Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin H5N1 và khả năng sinh miễn dịch

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

Trường đại học

Học viện Khoa học và Công nghệ

Chuyên ngành

Công nghệ sinh học

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

luận án tiến sĩ

2021

182

Phí lưu trữ

45 Point

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu kháng nguyên hemagglutinin tái tổ hợp H5N1 trên cây thuốc lá là một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm. Virus cúm A/H5N1 gây ra dịch bệnh nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gia cầm. Việc phát triển vaccine hiệu quả là cần thiết để ngăn chặn sự lây lan của virus này. Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo ra kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp thông qua phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá, nhằm đánh giá khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên này.

1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu

Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây lan nhanh chóng và gây tử vong cao ở gia cầm và con người. Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm đã diễn ra từ năm 2003, với nhiều ổ dịch và sự biến đổi gen của virus. Điều này đặt ra thách thức lớn trong việc phát triển vaccine hiệu quả. Việc nghiên cứu và sản xuất kháng nguyên HA tái tổ hợp từ cây thuốc lá không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn tạo ra nguồn vaccine kịp thời, đáp ứng nhanh chóng khi có dịch bệnh xảy ra.

II. Tổng quan tài liệu

Virus cúm A/H5N1 thuộc nhóm virus cúm gia cầm có khả năng gây bệnh nghiêm trọng. Kháng nguyên hemagglutinin là một trong hai kháng nguyên chính của virus, có vai trò quan trọng trong việc phát triển vaccine. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng cây thuốc lá để sản xuất kháng nguyên có thể mang lại nhiều lợi ích. Phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được chứng minh là hiệu quả trong việc sản xuất protein có hoạt tính sinh học.

2.1. Cấu trúc và chức năng của virus cúm A H5N1

Virus cúm A/H5N1 có cấu trúc phức tạp, bao gồm nhiều protein, trong đó hemagglutinin đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết virus với tế bào chủ. Sự biến đổi gen của HA có thể ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh và đáp ứng miễn dịch của vaccine. Nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của HA là cần thiết để phát triển các loại vaccine hiệu quả hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá để sản xuất kháng nguyên HA tái tổ hợp. Các bước chính bao gồm lựa chọn gen mã hóa kháng nguyên HA, thiết kế vector biểu hiện, và đánh giá sự biểu hiện của kháng nguyên trong cây thuốc lá. Phương pháp này cho phép sản xuất kháng nguyên với số lượng lớn trong thời gian ngắn, đáp ứng nhanh chóng nhu cầu vaccine khi có dịch bệnh.

3.1. Thiết kế vector biểu hiện

Vector biểu hiện được thiết kế để chứa gen mã hóa kháng nguyên HA. Việc lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện là rất quan trọng để đảm bảo kháng nguyên được sản xuất với hoạt tính sinh học cao. Các phương pháp tinh sạch và đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên cũng được thực hiện để đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng.

IV. Kết quả nghiên cứu

Kết quả cho thấy kháng nguyên HA tái tổ hợp được sản xuất thành công trên cây thuốc lá với hoạt tính sinh học cao. Các thí nghiệm đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho thấy kháng nguyên này có thể kích thích sản xuất kháng thể ở động vật thí nghiệm. Điều này mở ra triển vọng cho việc phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 từ nguồn kháng nguyên thực vật.

4.1. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch

Các thí nghiệm trên chuột và gà cho thấy kháng nguyên HA tái tổ hợp có khả năng kích thích sản xuất kháng thể IgG và IgY. Điều này chứng tỏ rằng kháng nguyên này có thể được sử dụng để phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1. Hơn nữa, việc sử dụng cây thuốc lá làm nguồn sản xuất kháng nguyên có thể giúp giảm chi phí và thời gian sản xuất vaccine.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu kháng nguyên hemagglutinin tái tổ hợp H5N1 trên cây thuốc lá đã chứng minh tính khả thi và hiệu quả trong việc sản xuất kháng nguyên cho vaccine phòng bệnh cúm gia cầm. Việc phát triển mô hình sản xuất này không chỉ giúp đáp ứng nhanh chóng nhu cầu vaccine mà còn góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá hiệu quả của vaccine trong thực tế.

5.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần mở rộng nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của vaccine được phát triển từ kháng nguyên HA tái tổ hợp trong các thử nghiệm lâm sàng. Đồng thời, nghiên cứu các phương pháp cải tiến trong sản xuất kháng nguyên từ cây thuốc lá để nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

25/01/2025

Bạn đang xem trước tài liệu:

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

Tải đầy đủ

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 (Influenza A virus subtype H5N1) thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Alphainfluenzavirus, loài virus cúm A (Influenza A virus). Virus cúm A được phân loại thành các phân nhóm theo sự kết hợp của hai protein bề mặt virus hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).

Cho đến nay có 18 phân nhóm HA khác nhau và 11 phân nhóm NA khác nhau và trong tự nhiên các phân nhóm HA và NA có thể tái tổ hợp luân chuyển (reassortment) tạo nên các phân type HxNy mới. Tùy thuộc vào vật chủ gốc, virus cúm A có thể được phân loại là cúm gia cầm (ví dụ: cúm gia cầm A/H5N1, A/H9N2, A/H5N6… ), cúm lợn (ví dụ: cúm lợn A/H1N1, A/H3N2…) hoặc các loại virus cúm động vật khác. Virus cúm A có phổ thích ứng rộng có thể gây bệnh trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau như: chim, gia cầm, thuỷ cầm, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và người. Đặc điểm thích ứng đa vật chủ là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi hoặc tái tổ hợp các phân đoạn gen (đặc biệt là gen kháng nguyên HA và NA) giữa các chủng lưu hành để tạo ra chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới.

Đặc biệt hơn, các phân type hay chủng mới gây bệnh khi chúng vượt qua được “rào cản loài” (species-barrier) dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [5]. Sự xuất hiện của một loại virus cúm A mới và rất khác biệt có khả năng lây nhiễm sang người và lây truyền từ người sang người là rất có thể và có khả năng gây ra đại dịch cúm toàn cầu. Virus cúm A/H5N1 gây bệnh nặng ở gia cầm và dẫn đến tỷ lệ tử vong cao nên còn được gọi là virus cúm gia cầm thể độc lực cao (highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV) type A và phân type (subtype) H5N1, HPAI A(H5N1)) [https://en.org/wiki/Influenza_A_virus_subtype_H5N1]. Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu đường kính từ 50–100 nm.

Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm và dài từ 200–300 nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi chứa RNA. Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm luan an 5 đã được đặc hiệu hóa để gắn protein màng của virus vào, bao gồm một số protein được glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein dạng trần không được glycosyl hoá (non-glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA, protein enzyme cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix).

Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin. Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhô lên từ bề mặt của virus, mỗi gai có độ dài từ 10–14 nm. Các gai này được cấu tạo bởi hai loại glycoprotein HA và NA.

Các gai HA thường nhiều hơn và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4–5):1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8]. Hệ gen virus cúm A/H5N1 là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn RNA riêng biệt (Hình 1.1), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2) [6]. Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50–100 nm, đường kính 9–10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) luan an 6 với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein của virus (vRNP) (Hình 1.

Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có độ dài từ 10.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm A) và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus. Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8–1,1% RNA, 70–75% là protein, 20–24% lipid và 5–8% là carbohydrate [7]. Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm trong lịch sử ở động vật và người [6, 9]. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lây truyền trong quần thể sinh vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections).

Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học là chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi gen thông qua H9N2 (trên lợn) [5, 10]. Virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể sử dụng nguồn phôi gà để sản xuất vaccine vô hoạt cho gia cầm. Để khắc phục điều này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã kiến tạo thành công hướng sản xuất vaccine H5N1 bằng phương pháp di truyền ngược (reverse genetics - based technology). Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo tái tổ hợp gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch nhưng không gây bệnh.

Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi nội gen và xảy ra nhanh nên việc sản xuất vaccine cũng gặp không ít khó khăn và đòi hỏi sự cập nhật liên tục. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên tục, nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho một loại protein của virus. Hai đầu 5' và 3' của RNA hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn trong tất cả virus cúm A, đó là 5'-AGUAGAACAAGG. và 3'- UCG(U/C)UUUCGUCC.

Sáu phân đoạn từ 1–6, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho các protein riêng biệt, phân đoạn 7 và 8 mã hoá cho từng phần của luan an 7 gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối ghép (splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp protein [8]. Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). RNP kết hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của virus. Phân đoạn 1 mã hoá cho enzyme polymerase PB2 (polymerase basic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã, có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực tế là: 87 kDa) [8].

Phân đoạn 2 mã hoá cho enzyme polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNAtranscriptase), có độ dài 2341 nucleotide, với trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) [11]. Phân đoạn 3 mã hoá cho enzyme kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNAtranscriptase) tham gia tổng hợp RNA, có độ dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực tế: 85 kDa) [11]. Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu). Có 18 loại HA, trong đó chỉ có H1, H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người.

Virus mang gen H5, H7 và H9 có thể lây nhiễm từ chim sang người. HA được phân bố rải rác trên bề mặt của virus, là protein kháng nguyên bề mặt type I liên quan đến sự bám dính của virus và gắn virus vào thụ thể acid sialic của tế bào, có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu gà và tham gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của virus, hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus. HA có phân tử lượng là 63 kDa (nếu không được glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48 kDa và HA2 là 29 kDa) [12], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type virus, đối với H5N1 là 1704–1707 bp, H7N1 là 1683–1695 bp, H9N1 là 1683 bp, H1N1 là 1701 bp. Phân đoạn 5 mã hoá cho protein nucleoprotein (NP) có trọng lượng phân tử tính toán là 56 kDa, gen NP của H5N1 có độ dài là 1497 bp [8].

Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu hiện đặc tính kháng nguyên luan an 8 đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein. Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA). NA có trọng lượng phân tử theo tính toán 50 kDa (thực tế: 48–63kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1 là 1350–1410 bp [12]. NA là protein màng type II tồn tại như các gai hình nấm trên bề mặt của virus.

NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính enzyme phân cắt liên kết giữa thụ thể acid sialic và HA, để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào, nhờ vậy mà đẩy nhanh quá trình lan truyền virus trong tế bào chủ. Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng bám dính vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình xâm nhập, nhân lên và giải phóng virus. Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1 và M2. Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng bao gói và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus.

Tiểu phần M2 là protein nội màng, có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân tử tính toán của M1 là 28 kDa (thực tế: 25 kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân đoạn M có độ dài khoảng 1027 bp [14].

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Luận án tiến sĩ mang tiêu đề "Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin H5N1 và khả năng sinh miễn dịch" của tác giả Phạm Thị Vân, được thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ, tập trung vào việc nghiên cứu kháng nguyên hemagglutinin tái tổ hợp H5N1 trên cây thuốc lá. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp cái nhìn sâu sắc về khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên H5N1 mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển vaccine phòng ngừa bệnh cúm gia cầm. Đặc biệt, luận án này có thể giúp các nhà nghiên cứu và chuyên gia y tế hiểu rõ hơn về cơ chế miễn dịch và ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ra các kháng nguyên hiệu quả.

Để mở rộng thêm kiến thức về các nghiên cứu liên quan đến dược liệu và công nghệ sinh học, bạn có thể tham khảo các tài liệu sau: Nghiên cứu phương pháp định lượng andrographolide trong dược liệu xuyên tâm liên bằng HPTLC, nơi nghiên cứu về dược liệu và phương pháp định lượng, và Nghiên cứu miễn dịch và hiệu quả hỗ trợ điều trị bệnh zona bằng kem lô hội AL04, cung cấp cái nhìn về ứng dụng của các sản phẩm tự nhiên trong y học. Những tài liệu này sẽ giúp bạn có cái nhìn tổng quát hơn về các nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học và dược liệu.

#nghiên cứu sinh học

#tái tổ hợp

#cây thuốc lá

#kháng nguyên hemagglutinin

#bệnh cúm gia cầm

Chủ đề

Nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học

Y học và vaccine

Ứng dụng cây trồng trong y học

Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin H5N1 và khả năng sinh miễn dịch

I. Giới thiệu

1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu

II. Tổng quan tài liệu

2.1. Cấu trúc và chức năng của virus cúm A H5N1

III. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Thiết kế vector biểu hiện

IV. Kết quả nghiên cứu

4.1. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch

V. Kết luận và kiến nghị

5.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

THÔNG TIN CHI TIẾT

Tác giả: Phạm Thị Vân

Người hướng dẫn: TS. Vũ Huyền Trang

Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Đề tài: Nghiên Cứu Kháng Nguyên Hemagglutinin Tái Tổ Hợp H5N1 Trên Cây Thuốc Lá

Loại tài liệu: luận án tiến sĩ

Năm xuất bản: 2021

Địa điểm: Hà Nội

Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin H5N1 và khả năng sinh miễn dịch

I. Giới thiệu

1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu

II. Tổng quan tài liệu

2.1. Cấu trúc và chức năng của virus cúm A H5N1

III. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Thiết kế vector biểu hiện

IV. Kết quả nghiên cứu

4.1. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch

V. Kết luận và kiến nghị

5.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Tài liệu liên quan

THÔNG TIN CHI TIẾT

Tác giả: Phạm Thị Vân

Người hướng dẫn: TS. Vũ Huyền Trang

Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Đề tài: Nghiên Cứu Kháng Nguyên Hemagglutinin Tái Tổ Hợp H5N1 Trên Cây Thuốc Lá

Loại tài liệu: luận án tiến sĩ

Năm xuất bản: 2021

Địa điểm: Hà Nội

Có thể bạn quan tâm