài. Tình hình nuôi và khai thác tu hài. Nghiên cứu chọn giống theo hướng tăng trưởng. Chọn lọc dựa trên kiểu hình.

Chọn lọc theo kiểu gene. Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Chỉ thị phân tử. Chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu phân loại.

Chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứuxây dựng mã vạch DNA ở một số loài. Chỉ thị SNP ứng dụng trong nghiên cứu ở các loài hai mảnh vỏ. Nghiên cứu giải trình tự hệ gene ở loài hai mảnh vỏ. Một số nghiên cứu di truyền phân tử ở tu hài.

32 iv CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Điều tra thành phần loài tu hài, hiện trạng nghề nuôi tu hài tại Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài. Phương pháp xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L. Phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gene tu hài L.

Phương pháp giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài L. Phương pháp phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài. Phương pháp phân tích, xử lý dữ liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.

Thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn, hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh. Khảo sát thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn. Đánh giá hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn hiện nay. Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L.

Khảo sát dữ liệu để xây dựng mã vạch DNA vùng gen 16S rRNA, COI của giống Lutraria trên hệ thống mã vạch quốc tế. Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho các loài tu hài. Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài L. Giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã của tu hài L.

Tách chiết và tinh sạch DNA. Thiết lập thư viện và giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã tu hài. Ứơc lượng kích thước hệ gene tu hài. Lắp ráp hệ gene của tu hài L.

Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp lại và tìm kiếm đa hình. Lắp ráp hệ gene phiên mã. Dự đoán và chú thích hệ gene tu hài. So sánh đặc điểm hệ gene L.

rhynchaena với các loài hai mảnh vỏ. Sàng lọc, tuyển chọn và phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài. Giải trình tự ezRAD-Seq ở tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Xây dựng cơ sở dữ liệu, sàng lọc các SNP ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.

Sàng lọc outlier loci ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Sàng lọc chỉ thị SNP tiềm năng ở tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Thiết kế mồi và nhân đoạn trình tự chứa chỉ thị SNP tiềm năng sàng lọc được ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. 93 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.

96 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN. 98 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1PL vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết Từ Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt tắt BAC Bacterial artificial chromosome Nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo bp Base pair Cặp base BOLDS Barcode Of Life Data Systems Hệ thống cơ sở dữ liệu mã vạch sống BUSCO Benchmarking Universal Single- Bộ trình tự tham chiếu Copy Orthologs BWA Burrowr-Wheerler Alignment Tool Công cụ dóng hàng COI Cytochrome C Oxidase subunit I Vùng gene COI CS Cộng sự CSDL Data base Cơ sở dữ liệu CSIRO Commonwealth Scientific and Tổ chức nghiên cứu khoa học và Industrial Research Organisation công nghiệp khối thịnh vượng chung Dam DNA adenine methylase Enzyme metyl hóa Adenine DNA DNA Acid Deoxyribonucleic Axid Đêoxyribônucleic, DNA ĐVTM Động vật thân mềm EBV Estimated Breeding Value Giá trị chọn giống ước tính EST Expressed Sequence Tag Đoạn trình tự biểu hiện EzRAD Enzyme Restriction-site Associated DNA liên kết vị trí enzym cắt hạn DNA chế FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông lương thế giới GWS Genome Wide Selection Chọn lọc dựa trên toàn bộ hệ gen Hi-C High-throughput chromosome Chụp cấu trúc nhiễm sắc thể conformation capture thông lượng cao NCS Nghiên cứu sinh vii NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới ONT Oxford Nanopore Technology Công nghệ đọc dài PB Pacific Biosciences Khoa học sinh học Thái Bình Dương PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL Quantitative Trait Loci Locus tính trạng số lượng RAPD Randomly Amplified Polymorphism Đa hình DNA khuếch đại ngẫu DNA nhiên RNA Ribonucleic Acid Acid Ribonucleic RFLP Restriction Fragment Length Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế Polymorphism SAM Sequence Alignment/ Map Dóng hàng trình tự/ bản đồ SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotic đơn SPB Sample Purification Beads Hạt tinh sạch mẫu TSLR TruSeq Synthetic Long Read Tổng hợp đọc dài bằng TruSeq WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gene viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thư viện EzRAD.

Thành phần loài tu hài phân bố tại huyện Vân Đồn. Hiện trạng nghề nuôi tu hài (L. rhynchaena) tại Vân Đồn năm 2019. Mã số truy cập và kích thước trình tự DNA gene 16S rRNA, COI của các loài trong giống Lutraria trên GenBank.

Mức độ tương đồng trình tự DNA vùng gene 16S rRNA của tu hài L. rhynchaena với trình tự DNA của các loài tu hài đã công bố trên GenBank (%). Mức độ tương đồng trình tự DNA vùng gene COI của tu hài L. rhynchaena với trình tự gene COI của các loài tu hài đã công bố trên GenBank (%).

Các vị trí sai khác nucleotide trên trình tự vùng gene 16S rRNA (437 bp) của 5 loài tu hài trong nghiên cứu. Các vị trí sai khác nucleotide trên trình tự vùng gene COI (615 bp) của 5 loài tu hài trong nghiên cứu. Kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gene tu hài (L. Kết quả giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài (L.

Kết quả lắp ráp và chú thích hệ gene tu hài. Giá trị chọn giống ước tính cho tính trạng tăng trưởng giữa hai nhóm tu hài. Tóm tắt kết quả xử lý giải trình tự. Thống kê SNP trong 12 gene liên quan tính trạng tăng trưởng ở tu hài.

Thông tin về SNP sau sàng lọc ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Kết quả xử lý dữ liệu trình tự dựa trên hệ gene tham chiếu (dDocent và Stacks) và contig của nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Số lượng biến dị phát hiện ở hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh, tăng trưởng chậm và kiểu biến dị phân tử .