Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn trên nền di truyền của giống lúa bc15

Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo giống lúa BC15 kháng bệnh đạo ôn. Đột phá trong nông nghiệp, nâng cao năng suất và chất lượng lúa gạo Việt Nam.

• Tác giả: Nguyễn Thị Nhài
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy
• Trường học: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng
• Đề tài: Nghiên cứu Ứng Dụng Chỉ Thị Phân Tử Chọn Tạo Giống Kháng Bệnh Đạo Ôn Trên Nền Di Truyền Của Giống Lúa BC15
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình sản xuất lúa gạo và ảnh hưởng của bệnh đạo ôn đến sản xuất lúa của Việt Nam
• 1.2. Chỉ thị di truyền và ứng dụng chỉ thị di truyền trong chọn tạo giống cây trồng
• 1.3. Bệnh đạo ôn và nghiên cứu quản lý bệnh đạo ôn hại lúa
• 1.4. Nghiên cứu gen kháng bệnh đạo ôn và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập, đánh giá và định danh các nòi nấm bệnh đạo ôn gây hại ở các tỉnh phía bắc
• 3.2. Xác định các gen kháng bệnh đạo ôn hiệu quả tại các tỉnh phía bắc và chọn lọc các chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng bệnh đạo ôn
• 3.3. Xây dựng và chọn tạo nguồn vật liệu chọn giống
• 3.4. Đánh giá các đặc điểm nông học, năng suất và mức độ nhiễm sâu bệnh của các dòng thuần triển vọng trên đồng ruộng
• MỞ ĐẦU
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Ứng Dụng Chỉ Thị Phân Tử Tạo Giống Lúa

Lúa gạo (Oryza sativa L.) đóng vai trò then chốt trong an ninh lương thực toàn cầu, cung cấp lương thực cho hơn một phần ba dân số thế giới. Duy trì và phát triển ngành lúa gạo là vô cùng quan trọng, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu ngày càng gia tăng, tạo điều kiện cho sự bùng phát của các loại sâu bệnh hại lúa. Trong số đó, bệnh đạo ôn là một trong những mối đe dọa lớn nhất, gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng lúa gạo trên toàn thế giới. Theo các nghiên cứu, hàng năm có hàng triệu hecta lúa bị nhiễm bệnh đạo ôn, ảnh hưởng trực tiếp đến nguồn cung lương thực và đời sống của người nông dân. Chính vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển các giống lúa kháng đạo ôn là một yêu cầu cấp thiết. Luận án tiến sĩ này tập trung vào ứng dụng chỉ thị phân tử để tạo ra giống lúa BC15 kháng đạo ôn, một giải pháp tiềm năng để giải quyết vấn đề này.

1.1. Tầm Quan Trọng của Nghiên Cứu Tạo Giống Lúa Kháng Đạo Ôn

Nghiên cứu tạo giống lúa kháng đạo ôn đóng vai trò then chốt trong việc đảm bảo an ninh lương thực quốc gia và toàn cầu. Giảm thiểu thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng lúa gạo. Điều này không chỉ mang lại lợi ích kinh tế cho người nông dân mà còn góp phần ổn định xã hội, đặc biệt ở các khu vực phụ thuộc lớn vào sản xuất nông nghiệp. Việc ứng dụng chỉ thị phân tử giúp rút ngắn thời gian tạo giống và tăng độ chính xác trong việc chọn lọc các đặc tính mong muốn.

1.2. Giới Thiệu về Giống Lúa BC15 và Bệnh Đạo Ôn

Giống lúa BC15 là một giống lúa phổ biến ở Việt Nam, được trồng rộng rãi vì năng suất và chất lượng gạo tốt. Tuy nhiên, giống lúa này lại khá mẫn cảm với bệnh đạo ôn, gây ra những thiệt hại đáng kể cho người trồng. Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, có thể tấn công cây lúa ở mọi giai đoạn sinh trưởng, từ mạ đến khi trổ bông. Các triệu chứng của bệnh bao gồm các đốm hình thoi trên lá, cổ bông bị thối và hạt lép. Việc kiểm soát bệnh đạo ôn thường dựa vào việc sử dụng thuốc trừ nấm, tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ nấm có thể gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người.

II. Thực Trạng Thách Thức Bệnh Đạo Ôn và Giống Lúa BC15

Bệnh đạo ôn tiếp tục là một thách thức lớn đối với ngành trồng lúa ở Việt Nam. Sự biến động của các chủng nấm đạo ôn, kết hợp với điều kiện khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của bệnh, khiến việc kiểm soát bệnh trở nên khó khăn hơn. Việc sử dụng các giống lúa kháng bệnh là một giải pháp bền vững, tuy nhiên, việc tìm kiếm và phát triển các giống lúa có khả năng kháng bệnh ổn định và lâu dài đòi hỏi những nỗ lực nghiên cứu liên tục. Hiện nay, nhiều giống lúa kháng đạo ôn đã mất khả năng kháng bệnh do sự xuất hiện của các chủng nấm đạo ôn mới. Điều này đặt ra yêu cầu phải liên tục nghiên cứu và phát triển các giống lúa kháng bệnh mới, cũng như tìm kiếm các phương pháp quản lý bệnh hiệu quả hơn.

2.1. Ảnh Hưởng của Biến Đổi Khí Hậu Đến Sự Phát Triển Bệnh Đạo Ôn

Biến đổi khí hậu tạo ra những điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và lây lan của bệnh đạo ôn. Sự gia tăng nhiệt độ, độ ẩm và lượng mưa có thể làm tăng tốc độ sinh trưởng của nấm đạo ôn và kéo dài thời gian lây nhiễm. Ngoài ra, biến đổi khí hậu cũng có thể làm suy yếu sức đề kháng của cây lúa, khiến cây dễ bị nhiễm bệnh hơn. Vì vậy, việc phát triển các giống lúa có khả năng thích ứng với biến đổi khí hậu và kháng bệnh đạo ôn là vô cùng quan trọng.

2.2. Hạn Chế của Các Phương Pháp Kiểm Soát Bệnh Đạo Ôn Truyền Thống

Các phương pháp kiểm soát bệnh đạo ôn truyền thống, như sử dụng thuốc trừ nấm, có thể mang lại hiệu quả trong ngắn hạn, nhưng lại có những hạn chế nhất định. Việc sử dụng thuốc trừ nấm có thể gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường, sức khỏe con người và làm phát sinh các chủng nấm đạo ôn kháng thuốc. Ngoài ra, các biện pháp canh tác như luân canh cây trồng và vệ sinh đồng ruộng cũng có thể giúp kiểm soát bệnh đạo ôn, nhưng hiệu quả thường không cao và đòi hỏi sự tuân thủ nghiêm ngặt. Cần có những giải pháp sáng tạo hơn để cải tiến giống lúa.

2.3. Sự Cần Thiết của Nghiên Cứu Ứng Dụng Chỉ Thị Phân Tử

Phương pháp chọn lọc phân tử giúp các nhà khoa học xác định và chọn lọc các gen kháng bệnh đạo ôn một cách chính xác và nhanh chóng. Điều này giúp rút ngắn thời gian tạo giống và tăng hiệu quả trong việc phát triển các giống lúa kháng bệnh. Ngoài ra, chỉ thị phân tử cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự biến động của các chủng nấm đạo ôn, giúp các nhà khoa học đưa ra các biện pháp phòng trừ bệnh kịp thời và hiệu quả. Luận án này tập trung vào giải quyết những hạn chế này thông qua việc sử dụng chỉ thị phân tử để tạo ra giống lúa BC15 kháng đạo ôn.

III. Cách Ứng Dụng Chỉ Thị Phân Tử MAS Tạo Giống Lúa Kháng Đạo Ôn

Luận án tiến sĩ này tập trung vào ứng dụng chỉ thị phân tử để tạo ra giống lúa BC15 kháng đạo ôn. Phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS) được sử dụng để xác định các cá thể mang gen kháng bệnh đạo ôn trong quá trình lai tạo. Các chỉ thị phân tử liên kết chặt chẽ với các gen kháng bệnh được sử dụng để chọn lọc các cá thể mong muốn, giúp rút ngắn thời gian tạo giống và tăng độ chính xác trong việc chọn lọc các đặc tính mong muốn. Quá trình lai tạo giống lúa này đòi hỏi sự kết hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử và các phương pháp chọn giống truyền thống để tạo ra giống lúa BC15 kháng đạo ôn, giữ lại các đặc tính nông học tốt của giống gốc.

3.1. Quy Trình Chọn Lọc Phân Tử MAS Chi Tiết

Quy trình MAS bao gồm các bước chính: (1) Xác định các gen kháng bệnh đạo ôn tiềm năng và các chỉ thị phân tử liên kết với các gen này. (2) Lai tạo giống lúa BC15 với các giống lúa mang gen kháng bệnh đạo ôn. (3) Phân tích DNA của các cá thể lai bằng các chỉ thị phân tử để xác định các cá thể mang gen kháng bệnh. (4) Chọn lọc các cá thể mang gen kháng bệnh và tiếp tục lai tạo để cải thiện các đặc tính nông học của giống. Quá trình này lặp đi lặp lại cho đến khi đạt được giống lúa BC15 kháng đạo ôn với các đặc tính mong muốn.

3.2. Vai Trò Của Các Marker Phân Tử SSR SNP Trong MAS

Các marker phân tử như SSR (Simple Sequence Repeats) và SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) đóng vai trò quan trọng trong MAS. Các marker này được sử dụng để xác định các vị trí trên DNA có liên kết chặt chẽ với các gen kháng bệnh đạo ôn. Bằng cách phân tích sự hiện diện của các marker này trong các cá thể lai, các nhà khoa học có thể xác định các cá thể mang gen kháng bệnh một cách chính xác. SSR và SNP là những công cụ hữu hiệu trong việc chọn lọc phân tử.

3.3. Lai Trở Lại Backcrossing và Chọn Lọc Nền Di Truyền

Lai trở lại là một kỹ thuật quan trọng trong quá trình tạo giống lúa BC15 kháng đạo ôn. Kỹ thuật này được sử dụng để cải thiện nền di truyền của giống lúa BC15, đồng thời duy trì gen kháng bệnh đạo ôn. Bằng cách lai các cá thể mang gen kháng bệnh với giống lúa BC15 trong nhiều thế hệ, các nhà khoa học có thể đảm bảo rằng giống lúa mới có các đặc tính nông học tốt của giống BC15, đồng thời có khả năng kháng bệnh đạo ôn. Kỹ thuật này giúp cải tiến giống lúa BC15.

IV. Nghiên Cứu Thực Nghiệm Kết Quả Chọn Giống BC15 Kháng Đạo Ôn

Luận án trình bày chi tiết các kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong quá trình tạo ra giống lúa BC15 kháng đạo ôn. Các kết quả này bao gồm việc xác định các gen kháng bệnh đạo ôn hiệu quả, chọn lọc các chỉ thị phân tử liên kết, lai tạo và chọn lọc các cá thể mang gen kháng bệnh, và đánh giá khả năng kháng bệnh của giống lúa mới. Các thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện kiểm soát và điều kiện đồng ruộng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả. Việc khảo nghiệm đồng ruộng là một bước quan trọng để đánh giá khả năng kháng bệnh và năng suất của giống lúa mới trong điều kiện thực tế.

4.1. Xác Định Các Gen Kháng Đạo Ôn Hiệu Quả và Marker Liên Kết

Nghiên cứu đã xác định được các gen kháng bệnh đạo ôn hiệu quả có thể được sử dụng để tạo ra giống lúa BC15 kháng đạo ôn. Các marker phân tử liên kết với các gen này đã được chọn lọc và sử dụng trong quá trình MAS. Việc xác định chính xác các gen kháng bệnh và các marker liên kết giúp tăng hiệu quả của quá trình tạo giống và giảm thời gian cần thiết để đạt được giống lúa mong muốn.

4.2. Đánh Giá Khả Năng Kháng Đạo Ôn Của Các Dòng Lúa Chọn Lọc

Khả năng kháng bệnh đạo ôn của các dòng lúa chọn lọc được đánh giá trong điều kiện kiểm soát và điều kiện đồng ruộng. Các dòng lúa được lây nhiễm với các chủng nấm đạo ôn khác nhau để đánh giá mức độ kháng bệnh. Các kết quả cho thấy rằng các dòng lúa mang gen kháng bệnh có khả năng kháng bệnh cao hơn so với giống lúa BC15 ban đầu. Việc đánh giá giống lúa được thực hiện một cách cẩn thận để đảm bảo tính khách quan và độ tin cậy của kết quả.

4.3. Phân Tích Di Truyền và Đánh Giá Năng Suất Của Giống Lúa Mới

Các phân tích di truyền được thực hiện để xác nhận sự hiện diện của các gen kháng bệnh trong giống lúa mới và đánh giá mức độ giống nhau di truyền giữa giống lúa mới và giống lúa BC15 ban đầu. Năng suất của giống lúa mới cũng được đánh giá trong điều kiện đồng ruộng. Các kết quả cho thấy rằng giống lúa mới có năng suất tương đương hoặc cao hơn so với giống lúa BC15 ban đầu, đồng thời có khả năng kháng bệnh đạo ôn cao.

V. Kết Luận và Hướng Phát Triển Ứng Dụng Chỉ Thị Phân Tử

Luận án đã thành công trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử để tạo ra giống lúa BC15 kháng đạo ôn. Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện năng suất và chất lượng lúa gạo, đồng thời giảm thiểu tác động tiêu cực của bệnh đạo ôn đối với ngành trồng lúa. Các phương pháp và kỹ thuật được sử dụng trong luận án có thể được áp dụng để tạo ra các giống lúa kháng bệnh khác, cũng như cải thiện các đặc tính nông học khác của cây lúa. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các ứng dụng của chỉ thị phân tử trong nông nghiệp có tiềm năng mang lại những lợi ích to lớn cho ngành trồng trọt.

5.1. Ý Nghĩa Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Đối Với Sản Xuất Lúa Gạo

Giống lúa BC15 kháng đạo ôn có thể giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra, tăng năng suất và chất lượng lúa gạo. Việc sử dụng giống lúa này có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào thuốc trừ nấm, giảm chi phí sản xuất và bảo vệ môi trường. Nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn to lớn đối với sản xuất lúa gạo ở Việt Nam.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Ứng Dụng Chỉ Thị Phân Tử

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc xác định và sử dụng các gen kháng bệnh đạo ôn mới, cải thiện độ chính xác và hiệu quả của MAS, và phát triển các giống lúa có khả năng kháng nhiều loại bệnh và sâu hại khác nhau. Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu về tác động của biến đổi khí hậu đối với bệnh đạo ôn và phát triển các giống lúa có khả năng thích ứng với biến đổi khí hậu. Việc tiếp tục cải tiến giống lúa là rất cần thiết.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Lúa gạo (Oryza sativa L.) là cây lương thực chủ lực nuôi sống hơn một phần ba dân số thế giới và đóng vai trò nòng cốt trong việc bảo đảm an ninh lương thực toàn cầu. Tuy nhiên, sự biến đổi khí hậu cùng với áp lực thâm canh đã tạo điều kiện cho nhiều loài dịch hại bùng phát, trong đó bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae Cavara gây ra là mối đe dọa nghiêm trọng nhất đối với sản xuất lúa, có khả năng làm giảm năng suất từ 70% đến 80% tại các vùng dịch.

Tại Việt Nam, giống lúa thuần BC15 là một trong những giống lúa chủ lực với phạm vi thích ứng rộng, năng suất cao và phẩm chất cơm gạo tốt. Sau 10 năm được đưa vào cơ cấu sản xuất tại miền Bắc, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và một số tỉnh Nam Bộ, giống BC15 đã góp phần nâng cao năng suất lúa cả nước thêm từ 8% đến 10% so với năm 2008. Mặc dù sở hữu nhiều đặc tính nông học ưu việt, giống lúa BC15 lại có nhược điểm lớn là mẫn cảm và dễ nhiễm bệnh đạo ôn, đặc biệt trong điều kiện thời tiết âm u, ẩm độ cao của vụ Đông Xuân tại các tỉnh phía Bắc.

Tập quán canh tác hiện nay vẫn phụ thuộc nặng nề vào việc phun rải thuốc bảo vệ thực vật hóa học để phòng trừ đạo ôn, gây tốn kém chi phí, ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe cộng đồng và làm suy thoái môi trường sinh thái. Trong khi đó, các giống lúa mang đơn gen kháng theo phương pháp chọn giống truyền thống thường chỉ duy trì được tính kháng từ 1 đến 5 năm do quần thể nấm đạo ôn biến đổi nòi sinh học rất nhanh chóng.

Khoảng trống nghiên cứu thực tế đặt ra là: tại các tỉnh phía Bắc, chưa có công trình nào đánh giá một cách toàn diện và có hệ thống cấu trúc độc tính của quần thể nấm đạo ôn bằng bộ dòng chỉ thị chuẩn quốc tế nhằm xác định các nòi nấm đại diện và các gen kháng còn duy trì hiệu lực cao; đồng thời chưa có dòng lúa BC15 cải tiến nào được tích hợp đồng thời nhiều gen kháng phổ rộng thông qua phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại (MABC) nhằm tạo ra tính kháng bền vững mà vẫn bảo tồn nguyên vẹn các đặc tính nông học và chất lượng thương phẩm của giống gốc. Xuất phát từ yêu cầu đó, đề tài "Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn trên nền di truyền của giống lúa BC15" đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể được đánh số theo văn bản như sau:

1. Thu thập, phân lập, đánh giá độc tính các nòi nấm bệnh đạo ôn lúa ở các tỉnh phía Bắc từ đó xác định được bộ nòi nấm đại diện sử dụng cho việc đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh cho các dòng/giống lúa.
2. Xác định được các gen kháng hiệu quả với bệnh đạo ôn lúa và bộ chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn tại các tỉnh phía Bắc.
3. Chọn tạo được dòng/giống lúa kháng bệnh đạo ôn mang nền di truyền của giống lúa BC15.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Giống lúa nhận gen: giống lúa thuần BC15.
  • Các dòng lúa cho gen mang đơn gen kháng đạo ôn nhập nội từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), bao gồm dòng IRBLkh-K3[CO] (mang gen kháng Pik-h) và dòng AH3 hay WHD-1S-75-1-127 (mang gen kháng Pi9(t)).
  • Quần thể các mẫu nấm bệnh đạo ôn cổ bông thu thập trực tiếp trên đồng ruộng tại các vùng sinh thái trồng lúa phía Bắc.
  • Bộ dòng lúa chỉ thị mang đơn gen kháng bệnh đạo ôn (bộ 25 dòng monogenic trên nền di truyền giống lúa Lijiangxintuanheigu - LTH) và giống lúa chuẩn nhiễm LTH do Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Nông nghiệp Quốc tế Nhật Bản (JIRCAS) và IRRI cung cấp.
  • Các gen kháng bệnh đạo ôn (nhóm locut Pik, Piz, Pita...) và hệ thống các chỉ thị phân tử liên kết (SSR, SCAR, SNP, InDel, CAPS) tương ứng.
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Phạm vi nội dung: Thu thập, phân lập, định danh nòi nấm đạo ôn cổ bông; sàng lọc xác định các gen kháng còn hiệu lực tại miền Bắc; ứng dụng phương pháp MABC kết hợp chọn lọc cá thể mang gen (chọn lọc gen mục tiêu) và chọn lọc phục hồi nền di truyền để tích hợp hai gen kháng Pik-h và Pi9(t) vào giống lúa BC15; đánh giá kiểu hình tính kháng nhân tạo và khảo nghiệm đồng ruộng các đặc tính nông sinh học, năng suất, phẩm chất của dòng triển vọng.
  • Phạm vi không gian: Thu thập mẫu nấm bệnh tại các vùng sinh thái phía Bắc; thực hiện các phân tích sinh học phân tử tại Bộ môn Sinh học phân tử thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp; bố trí các thí nghiệm khảo nghiệm đồng ruộng tại Hoài Đức, thành phố Hà Nội.
  • Phạm vi thời gian: Các thí nghiệm thu thập mẫu và nghiên cứu bước đầu được tiến hành từ năm 2012, giai đoạn thực hiện chính tập trung từ năm 2016 đến năm 2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước mà tác giả điểm lại

Tác giả đã tổng thuật các hướng nghiên cứu lớn trong và ngoài nước liên quan trực tiếp đến đề tài:

Về tình hình bệnh đạo ôn và thiệt hại sản xuất: Tác giả dẫn số liệu của Cục Bảo vệ thực vật (2021) ghi nhận diện tích lúa Đông Xuân bị nhiễm đạo ôn lá là 9.213 ha, đạo ôn cổ bông là 2.107 ha. Báo cáo của Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Hà Nội (2021) cho thấy trong 85,1 nghìn ha lúa vụ Xuân thì diện tích nhiễm đạo ôn lá là 641,62 ha, đạo ôn cổ bông là 181,286 ha, tập trung trên các giống BC15, TBR225, J02 tại Ứng Hòa, Thạch Thất, Chương Mỹ. Chi cục Trồng trọt và Bảo vệ thực vật Nghệ An (2021) báo cáo vụ Xuân có trên 1.777,63 ha lúa nhiễm đạo ôn lá (134,4 ha nhiễm nặng, 11,03 ha mất trắng) và 494,1 ha nhiễm đạo ôn cổ bông, trong đó BC15 là một trong những giống nhiễm nặng nhất.

Về phân loại nấm đạo ôn:

• Hướng phân loại bằng isozyme: Leung và cs. (1986) phân tích 18 loại enzyme trên 135 dòng phân lập nấm từ 12 vùng trồng lúa, nhưng chỉ tìm thấy 2 loại enzyme cho đa hình, chứng minh phương pháp isozyme thiếu tính đa hình và không phù hợp để nghiên cứu biến dị quần thể nấm đạo ôn.
• Hướng phân loại bằng chỉ thị sinh học phân tử: Sử dụng RFLP với mẫu dò MGR586, RAPD và rep-PCR. Lã Tuấn Nghĩa và cs. (2005) phân tích 825 dòng nấm phân lập tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam, phân chia thành 24 nhóm và 88 haplotype với độ đa dạng di truyền cao (> 0,92). Nghiên cứu 181 isolate nấm tại Đồng bằng sông Cửu Long ghi nhận các gen Pi-1, Pi-5(t), Pi-3, Pi-4(t) kháng tốt ở miền Bắc, nhưng tại Đồng bằng sông Cửu Long không có gen nào kháng hoàn toàn với 158 isolate thử nghiệm. Kỹ thuật Rep-PCR dùng các bộ mồi REP, ERIC, BOX và kỹ thuật PCR dùng mồi Pot2 transposon của Đoàn Thị Hòa và cs. (2016) được đánh giá là công cụ hữu hiệu trong giám định nấm.
• Hướng phân loại bằng bộ dòng lúa chỉ thị monogenic: Cơ chế tương tác gen-đối-gen (gene-for-gene) được áp dụng thông qua việc phát triển các bộ dòng lúa mang đơn gen kháng. Noda và cs. (1999) sử dụng bộ 12 dòng chỉ thị Nhật Bản phân loại 129 mẫu bệnh tại Đồng bằng sông Hồng thành 12 nhóm nòi; Mekwatanakarn và cs. (2000) tại Thái Lan; Chen và cs. (2001) tại Trung Quốc phân loại 792 mẫu nấm thành 344 nòi; Yanoria và cs. (2008). Đặc biệt, hệ thống bộ 25 dòng lúa chỉ thị mang đơn gen kháng (LTH monogenic lines) do Tsunematsu và cs. (2000) cùng Fukuta và cs. (2014) thuộc mạng lưới JIRCAS phát triển đã trở thành tiêu chuẩn quốc tế. Kết quả phân loại nòi nấm bằng bộ dòng LTH đã được công bố tại Nhật Bản (Tanaka và cs., 2016: 310 nòi), Băng-la-đét (Khan và cs., 2016: 331 nòi), Campuchia (Fukuta và cs., 2014: 122 nòi), Tây Phi (Odjo và cs.: 96 nòi). Tại Việt Nam, Võ Thị Thu Ngân và cs. (2018) đã thử nghiệm hiệu lực gen kháng tại Đồng bằng sông Cửu Long và chỉ ra các gen Pii, Pik-s, Pik-p, Pik-h, Piz, Piz-5, Pita, Pish, Pi9(t) duy trì khả năng kháng.

Về gen kháng và chỉ thị phân tử liên kết: Kể từ khi Kiyosawa (1966) phát hiện gen kháng Pia trên giống Aichi Asahi, đến nay đã có hơn 100 gen/QTL kháng đạo ôn được lập bản đồ trên 11 nhiễm sắc thể (trừ nhiễm sắc thể số 3). Nhiễm sắc thể 11 tập trung tỷ lệ gen kháng cao nhất (25%, ít nhất 27 gen/alen như Pik-h, Pi54, Pi1, Pik, Pik-m, Pik-p, Pik-s...), nhiễm sắc thể 12 chiếm 21% (ít nhất 22 gen/alen như Pita, Pita-2, Pi12(t), Pi19(t), Pi20(t)...), và nhiễm sắc thể 6 chiếm 18% (ít nhất 19 gen/alen như Pi9, Piz, Piz-5, Piz-t, Pi2...). Hệ thống các chỉ thị phân tử liên kết chặt đã được xác định: chỉ thị SCAR pB8 liên kết ở khoảng cách 0 cM với gen Pi9(t) (Liu và cs., 2002); các chỉ thị SSR RM224, RM206, RM144 liên kết với gen Pik-h (Sharma và cs., 2005; Fjellstrom và cs., 2004).

Về ứng dụng MABC quy tụ gen kháng đạo ôn: Nhiều công trình trên thế giới đã thành công trong việc tích hợp gen kháng đạo ôn: Hittalmani và cs. (2000); Padmavathi và cs. (2005) quy tụ gen vào giống CO39; Koide và cs. (2010) tích hợp hai gen Pish và Pib; Shaoshan Wen và Bijun Gao (2011) dùng chỉ thị pB8 chuyển gen Pi9(t) vào giống Luhui17 tạo ra các dòng WR1023 và WR1056; Jiang và cs. (2012) tích hợp Pi1, Pi2, D12 vào giống Jin 23B; Gouda và cs. (2013) dùng chỉ thị RM5926 và AP5659-5 chuyển hai gen Pi54 và Piz-5 vào giống PRR78; Tanweer và cs. (2015) tích hợp Pi-b và Pik-h vào giống MR219 tại Malaysia phục hồi 95% nền di truyền; Xiao và cs. (2016) tích hợp Pi46 và Pita vào giống Hang-Hui-179 nâng tỷ lệ kháng lên 97,1%; Arunakumari và cs. (2016) tích hợp tính kháng đạo ôn và bạc lá vào giống MTU1010.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Dù các kỹ thuật MABC đã được áp dụng trên nhiều giống lúa quốc tế, tại miền Bắc Việt Nam, việc xác định chính xác các nòi nấm đại diện bằng bộ dòng chỉ thị chuẩn quốc tế JIRCAS để định hướng chọn lọc gen kháng còn phân tán. Quan trọng hơn, giống lúa thuần chất lượng cao BC15 đang đối mặt trực tiếp với nguy cơ dịch bệnh đạo ôn nhưng chưa từng được cải tiến tính kháng bằng giải pháp quy tụ đồng thời hai gen kháng hữu hiệu (Pik-h và Pi9(t)). Luận án giải quyết trọn vẹn khoảng trống này bằng cách đi từ đánh giá độc tính quần thể nấm tại thực địa miền Bắc đến thiết kế sơ đồ hồi giao MABC đa tầng nhằm tạo ra dòng BC15 kháng đạo ôn bền vững.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

Luận án được xây dựng dựa trên hai cơ sở lý thuyết nền tảng:

1. Thuyết tương tác gen-đối-gen (Gene-for-gene hypothesis): Tính kháng hoặc nhiễm của cây lúa được quy định bởi sự tương tác đặc hiệu giữa gen kháng (R - Resistance gene) của cây ký chủ và gen không độc/gây bệnh (Avr/vir - Avirulence/virulence gene) của nấm Pyricularia oryzae. Cây chỉ thể hiện tính kháng khi mang gen kháng tương ứng nhận diện được sản phẩm của nòi nấm.
2. Nguyên lý chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại (MABC): Dựa trên mô hình tính toán di truyền phân tử của Hospital và cs. (2003), chương trình MABC tiến hành qua 3 bước chọn lọc:
   • Chọn lọc gen mục tiêu (Foreground selection): Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt hoặc chỉ thị nội gen để nhận diện cá thể mang alen gen kháng mong muốn từ cây cho gen (DP), duy trì trạng thái dị hợp tử trong các thế hệ hồi giao và đồng hợp tử ở thế hệ tự thụ.
   • Chọn lọc tái tổ hợp (Recombinant selection): Sử dụng các chỉ thị cận biên hai đầu locut gen mục tiêu (< 5 cM) nhằm giảm thiểu các đoạn nhiễm sắc thể không mong muốn từ cây cho gen, khắc phục hiện tượng liên kết kéo theo (linkage drag).
   • Chọn lọc nền di truyền (Background selection): Sử dụng hệ thống chỉ thị phân tử đa hình phân bố đều trên khắp các nhiễm sắc thể để sàng lọc và tăng tốc độ phục hồi hệ gen của cây nhận gen (RP - Recipient parent).

Bảng dưới đây tổng hợp kết quả lý thuyết dự kiến về tốc độ phục hồi hệ gen RP theo mô hình Hospital và cs. (2003) được trích dẫn trong luận án:

Thế hệ lai trở lại	Số lượng cá thể	% Đồng hợp tử của alen RP tại vị trí chỉ thị được lựa chọn (NST mang locut mục tiêu)	% Đồng hợp tử của alen RP tại vị trí chỉ thị được lựa chọn (Tất cả NST khác)	% Hệ gen RP theo MABC	% Hệ gen RP theo lai truyền thống
BC1	70	38,4	60,6	79,0	75,0
BC2	100	73,6	87,4	92,2	87,5
BC3	150	93,0	98,8	98,0	93,7
BC4	300	100,0	100,0	99,0	96,9

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Nghiên cứu áp dụng phương pháp thực nghiệm kết hợp giữa sinh học phân tử, bệnh học thực vật và khảo nghiệm nông học:

• Phương pháp bệnh học và vi sinh:

  • Thu thập và phân lập nấm: Mẫu bệnh đạo ôn cổ bông được thu thập ngoài đồng ruộng, khử trùng bề mặt mô bệnh, ủ ẩm kích thích nấm sinh bào tử và phân lập thành các dòng nấm đơn bào tử theo quy trình của Hayashi và cs.
  • Lây nhiễm nhân tạo: Nhân nuôi nấm trên môi trường cám gạo - bột yến mạch, thu dịch bào tử (nồng độ chuẩn $1 \times 10^5$ bào tử/ml hòa trong gelatin 0,02%), phun đều lên mạ ở giai đoạn 3 - 4 lá (Hayashi và cs.).
  • Đánh giá phản ứng bệnh: Đánh giá triệu chứng bệnh sau lây nhiễm 7 ngày theo thang điểm chuẩn từ 0 đến 5 của JIRCAS (2009) và thang điểm IRRI (2013). Cây có điểm 0 - 2 được xếp vào nhóm kháng (R), điểm 3 - 5 là nhiễm (S).
  • Định danh nòi nấm: Phân tích phản ứng kháng/nhiễm của mẫu nấm trên bộ 25 dòng lúa chỉ thị monogenic LTH để gán mã số nòi nấm theo khóa phân loại quốc tế.

• Phương pháp sinh học phân tử:

  • Tách chiết ADN: Tách chiết ADN tổng số từ mô lá non theo phương pháp CTAB cải tiến.
  • Kỹ thuật PCR và điện di: Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại phân đoạn ADN với các cặp mồi SSR và SCAR đặc hiệu. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2,5% nhuộm ethidium bromide, quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại.
  • Hệ thống chỉ thị phân tử mục tiêu: Sử dụng chỉ thị SCAR pB8 để phát hiện gen Pi9(t); chỉ thị SSR RM224 (và các chỉ thị phụ trợ RM206, RM1233, RM144, RM2136) để phát hiện gen Pik-h.
  • Phân tích nền di truyền: Khảo sát bộ mồi SSR đa hình trải đều trên 12 nhiễm sắc thể giữa giống nhận BC15 và các giống cho gen; xử lý số liệu kiểu gen bằng phần mềm đồ họa hệ gen GGT (Graphical Genotypes v.2.0) để tính toán tỷ lệ phục hồi hệ gen nền BC15.

• Phương pháp lai tạo và MABC:

  • Thực hiện hai nhánh lai trở lại song song: (BC15 x AH3) x BC15 (chọn lọc gen Pi9(t)) và (BC15 x IRBLkh-K3[CO]) x BC15 (chọn lọc gen Pik-h) từ thế hệ BC1F1 đến BC4F1, tự thụ thu BC4F2 để tạo hai dòng đơn gen thuần mang nền di truyền BC15.
  • Lai tích hợp giữa hai dòng đơn gen ưu tú để quy tụ đồng thời hai gen kháng, tự thụ và chọn lọc cá thể mang hai gen ở trạng thái đồng hợp tử.

• Phương pháp khảo nghiệm đồng ruộng và phân tích số liệu:

  • Bố trí thí nghiệm đồng ruộng theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần nhắc lại tại Hoài Đức, Hà Nội.
  • Theo dõi các chỉ tiêu nông sinh học: thời gian sinh trưởng (TGST), chiều cao cây (CCC), chiều dài bông (CDB), các yếu tố cấu thành năng suất (số bông/khóm, số hạt chắc/bông, tỷ lệ lép, khối lượng 1000 hạt, năng suất lý thuyết - NSLT, năng suất thực thu - NSTT).
  • Đánh giá mức độ nhiễm sâu bệnh hại tự nhiên ngoài đồng ruộng (bệnh đạo ôn, khô vằn, bạc lá, rầy nâu).
  • Đánh giá chất lượng cảm quan cơm gạo theo bảng tiêu chuẩn đánh giá và xếp hạng cảm quan.
  • Xử lý thống kê: Sử dụng các đại lượng thống kê mô tả, phân tích phương sai, sai biệt nhỏ nhất có ý nghĩa (LSD ở mức $\alpha = 0,05$), hệ số biến động (CV%) và độ lệch tiêu chuẩn (Stdev).

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dữ liệu khoa học về sản xuất lúa, nấm bệnh đạo ôn, chỉ thị phân tử và phương pháp chọn giống:

• Bối cảnh sản xuất và áp lực bệnh: Phân tích tình hình sản xuất lúa gạo Việt Nam qua các năm; năm 2021 đạt diện tích 7,24 triệu ha, sản lượng 43,8 triệu tấn; vụ Đông Xuân chiếm tới gần 47% sản lượng cả nước (năm 2021 đạt 20.629,5 nghìn tấn). Đi kèm với năng suất tăng cao là nguy cơ dịch hại nghiêm trọng, đặc biệt là bệnh đạo ôn lá và cổ bông tại các vùng thâm canh trọng điểm như Hà Nội, Hải Phòng, Nghệ An, Kiên Giang.
• Đặc điểm sinh học của nấm Pyricularia oryzae: Nấm có bào tử phân sinh hình quả lê (kích thước trung bình 19 - 23 x 10 - 12 µm), 2 - 3 ngăn ngang; nhiệt độ phát triển tối ưu 25 - 28°C, ẩm độ 92 - 96%. Cơ chế xâm nhiễm bắt đầu từ việc hình thành vòi áp (appressorium) tạo áp suất thẩm thấu đẩy chốt xuyên thủng biểu bì tế bào lá lúa.
• Hạn chế của chọn giống truyền thống và vai trò của MABC: Các giống kháng truyền thống dễ bị suy giảm tính kháng sau vài vụ gieo trồng do áp lực biến dị nòi nấm. Ứng dụng chỉ thị phân tử (MAS, MABC) cho phép chọn lọc chính xác kiểu gen kháng ngay ở giai đoạn cây con, loại trừ cá thể không mong muốn, khắc phục liên kết kéo theo và đẩy nhanh quá trình phục hồi hệ gen giống gốc (đạt trên 98% ở thế hệ BC3 - BC4 so với lai truyền thống).
• Hệ gen kháng đạo ôn: Tổng quan hơn 100 gen/QTL kháng đạo ôn đã được công bố trên thế giới; tập trung phân tích sâu hai cụm gen chiến lược: locut Pik trên nhiễm sắc thể số 11 (với các alen Pik-h, Pik, Pik-m, Pik-p, Pi1...) và locut Piz/Pi9 trên nhiễm sắc thể số 6 (với các alen Pi9, Piz, Piz-5, Piz-t, Pi2...). Đây là các gen kháng phổ rộng có giá trị bảo vệ cao trước các nòi nấm độc tính phức tạp.

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu, quy trình bố trí và kỹ thuật đo đạc:

• Xác lập nguồn vật liệu chuẩn gồm giống nhận BC15; hai nguồn cho gen kháng ngoại nhập là IRBLkh-K3[CO] (mang gen Pik-h) và AH3 (mang gen Pi9(t)); cùng bộ 25 dòng chỉ thị đơn gen monogenic mang các gen kháng Pish, Pib, Pit, Pia, Pii, Pi3, Pi5(t), Pik-s, Pik-m, Pi1, Pik-h, Pik, Pik-p, Pi7(t), Pi9(t), Piz, Piz-5, Piz-t, Pita-2, Pita, Pi12(t), Pi19(t), Pi20(t) trên nền LTH.
• Quy trình phân lập, làm thuần nấm bệnh đạo ôn cổ bông và kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo trong buồng phun sương duy trì ẩm độ bão hòa.
• Bảng khóa phân loại xác định nòi nấm đạo ôn dựa trên tổ hợp phản ứng kháng/nhiễm của 25 dòng đơn gen theo chuẩn mạng lưới JIRCAS.
• Hệ thống chỉ thị phân tử: Sử dụng mồi pB8 (chỉ thị SCAR cho gen Pi9(t)) và mồi RM224 (chỉ thị SSR cho gen Pik-h). Bộ chỉ thị sàng lọc đa hình nền di truyền gồm các cặp mồi SSR phủ kín 12 cặp nhiễm sắc thể lúa.
• Thiết kế sơ đồ lai trở lại (MABC) 4 thế hệ (BC1F1 đến BC4F1), tự thụ BC4F2, kết hợp chọn lọc kiểu hình lây nhiễm nhân tạo và phân tích kiểu gen bằng chỉ thị phân tử, tiến tới lai quy tụ hai gen kháng.
• Các tiêu chí theo dõi nông học ngoài đồng ruộng và thang điểm phân cấp đánh giá sâu bệnh, chất lượng cơm gạo (thử nếm cảm quan, độ mềm, độ dính, mùi thơm).

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

1. Thu thập, phân lập và định danh nòi nấm đạo ôn phía Bắc (2012 - 2016):

• Thu thập các mẫu bệnh đạo ôn cổ bông từ các vùng sinh thái trồng lúa phía Bắc, phân lập thành công các mẫu nấm thuần khiết.
• Đánh giá độc tính của các isolate nấm trên bộ dòng lúa chỉ thị monogenic LTH thuộc các nhóm locut U, Pii, Pik, Piz, Pita. Kết quả cho thấy quần thể nấm đạo ôn phía Bắc có tính đa dạng độc tính rất cao, phần lớn các dòng chỉ thị mang gen đơn lẻ như Pia, Pib, Pit, Pik-s đều bị nhiễm nặng.
• Định danh được cơ cấu các nòi nấm gây hại phổ biến; từ đó tuyển chọn chính xác 24 nòi nấm đạo ôn đại diện cho các tỉnh phía Bắc để làm nguồn lây nhiễm chuẩn phục vụ đánh giá kiểu hình tính kháng.

2. Xác định gen kháng hiệu quả và chọn lọc chỉ thị phân tử liên kết:

• Kết quả lây nhiễm nhân tạo khẳng định hai gen kháng Pik-h (trên NST 11) và Pi9(t) (trên NST 6) có phổ kháng rộng nhất, duy trì hiệu lực kháng cao đối với hầu hết các nòi nấm đạo ôn thu thập tại miền Bắc.
• Sàng lọc chỉ thị phân tử liên kết cho thấy:
  • Chỉ thị SCAR pB8 cho vạch phân đoạn đặc hiệu, phân biệt rõ rệt giữa dòng mang gen Pi9(t) và giống lúa BC15.
  • Chỉ thị SSR RM224 cho đa hình rõ nét, liên kết chặt chẽ với locut gen Pik-h giữa dòng IRBLkh-K3[CO] và BC15 (bên cạnh việc kiểm tra các chỉ thị phụ cận RM1233, RM206, RM2136, RM144, RM4112, RM7654B).

3. Chọn tạo các dòng lúa đơn gen kháng mang nền di truyền BC15:

• Đánh giá nông học nguồn bố mẹ vụ Xuân 2014 tại Hoài Đức xác nhận BC15 có tiềm năng năng suất vượt trội nhưng nhiễm đạo ôn, trong khi các dòng cho gen có năng suất thấp và dạng hình kém.
• Sàng lọc đa hình trên 12 nhiễm sắc thể xác định được tập hợp các chỉ thị SSR phân biệt giữa BC15 và hai dòng cho gen.
• Tiến hành hồi giao qua các thế hệ:
  • Quần thể [(BC15 x AH3) x BC15]: Chọn lọc cá thể mang gen Pi9(t) bằng mồi pB8 ở thế hệ BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC4F1 và tự thụ BC4F2.
  • Quần thể [(BC15 x IRBLkh-K3[CO]) x BC15]: Chọn lọc cá thể mang gen Pik-h bằng mồi RM224 từ BC1F1 đến BC4F1 và tự thụ BC4F2.
• Kiểm tra tính kháng lây nhiễm nhân tạo ở thế hệ BC4F2 với nòi nấm I2a (vụ Mùa 2016) khẳng định các cá thể chọn lọc đều kháng bệnh.
• Đánh giá nền di truyền bằng phần mềm GGT v.2.0 xác nhận cá thể BC15-Pik-h (ký hiệu A1.9) và cá thể BC15-Pi9(t) (ký hiệu A2.1) đạt tỷ lệ phục hồi hệ gen nền BC15 cao, mang đặc điểm nông học tương đồng giống gốc.

4. Tích hợp hai gen kháng Pik-h và Pi9(t) vào giống lúa BC15:

• Tiến hành phép lai chéo giữa dòng đơn gen BC15-Pik-h và BC15-Pi9(t).
• Sàng lọc con lai bằng đồng thời hai chỉ thị RM224 và pB8, kết hợp kiểm tra độ thuần nền di truyền bằng mồi SSR trên 12 nhiễm sắc thể (như RM11475 trên NST 1, RM3447...).
• Chọn lọc các cá thể mang cả hai gen kháng ở trạng thái dị hợp tử, tiếp tục phát triển quần thể tự thụ qua các vụ (vụ Mùa 2018, Xuân 2019, Mùa 2019) để thu được các dòng thuần đồng hợp tử cả 2 gen kháng (Pik-hPik-h / Pi9(t)Pi9(t)).
• Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo với 24 nòi nấm đạo ôn đại diện trong vụ Xuân 2019: Các dòng mang hai gen kháng quy tụ thể hiện tính kháng miễn dịch hoặc kháng cao (điểm 0 - 1) đối với toàn bộ 24 nòi nấm, vượt trội hoàn toàn so với giống gốc BC15 (nhiễm nặng hầu hết các nòi) và các dòng mang đơn gen kháng đơn lẻ.
• Khảo nghiệm đồng ruộng và phân tích nông học (vụ Xuân 2019, Mùa 2019, Xuân 2020 tại Hoài Đức): Chọn lọc được dòng thuần ưu tú nhất ký hiệu là BC15.2.
• Kết quả khảo nghiệm khẳng định dòng lúa BC15.2 có thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, cấu trúc bông, khối lượng 1000 hạt, năng suất thực thu và chất lượng cơm gạo (độ mềm dẻo, vị đậm) hoàn toàn tương đương với giống gốc BC15, đồng thời duy trì khả năng kháng đạo ôn tuyệt đối ngoài đồng ruộng và trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Luận án đã thiết lập được bức tranh khoa học cập nhật và có hệ thống về cơ cấu độc tính của quần thể nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn tại các vùng sinh thái trồng lúa trọng điểm phía Bắc Việt Nam; xây dựng thành công tập hợp 24 nòi nấm đạo ôn đại diện phục vụ công tác đánh giá kiểu hình tính kháng.
2. Xác định chính xác hai gen kháng bệnh đạo ôn còn hiệu lực cao nhất tại miền Bắc là Pik-h (nhiễm sắc thể 11) và Pi9(t) (nhiễm sắc thể 6); đồng thời xác lập được cặp chỉ thị phân tử liên kết hữu hiệu (pB8 cho gen Pi9(t) và RM224 cho gen Pik-h) ứng dụng tin cậy trong chọn giống hỗ trợ chỉ thị phân tử.
3. Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm minh chứng cho hiệu quả vượt trội của chiến lược quy tụ đa gen kháng (gene pyramiding) so với sử dụng đơn gen kháng trong việc mở rộng phổ kháng và nâng cao tính bền vững trước quần thể nấm đạo ôn biến dị phức tạp.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Đã chọn tạo thành công dòng lúa thuần BC15.2 tích hợp đồng thời hai gen kháng bệnh đạo ôn hữu hiệu Pik-h và Pi9(t) trên nền di truyền của giống lúa BC15 bằng phương pháp MABC.
2. Dòng lúa BC15.2 vừa khắc phục triệt để tính mẫn cảm với bệnh đạo ôn của giống gốc (kháng với cả 24 nòi nấm đại diện), vừa duy trì ổn định toàn bộ các đặc tính nông học quý: thời gian sinh trưởng phù hợp cơ cấu mùa vụ, năng suất cao, tỷ lệ hạt chắc cao, phẩm chất cơm gạo ngon, không bị phân ly.
3. Tạo ra nguồn vật liệu di truyền quý giá gồm các dòng lúa đơn gen thuần và dòng mang đa gen kháng trên nền di truyền BC15, đóng góp trực tiếp cho mạng lưới nghiên cứu và các chương trình chọn tạo giống lúa kháng sâu bệnh bền vững tại Việt Nam.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề nghị tiếp tục đưa dòng lúa triển vọng BC15.2 vào hệ thống khảo nghiệm giống cây trồng quốc gia (khảo nghiệm DUS và VCU) tại nhiều vùng sinh thái khác nhau để nhanh chóng công nhận lưu hành và đưa vào sản xuất đại trà.
• Khuyến nghị sử dụng bộ 24 nòi nấm đạo ôn đại diện phía Bắc và quy trình sàng lọc chỉ thị phân tử (pB8, RM224) làm quy chuẩn đánh giá tính kháng cho các chương trình cải tiến giống lúa khác tại miền Bắc.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Phạm vi thu thập mẫu nấm bệnh đạo ôn cổ bông và khảo sát độc tính tập trung chủ yếu tại các tỉnh phía Bắc trong giai đoạn 2012 - 2016; các thí nghiệm khảo nghiệm nông học và tính kháng đồng ruộng của các dòng lai mới chỉ được thực hiện tập trung tại điểm thí nghiệm Hoài Đức, thành phố Hà Nội.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Cần tiếp tục theo dõi, giám sát sự biến động nòi sinh học của quần thể nấm đạo ôn trên diện rộng theo thời gian để kịp thời phát hiện nguy cơ xuất hiện các nòi nấm mới có khả năng vượt qua tính kháng của gen Pik-h và Pi9(t).
  • Mở rộng khảo nghiệm dòng lúa BC15.2 tại các vùng sinh thái khác (Bắc Trung Bộ, Duyên hải Nam Trung Bộ, Tây Nguyên) để đánh giá tính ổn định năng suất và khả năng thích ứng môi trường.
  • Nghiên cứu tích hợp thêm các gen kháng đối với các đối tượng dịch hại nguy hiểm khác (như bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae hoặc rầy nâu) vào nền dòng lúa BC15.2.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Di truyền - Chọn giống cây trồng và Công nghệ sinh học: Luận án là tài liệu tham khảo thực nghiệm chuẩn mực về quy trình thiết kế và thực thi một chương trình MABC hoàn chỉnh từ bước chọn lọc gen mục tiêu, sàng lọc tái tổ hợp, đánh giá đồ họa hệ gen (phần mềm GGT) đến phục hồi nền di truyền kết hợp khảo nghiệm kiểu hình.
• Đối với cán bộ nghiên cứu Bảo vệ thực vật và Bệnh học phân tử: Cung cấp phương pháp luận chi tiết về phân lập nấm đơn bào tử, lây nhiễm nhân tạo có kiểm soát và khóa định danh nòi nấm nấm đạo ôn bằng bộ 25 dòng lúa chỉ thị monogenic quốc tế (LTH).
• Đối với các nhà chọn giống và doanh nghiệp giống cây trồng: Cung cấp nguồn vật liệu lai bố mẹ mang gen kháng đích (Pik-h, Pi9(t)) cùng bộ chỉ thị phân tử sẵn có (pB8, RM224) để rút ngắn thời gian cải tiến các giống lúa thuần chất lượng cao khác đang bị nhiễm đạo ôn.
• Đối với các cơ quan quản lý nông nghiệp và khuyến nông: Cung cấp luận cứ khoa học để xây dựng cơ cấu giống hợp lý cho vụ Đông Xuân, thay thế dần các giống nhiễm bệnh, giảm áp lực sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật và thúc đẩy sản xuất lúa gạo bền vững.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao giống lúa BC15 lại cần được cải tiến tính kháng bệnh đạo ôn?

Giống lúa BC15 là giống lúa thuần năng suất cao, chất lượng gạo ngon và thích ứng rộng, từng đóng góp tăng năng suất lúa cả nước từ 8% đến 10% sau 10 năm đưa vào cơ cấu sản xuất. Tuy nhiên, giống này có nhược điểm lớn là rất mẫn cảm và thường xuyên bị nhiễm nặng bệnh đạo ôn lá và đạo ôn cổ bông, đặc biệt trong vụ Đông Xuân tại miền Bắc (như các đợt dịch ghi nhận tại Hà Nội, Nghệ An năm 2021). Do đó, việc cải tiến tính kháng đạo ôn cho BC15 là yêu cầu cấp thiết để bảo vệ năng suất mà không làm mất đi các ưu điểm nông học vốn có.

2. Hai gen kháng bệnh đạo ôn nào đã được tích hợp vào giống BC15 và chúng nằm ở vị trí nào trong hệ gen lúa?

Hai gen kháng được lựa chọn là Pik-h và Pi9(t). Gen Pik-h (còn được biết đến với tên gọi Pi54) nằm trên nhiễm sắc thể số 11 tại vị trí 101,9 cM thuộc locut Pik. Gen Pi9(t) nằm trên nhiễm sắc thể số 6 tại vị trí 58,7 cM thuộc locut Pi9/Pi2. Đây đều là các gen kháng định tính có phổ kháng rất rộng đối với các nòi nấm đạo ôn tại châu Á.

3. Tác giả sử dụng các chỉ thị phân tử nào để sàng lọc hai gen kháng mục tiêu trong phương pháp MABC?

Tác giả sử dụng chỉ thị phân tử chuyên biệt dạng SCAR là pB8 (liên kết hoàn toàn ở khoảng cách 0 cM) để theo dõi và chọn lọc gen kháng Pi9(t). Đối với gen kháng Pik-h, tác giả sử dụng chỉ thị vi vệ tinh SSR là RM224 (liên kết chặt ở khoảng cách 0 - 0,2 cM), kết hợp kiểm chứng bằng các chỉ thị SSR liên kết lân cận như RM206, RM1233, RM144.

4. Ý nghĩa của việc thiết lập bộ 24 nòi nấm đạo ôn đại diện cho các tỉnh phía Bắc là gì?

Quần thể nấm Pyricularia oryzae tại miền Bắc có tính đa dạng di truyền và biến dị độc tính rất cao. Thay vì chỉ thử nghiệm tính kháng với một vài mẫu bệnh ngẫu nhiên dễ dẫn đến kết luận sai lệch, việc phân lập và xác định chuẩn xác 24 nòi nấm đại diện bằng bộ 25 dòng lúa chỉ thị monogenic LTH cho phép tạo ra một hệ thống "thước đo" chuẩn hóa. Nhờ đó, việc đánh giá kiểu hình tính kháng của các dòng lúa cải tiến được thực hiện chính xác, bảo đảm tính kháng phổ rộng trước toàn bộ quần thể nấm trong vùng.

5. Dòng lúa cải tiến BC15.2 đạt được những kết quả cụ thể nào so với giống gốc BC15?

Dòng lúa BC15.2 mang đồng thời hai gen kháng Pik-h và Pi9(t) ở trạng thái đồng hợp tử trên nền di truyền BC15. Khi kiểm tra lây nhiễm nhân tạo với 24 nòi nấm đạo ôn đại diện, dòng BC15.2 thể hiện tính kháng hoàn toàn (điểm bệnh 0 - 1), trong khi giống gốc BC15 bị nhiễm nặng. Đồng thời, qua các vụ khảo nghiệm đồng ruộng tại Hoài Đức, dòng BC15.2 giữ nguyên các đặc tính nông học quý của giống gốc BC15: thời gian sinh trưởng tương đương, chiều cao cây và dạng hình chuẩn, tiềm năng năng suất thực thu cao, tỷ lệ lép thấp và chất lượng cơm gạo dẻo đậm không đổi.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Nhài là một công trình khoa học thực nghiệm hoàn chỉnh thuộc chuyên ngành Di truyền và Chọn giống cây trồng, giải quyết thành công bài toán cải tiến tính kháng bệnh đạo ôn cho giống lúa thuần chủ lực BC15. Bằng cách kết hợp chuẩn xác giữa giám định độc tính quần thể nấm đạo ôn bằng bộ dòng chỉ thị chuẩn quốc tế và kỹ thuật chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại (MABC), tác giả đã chọn tạo thành công dòng lúa thuần BC15.2 tích hợp đồng thời hai gen kháng hữu hiệu Pik-h và Pi9(t). Dòng lúa mới không chỉ thể hiện khả năng kháng phổ rộng với 24 nòi nấm đạo ôn đại diện phía Bắc mà còn bảo tồn trọn vẹn tiềm năng năng suất cao và phẩm chất cơm gạo ưu việt của giống gốc, đóng góp một giải pháp giống chất lượng cao, bền vững cho ngành sản xuất lúa gạo Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình sản xuất lúa gạo và ảnh hưởng của bệnh đạo ôn đến sản xuất lúa của Việt Nam 1. Tình hình sản xuất lúa gạo của Việt Nam Lúa gạo vừa là nguồn lương thực quan trọng, vừa là mặt hàng xuất khẩu chiến lược của Việt Nam. Xuất khẩu gạo có vai trò quan trọng đối với phát triển kinh tế - xã hội của Việt Nam.

Những năm gần đây, ngành gạo đã có những bước phát triển vượt bậc và đạt được nhiều kết quả. Hàng năm, lượng gạo của Việt Nam xuất khẩu chiếm khoảng 15% tổng lượng gạo xuất khẩu toàn thế giới. Hạt gạo Việt đã có mặt trên 150 nước và vùng lãnh thổ. Thị trường xuất khẩu chính là châu Á, trong đó, Trung Quốc và Philippines là hai thị trường chính của xuất khẩu gạo.

Từ năm 2018 đến năm 2021 sản lượng lúa tăng mặc dù diện tích trồng lúa giảm (Hình 1. Tổng diện tích gieo trồng lúa cả năm 2021 đạt 7,24 triệu ha, tuy giảm khoảng 40 nghìn ha so với năm trước nhưng sản lượng lúa đạt 43,8 triệu tấn, tăng 1,1 triệu tấn [19]. Diện tích và sản lượng lúa qua các năm tại Việt Nam [19] Sản lượng lúa đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước, đảm bảo an ninh lương thực, phục vụ chế biến và xuất khẩu. Sản xuất lúa gạo tiếp tục xu 6 hướng tăng tỷ lệ sử dụng giống lúa chất lượng cao để nâng cao giá trị “Thương hiệu hạt gạo Việt”, xuất khẩu gạo giảm về khối lượng nhưng tăng về giá trị.

Vụ đông xuân là vụ lúa cho tỷ trọng sản lượng lớn nhất trong năm, chiếm gần 47% sản lượng lúa sản xuất cả năm. Diện tích gieo trồng lúa đông xuân 2021 cả nước đạt 3.006,8 nghìn ha, bằng 99,4% vụ đông xuân năm trước do xu hướng đô thị hóa, chuyển dịch lao động và chuyển đổi cơ cấu sản xuất cây trồng. Sản lượng đạt 20.629,5 nghìn tấn, tăng 755,1 nghìn tấn so với vụ đông xuân năm trước. Trong đó các tỉnh phía Bắc, sản lượng đạt 7.004,1 nghìn tấn, tăng 128,7 nghìn tấn [19].

Năng suất lúa đã và đang được cải thiện một cách đáng kể, năm 2017 năng suất bình quân cả nước 5,5 tấn/ha, đến năm 2022 năng suất bình quân đạt 6,0 tấn/ha, điều này có được là nhờ việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật nông nghiệp vào sản xuất một cách rộng rãi hơn. Sản xuất thâm canh cao giúp năng suất và sản lượng tăng tuy nhiên vẫn còn rất nhiều khó khăn để tạo được sản xuất lúa gạo bền vững trước những thách thức biến đổi khí hậu và sâu bệnh hại, đặc biệt là bệnh đạo ôn lúa thường xảy ra vào vụ đông xuân. Ảnh hưởng của bệnh đạo ôn đến sản xuất lúa của Việt Nam Một vài năm trở lại đây, trước những biến đổi bất lợi của điều kiện ngoại cảnh bệnh đạo ôn có nguy cơ bùng phát triển diện rộng và có thể phát triển thành dịch nếu không được phát hiện kịp thời. Theo số liệu thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, trong tuần 1 tháng 5/2021, diện tích lúa Đông Xuân bị nhiễm bệnh đạo ôn lá 9.213 ha so với kỳ trước, tăng 2.048 ha so với cùng kỳ năm trước), phòng trừ 8.622 ha, phân bố chủ yếu tại các tỉnh Kiên Giang, Long An, An Giang, Hậu Giang, Đồng Tháp, Bình Thuận, Gia Lai, Lâm Đồng… Diện tích lúa nhiễm bệnh đạo ôn cổ bông 2.107 ha (tăng 7 511 ha so với kỳ trước, giảm 416 ha với cùng kỳ năm trước) mất trắng 1,6 ha tại Hải Phòng, diện tích phòng trừ trong kỳ 80.564 ha, phân bố chủ yếu tại các tỉnh Kiên Giang, Tiền Giang, Cần Thơ, Điện Biên, Bắc Ninh, Hà Nội, Quảng Bình…[5].

Năm 2021, theo báo cáo của sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thành phố Hà Nội, diện tích gieo cấy vụ Đông Xuân (85,1 nghìn ha) lớn nhất của vùng Đồng bằng sông Hồng, nhóm lúa thuần năng suất cao chiếm 32% diện tích gieo cấy là các giống BC15, Thiên Ưu 8, Khang Dân…. Theo báo cáo sơ kết công tác bảo vệ thực vật của chị cục trồng trọt và bảo vệ thực vật Hà Nội, diện tích lúa bị nhiễm đạo ôn lá 641,62 ha (nhiễm nặng 5 ha), đạo ôn cổ bông nhiễm 181,286 ha (nhiễm nặng 11,2 ha), các giống lúa nhiễm nặng BC15, TBR225, J02, Nếp 9603, phân bố ở các huyện Ứng Hòa, Thạch Thất, Chương Mỹ….[3] Năm 2021, Nghệ An có diện tích gieo cấy vụ Đông Xuân (91,7 nghìn ha) lớn thứ hai của vùng Bắc Trung bộ. Theo báo cáo sơ kết công tác bảo vệ thực vật vụ Xuân 2021 của chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Nghệ An, bệnh đạo ôn lá đã phát sinh gây hại trên diện rộng. Toàn tỉnh có trên 1.777,63 ha lúa nhiễm bệnh, trong đó có 134,4 ha nhiễm nặng và 11,03 ha mất trắng.

So với năm 2020 diện tích nhiễm giảm 567,4 ha, diện tích nhiễm nặng giảm 129,6 ha và mất trắng giảm 13,57 ha. Bệnh đạo ôn cổ bông đã phát sinh gây hại cục bộ song một số diện tích có mức độ gây hại khá cao. Toàn tỉnh đã có trên 494,1 ha lúa nhiễm bệnh, trong đó có 45,9 ha nhiễm nặng. So với năm 2020 diện tích nhiễm tăng 223,9 ha, nhiễm nặng tăng 2,15 ha.

Các địa phương có diện tích nhiễm lớn gồm: Yên Thành, TP.Vinh, Hưng Nguyên, Tân Kỳ, Nghi Lộc, Đô Lương,.Các giống nhiễm nặng BC15, TBR225, AC5…[4] 8 Hàng năm, diện tích lúa bị nhiễm bệnh đạo ôn lá và đạo ôn cổ bông tăng lên nhanh chóng và mức độ tăng dần. Giống lúa BC15 bị nhiễm nhiều ở vụ Đông Xuân. Nhiều giải pháp đã được áp dụng có hiệu quả trong hạn chế sự gây hại của bệnh đạo ôn tuy nhiên việc sử dụng giống kháng bệnh đạo ôn bền vững vẫn là giải pháp hiệu quả nhất. Do vậy việc nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống kháng bệnh đạo ôn trên nền giống lúa BC15 là rất cần thiết.

Chỉ thị di truyền và ứng dụng chỉ thị di truyền trong chọn tạo giống cây trồng 1. Chỉ thị di truyền Chỉ thị di truyền là những đặc tính sinh học được xác định bằng dạng hình alen hoặc locut gen và có thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, do đó chúng có thể được sử dụng như thiết bị dò hoặc gắn theo để theo dõi cá thể, mô, tế bào, nhân, nhiễm sắc thể hoặc gen [55] ,[75]. Chỉ thị ADN được phát triển thành nhiều hệ thống dựa trên phương pháp và các kỹ thuật phát hiện đa hình khác nhau như chỉ thị RFLP, AFLP, RAPD, SSR, SNP. Mục tiêu của các chương trình nghiên cứu và chọn giống là tìm kiếm mối tương quan của chỉ thị với tính trạng mong muốn, hay có thể hiểu là mức độ liên kết của chỉ thị và các gen/QTL kiểm soát tính trạng cụ thể.

Nhờ vậy, nhà chọn giống có thể chọn lọc tính trạng quan tâm nhờ vào việc chọn lọc gián tiếp sử dụng chỉ thị. Khi chỉ thị được xác định liên kết với tính trạng, chỉ thị đó cho biết sự có mặt hay vắng mặt của gen hoặc QTL quan tâm và không ảnh hưởng đến kiểu hình tính trạng. Do vậy ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống có thể hiểu đơn giản là sử dụng các kỹ thuật ở các cấp độ phân tử ADN, kết hợp với bản đồ liên kết và hệ gen nhằm mục đích thay đổi hoặc cải tiến các tính trạng mong muốn ở cây trồng. Một số phương pháp ứng dụng chỉ thị di truyền trong chọn tạo giống cây trồng 1.

Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) Trước khi triển khai chương trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử cần đáp ứng một số yêu cầu sau: (a) Bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các vùng tương đồng để định vị chính xác các gen hoặc QTL quan tâm; (b) Mối liên kết chặt giữa chỉ thị và gen/QTL nghiên cứu; (c) Sự tái tổ hợp phù hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen; (d) Khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một không gian, thời gian và mức chi phí hợp lý [37]. Hai dạng chỉ thị mang lại những ứng dụng hiệu quả cho MAS gồm có: (1) loại chỉ thị được định vị ngay trên phạm vi gen/QTL quan tâm tại vị trí 0 cM, đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm kiếm loại chỉ thị này; (2) nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng với gen/QTL quan tâm. Mối liên kết chỉ thị - gen được nhận biết khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau. Chọn lọc dựa trên loại chỉ thị này gọi là dựa trên liên kết không cân bằng (LD).

Một số khía cạnh các nhà chọn giống cần quan tâm trước khi thực hiện chương trình chọn giống là: Giảm thiểu liên kết kéo theo bằng việc sử dụng các chỉ thị cận biên (flanking marker) liên kết chặt với gen mục tiêu; giảm thiểu kích thước quần thể, có nghĩa cần ít nhất một cá thể tái tổ hợp giữa gen mục tiêu và chỉ thị cận biên trong khoảng cách < 5cM; số lượng gen chuyển, khoảng cách chỉ thị QTL và chỉ thị cận biên sử dụng; tần số các kiểu gen mong muốn; đánh giá kiểu gen và hiệu quả chọn lọc tính trạng quan tâm [45]. Như vậy, phương pháp MAS bước đầu tiên là xác định chỉ thị phân tử liên kết gen/locus gen quy định tính trạng mong muốn (lập bản đồ QTLs/gen). Bước 2 là sử dụng chỉ thị phân tử liên kết QTLs/gen sàng lọc 10 các cá thể mang gen/locus gen đích trong các quần thể phân ly trong chọn tạo giống (Hình 1. Phương pháp MAS mang lại nhiều thuận lợi như: đơn giản hơn nhiều so với phương pháp chọn giống truyền thống, đặc biệt đối với tính trạng khó, có thể tiết kiệm thời gian và kinh phí.

Chọn lọc cá thể mang gen tại giai đoạn cây con và các kiểu gen cây trồng không mong muốn có thể nhanh chóng bị loại bỏ [59], có độ chính xác cao, không ảnh hưởng bởi tác nhân môi trường, có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử, dị hợp tử và chọn lọc chính xác cá thể. Phương pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử 1. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại (MABC) Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà khoa học đã ứng dụng nhiều phương pháp mới để hỗ trợ cho chọn tạo giống truyền thống (đột biến phân tử, chỉ thị phân tử, công nghệ chuyển gen.