BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRIỆU ANH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CHỌN GIỐNG TU HÀI (Lutraria rhynchaena, Jonas 1844) THEO HƯỚNG TĂNG TRƯỞNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9.21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Nguyễn Xuân Viết PGS. TS Thái Thanh Bình Hà Nội LỜI CAM ĐOAN Tôi là Triệu Anh Tuấn, Nghiên cứu sinh (NCS) khóa 36, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội chuyên ngành Di truyền học, mã số: 9.21, xin cam đoan Luận án là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các nội dung, kết quả nghiên cứu phân tích, đánh giá do chính tôi thực hiện trên cơ sở các nguồn số liệu đã thu thập được. Các tài liệu tham khảo trong luận án là cơ sở lý luận để đánh giá tổng quan, so sánh, phân tích và thảo luận đã được trích dẫn đầy đủ và đúng theo quy định.
Nội dung và kết quả trong luận án đảm bảo độ tin cậy, tính khoa học, không trùng lặp và đã được NCS công bố một phần trên các tạp chí chuyên ngành uy tín trong và ngoài nước. NGHIÊN CỨU SINH Triệu Anh Tuấn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, cho phép nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. Nguyễn Xuân Viết và PGS. Thái Thanh Bình là những người hướng dẫn đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ nghiên cứu sinh trong suốt thời gian thực hiện đề tài luận án.
Nghiên cứu sinh xin cảm ơn Ban Lãnh đạo Trường cao đẳng kinh tế, kỹ thuật và Thủy sản và các anh, chị công tác tại phòng Công nghệ sinh học của nhà trường đã tạo mọi điều kiện trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học, phòng Sau đại học và toàn thể các thầy cô đã tạo mọi điều kiện tốt nhất trong thời gian học tập tại nhà Trường. Xin cảm ơn Uỷ ban nhân dân tỉnh Phú Thọ, Trường Đại học Hùng Vương đã hỗ trợ kinh phí học tập, Phòng Khoa học và Công nghệ tạo điều kiện về thời gian để nghiên cứu sinh học tập và hoàn thành luận án. Xin được cảm ơn Giáo sư Christopher Austin cùng cộng sự tại Trung tâm Công nghệ Genomics, Trường Đại học tổng hợp Deakin, Geelong, Australia đã giúp đỡ NCS thực hiện đề tài luận án.
Xin cảm ơn Hội nông dân huyện Vân Đồn, ông Hà Văn Ninh và ông Nguyễn Hồng Quang đã hỗ trợ NCS trong quá trình khảo sát, thu mẫu, tiến hành thí nghiệm. NCS xin được cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và sẵn sàng giúp đỡ trong suốt những tháng năm học tập và thực hiện luận án. Xin trân trọng cảm ơn! NGHIÊN CỨU SINH Triệu Anh Tuấn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.vi DANH MỤC BẢNG.viii DANH MỤC HÌNH.
Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
Đối tượng, phạm vi giới hạn của luận án. Những đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU. Giới thiệu chung về tu hài.
Vị trí phân loại học. Phân bố tự nhiên. Một số đặc điểm cấu tạo tu hài. Tình hình nuôi và khai thác tu hài.
Nghiên cứu chọn giống theo hướng tăng trưởng. Chọn lọc dựa trên kiểu hình. Chọn lọc theo kiểu gene. Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu nhuyễn thể hai mảnh vỏ.
Chỉ thị phân tử. Chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu phân loại. Chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứuxây dựng mã vạch DNA ở một số loài. Chỉ thị SNP ứng dụng trong nghiên cứu ở các loài hai mảnh vỏ.
Nghiên cứu giải trình tự hệ gene ở loài hai mảnh vỏ. Một số nghiên cứu di truyền phân tử ở tu hài. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Vật liệu nghiên cứu.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Điều tra thành phần loài tu hài, hiện trạng nghề nuôi tu hài tại Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài. Phương pháp xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L.
Phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gene tu hài L. Phương pháp giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài L. Phương pháp phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài. Phương pháp phân tích, xử lý dữ liệu.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn, hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn, tỉnh Quảng Ninh. Khảo sát thành phần loài tu hài phân bố tự nhiên tại huyện Vân Đồn. Đánh giá hiện trạng và tiềm năng phát triển nghề nuôi tu hài tại huyện Vân Đồn hiện nay.
Xây dựng mã vạch DNA cho tu hài L. Khảo sát dữ liệu để xây dựng mã vạch DNA vùng gen 16S rRNA, COI của giống Lutraria trên hệ thống mã vạch quốc tế. Xây dựng cây phát sinh chủng loại cho các loài tu hài. Xây dựng mã vạch DNA để nhận dạng tu hài L.
Giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã của tu hài L. Tách chiết và tinh sạch DNA. Thiết lập thư viện và giải trình tự hệ gene và hệ gene phiên mã tu hài. Ứơc lượng kích thước hệ gene tu hài.
Lắp ráp hệ gene của tu hài L. Ước lượng dị hợp tử, trình tự lặp lại và tìm kiếm đa hình. Lắp ráp hệ gene phiên mã. Dự đoán và chú thích hệ gene tu hài.
So sánh đặc điểm hệ gene L. rhynchaena với các loài hai mảnh vỏ. Sàng lọc, tuyển chọn và phát triển chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tu hài. Giải trình tự ezRAD-Seq ở tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.
Xây dựng cơ sở dữ liệu, sàng lọc các SNP ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Sàng lọc outlier loci ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Sàng lọc chỉ thị SNP tiềm năng ở tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Thiết kế mồi và nhân đoạn trình tự chứa chỉ thị SNP tiềm năng sàng lọc được ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.93 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.96 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN.98 TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1PL DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết Từ Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt tắt BAC Bacterial artificial chromosome Nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo bp Base pair Cặp base BOLDS Barcode Of Life Data Systems Hệ thống cơ sở dữ liệu mã vạch sống BUSCO Benchmarking Universal Single- Bộ trình tự tham chiếu Copy Orthologs BWA Burrowr-Wheerler Alignment Tool Công cụ dóng hàng COI Cytochrome C Oxidase subunit I Vùng gene COI CS Cộng sự CSDL Data base Cơ sở dữ liệu CSIRO Commonwealth Scientific and Tổ chức nghiên cứu khoa học và Industrial Research Organisation công nghiệp khối thịnh vượng chung Dam DNA adenine methylase Enzyme metyl hóa Adenine DNA DNA Acid Deoxyribonucleic Axid Đêoxyribônucleic, DNA ĐVTM Động vật thân mềm EBV Estimated Breeding Value Giá trị chọn giống ước tính EST Expressed Sequence Tag Đoạn trình tự biểu hiện EzRAD Enzyme Restriction-site Associated DNA liên kết vị trí enzym cắt hạn DNA chế FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông lương thế giới GWS Genome Wide Selection Chọn lọc dựa trên toàn bộ hệ gen Hi-C High-throughput chromosome Chụp cấu trúc nhiễm sắc thể conformation capture thông lượng cao NCS Nghiên cứu sinh NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới ONT Oxford Nanopore Technology Công nghệ đọc dài PB Pacific Biosciences Khoa học sinh học Thái Bình Dương PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL Quantitative Trait Loci Locus tính trạng số lượng RAPD Randomly Amplified Polymorphism Đa hình DNA khuếch đại ngẫu DNA nhiên RNA Ribonucleic Acid Acid Ribonucleic RFLP Restriction Fragment Length Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế Polymorphism SAM Sequence Alignment/ Map Dóng hàng trình tự/ bản đồ SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotic đơn SPB Sample Purification Beads Hạt tinh sạch mẫu TSLR TruSeq Synthetic Long Read Tổng hợp đọc dài bằng TruSeq WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gene DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thư viện EzRAD. Thành phần loài tu hài phân bố tại huyện Vân Đồn. Hiện trạng nghề nuôi tu hài (L.
rhynchaena) tại Vân Đồn năm 2019. Mã số truy cập và kích thước trình tự DNA gene 16S rRNA, COI của các loài trong giống Lutraria trên GenBank. Mức độ tương đồng trình tự DNA vùng gene 16S rRNA của tu hài L. rhynchaena với trình tự DNA của các loài tu hài đã công bố trên GenBank (%).
Mức độ tương đồng trình tự DNA vùng gene COI của tu hài L. rhynchaena với trình tự gene COI của các loài tu hài đã công bố trên GenBank (%). Các vị trí sai khác nucleotide trên trình tự vùng gene 16S rRNA (437 bp) của 5 loài tu hài trong nghiên cứu. Các vị trí sai khác nucleotide trên trình tự vùng gene COI (615 bp) của 5 loài tu hài trong nghiên cứu.
Kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gene tu hài (L. Kết quả giải trình tự hệ gene phiên mã tu hài (L. Kết quả lắp ráp và chú thích hệ gene tu hài. Giá trị chọn giống ước tính cho tính trạng tăng trưởng giữa hai nhóm tu hài.
Tóm tắt kết quả xử lý giải trình tự. Thống kê SNP trong 12 gene liên quan tính trạng tăng trưởng ở tu hài. Thông tin về SNP sau sàng lọc ở nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Kết quả xử lý dữ liệu trình tự dựa trên hệ gene tham chiếu (dDocent và Stacks) và contig của nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.
Số lượng biến dị phát hiện ở hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh, tăng trưởng chậm và kiểu biến dị phân tử. Thông tin SNP tiềm năng cho nhóm tu hài tăng trưởng nhanh. Thông tin SNP tiềm năng cho nhóm tu hài tăng trưởng chậm. Thông tin cặp mồi SNP và sản phẩm khuếch đại ở hai nhóm tu hài tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.94 DANH MỤC HÌNH Hình 1.
Tu hài (Lutralia rhynchaena, Jonas 1844) thu tại Vân Đồn, Quảng Ninh. Bản đồ thu mẫu và mật độ tu hài phân bố tại huyện Vân Đồn, Quảng Ninh. Tình hình khai thác thủy sản trên thế giới. Quy trình tóm tắt xây dựng mã vạch DNA.
Sơ đồ sự phát triển của công nghệ giải trình tự gene.