Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin H5N1 và khả năng sinh miễn dịch

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Phạm Thị Vân
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Huyền Trang
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Kháng Nguyên Hemagglutinin Tái Tổ Hợp H5N1 Trên Cây Thuốc Lá
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• Tính cấp thiết của luận án
• Mục tiêu nghiên cứu của luận án
• Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1
• 1.1.1. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A
• 1.1.2. Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin
• 1.1.3. Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1
• 1.2. Bệnh cúm gia cầm
• 1.2.1. Lịch sử và tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới
• 1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam
• 1.3. Vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm
• 1.3.1. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm trên thế giới
• 1.3.2. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam
• 1.3.3. Nghiên cứu vaccine cúm phổ rộng
• 1.3.4. Nghiên cứu vaccine từ thực vật
• 1.3.5. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA ELP hoá
• 1.3.6. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA oligomer hoá
• 1.4. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp tạm thời ở thực vật thông qua Agrobacterium (agroinfiltration)
• 1.4.1. Ứng dụng agroinfiltration trong nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học trên thế giới
• 1.4.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thông qua agroinfiltration ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguồn vật liệu thực vật
• 2.2. Chủng vi sinh vật, plasmid, trình tự gen
• 2.3. Các cặp mồi sử dụng
• 2.4. Nguồn vật liệu động vật
• 2.5. Môi trường và đệm
• 2.6. Phương pháp
• 2.6.1. Phương pháp lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1
• 2.6.2. Phương pháp sử dụng trong thiết kế cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá
• 2.6.3. Phương pháp tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp
• 2.6.4. Phương pháp đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1
• 3.1.1. Thu thập và phân loại trình tự HA theo từng năm
• 3.1.2. Phân tích đổi mã gen và tổng hợp nhân tạo chuỗi gen mã hóa kháng nguyên HA của chủng virus cúm A/H5N1 trên cơ sở những trình tự đã biến đổi
• 3.1.3. Thiết kế trình tự HA COBRA đại diện các chủng virus cúm A/H5N1 quan tâm
• 3.1.4. Chuyển đổi các trình tự amino acid của kháng nguyên HACOBRA1 và HACOBRA2 thành các trình tự nucleotide
• 3.1.5. Phân tích và so sánh trình tự của các protein HA lựa chọn trong nghiên cứu
• 3.2. Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá
• 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer
• 3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP
• 3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer TP
• 3.2.4. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện kháng nguyên HA trên cây thuốc lá
• 3.2.5. Đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên HA tái tổ hợp trong dịch chiết thô thuốc lá
• 3.2.6. Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA trong dịch chiết thô lá thuốc lá
• 3.3. Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp
• 3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá bằng mITC
• 3.3.2. Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP bằng IMAC
• 3.3.3. Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA sau tinh sạch
• 3.4. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm
• 3.4.1. Miễn dịch trên chuột thí nghiệm
• 3.4.2. Miễn dịch trên gà thí nghiệm
• 3.5. Lựa chọn gen HA là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam
• 3.6. HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường sự biểu hiện protein trong thực vật, đơn giản hoá trong tinh sạch nhưng không làm tăng cường hoạt tính sinh học của HA trimer
• 3.7. HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hoà phổ rộng trên động vật thí nghiệm
• 3.8. HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật
• 3.9. Dịch chiết thô thuốc lá chứa kháng nguyên HA oligomer TP có thể sử dụng làm ứng viên vaccine phòng bệnh cúm A trên động vật
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu kháng nguyên hemagglutinin tái tổ hợp H5N1 trên cây thuốc lá là một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm. Virus cúm A/H5N1 gây ra dịch bệnh nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gia cầm. Việc phát triển vaccine hiệu quả là cần thiết để ngăn chặn sự lây lan của virus này. Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo ra kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp thông qua phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá, nhằm đánh giá khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên này.

1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu

Virus cúm A/H5N1 có khả năng lây lan nhanh chóng và gây tử vong cao ở gia cầm và con người. Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm đã diễn ra từ năm 2003, với nhiều ổ dịch và sự biến đổi gen của virus. Điều này đặt ra thách thức lớn trong việc phát triển vaccine hiệu quả. Việc nghiên cứu và sản xuất kháng nguyên HA tái tổ hợp từ cây thuốc lá không chỉ giúp giảm chi phí sản xuất mà còn tạo ra nguồn vaccine kịp thời, đáp ứng nhanh chóng khi có dịch bệnh xảy ra.

II. Tổng quan tài liệu

Virus cúm A/H5N1 thuộc nhóm virus cúm gia cầm có khả năng gây bệnh nghiêm trọng. Kháng nguyên hemagglutinin là một trong hai kháng nguyên chính của virus, có vai trò quan trọng trong việc phát triển vaccine. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng cây thuốc lá để sản xuất kháng nguyên có thể mang lại nhiều lợi ích. Phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được chứng minh là hiệu quả trong việc sản xuất protein có hoạt tính sinh học.

2.1. Cấu trúc và chức năng của virus cúm A H5N1

Virus cúm A/H5N1 có cấu trúc phức tạp, bao gồm nhiều protein, trong đó hemagglutinin đóng vai trò quan trọng trong việc gắn kết virus với tế bào chủ. Sự biến đổi gen của HA có thể ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh và đáp ứng miễn dịch của vaccine. Nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của HA là cần thiết để phát triển các loại vaccine hiệu quả hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá để sản xuất kháng nguyên HA tái tổ hợp. Các bước chính bao gồm lựa chọn gen mã hóa kháng nguyên HA, thiết kế vector biểu hiện, và đánh giá sự biểu hiện của kháng nguyên trong cây thuốc lá. Phương pháp này cho phép sản xuất kháng nguyên với số lượng lớn trong thời gian ngắn, đáp ứng nhanh chóng nhu cầu vaccine khi có dịch bệnh.

3.1. Thiết kế vector biểu hiện

Vector biểu hiện được thiết kế để chứa gen mã hóa kháng nguyên HA. Việc lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện là rất quan trọng để đảm bảo kháng nguyên được sản xuất với hoạt tính sinh học cao. Các phương pháp tinh sạch và đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên cũng được thực hiện để đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng.

IV. Kết quả nghiên cứu

Kết quả cho thấy kháng nguyên HA tái tổ hợp được sản xuất thành công trên cây thuốc lá với hoạt tính sinh học cao. Các thí nghiệm đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho thấy kháng nguyên này có thể kích thích sản xuất kháng thể ở động vật thí nghiệm. Điều này mở ra triển vọng cho việc phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 từ nguồn kháng nguyên thực vật.

4.1. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch

Các thí nghiệm trên chuột và gà cho thấy kháng nguyên HA tái tổ hợp có khả năng kích thích sản xuất kháng thể IgG và IgY. Điều này chứng tỏ rằng kháng nguyên này có thể được sử dụng để phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1. Hơn nữa, việc sử dụng cây thuốc lá làm nguồn sản xuất kháng nguyên có thể giúp giảm chi phí và thời gian sản xuất vaccine.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu kháng nguyên hemagglutinin tái tổ hợp H5N1 trên cây thuốc lá đã chứng minh tính khả thi và hiệu quả trong việc sản xuất kháng nguyên cho vaccine phòng bệnh cúm gia cầm. Việc phát triển mô hình sản xuất này không chỉ giúp đáp ứng nhanh chóng nhu cầu vaccine mà còn góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình sản xuất và đánh giá hiệu quả của vaccine trong thực tế.

5.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần mở rộng nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của vaccine được phát triển từ kháng nguyên HA tái tổ hợp trong các thử nghiệm lâm sàng. Đồng thời, nghiên cứu các phương pháp cải tiến trong sản xuất kháng nguyên từ cây thuốc lá để nâng cao hiệu quả và giảm chi phí sản xuất.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Dịch cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) do virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm ở gia cầm và thủy cầm, đồng thời có khả năng lây truyền sang người với tỷ lệ tử vong cao. Kể từ khi tái bùng phát năm 2003, Việt Nam là một trong những quốc gia ghi nhận số lượng ổ dịch cúm A/H5N1 cao trên thế giới. Đặc tính biến đổi di truyền nhanh chóng của hệ gen virus, đặc biệt là các đột biến tích lũy trên gen mã hóa glycoprotein bề mặt Hemagglutinin (HA), đã dẫn đến hiện tượng trôi dạt kháng nguyên và hình thành nhiều nhóm (clade) cùng các nhánh phụ (subclade) kế tiếp nhau (clade 1, 1.1, 2.1, 2.3.2.1, 2.3.4, 7...). Sự sai khác kháng nguyên giữa các biến chủng thực địa và các chủng vaccine hiện hành làm suy giảm hiệu lực bảo hộ của các loại vaccine thương mại vô hoạt truyền thống, đòi hỏi quy trình sản xuất vaccine phải liên tục cập nhật chủng giống và rút ngắn thời gian đáp ứng khi dịch bệnh bùng phát.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là việc phát triển các kháng nguyên tái tổ hợp có tính sinh miễn dịch cao, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch bảo hộ phổ rộng trước các clade virus lưu hành tại Việt Nam, đồng thời ứng dụng hệ thống biểu hiện sinh học có khả năng nhân rộng nhanh, chi phí sản xuất thấp. Hệ thống biểu hiện tạm thời ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltration) trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana kết hợp với chiến lược thiết kế kháng nguyên phản ứng rộng được tối ưu hóa bằng tính toán (COBRA), cấu trúc trimer hóa và oligomer hóa thông qua đoạn Fc của IgM hoặc dung hợp peptide giống elastin (ELP) là giải pháp được lựa chọn để giải quyết khoảng trống này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm 3 nội dung chính:

1. Tạo được kháng nguyên HA A/H5N1 tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá.
2. Đánh giá được khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên HA A/H5N1 tự nhiên và nhân tạo ở các dạng trimer, oligomer TP và oligomer ELP tái tổ hợp có nguồn gốc từ thuốc lá.
3. Đề xuất được ứng viên tiềm năng cho định hướng phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 ở Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Gen mã hóa kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1 tự nhiên phân lập tại Việt Nam (thuộc clade 1 và clade 2.1c) và các trình tự HA nhân tạo được thiết kế bằng phương pháp COBRA (HACOBRA1 và HACOBRA2); các cấu trúc vector biểu hiện thực vật mang gen HA ở các dạng dung hợp cấu trúc monomer, trimer, oligomer ELP và oligomer TP; hệ thống thực vật biểu hiện tạm thời Nicotiana benthamiana; động vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng dòng BALB/c và gà thí nghiệm).
• Phạm vi không gian và thời gian: Các nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và tinh sạch protein được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Viện Nghiên cứu Di truyền và Cây trồng thực vật (IPK), CHLB Đức; các thử nghiệm gây đáp ứng miễn dịch và công cường độc trên gà được phối hợp thực hiện tại Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung ương NAVETCO; các trình tự gen virus cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam được thu thập và phân tích từ năm 2003 đến giai đoạn 2014–2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng quan hệ thống phân loại, đặc điểm sinh học và dịch tễ học của virus cúm A/H5N1 (thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Alphainfluenzavirus), cấu trúc hệ gen RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn mã hóa 11 protein (PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1, NS2). Glycoprotein bề mặt Hemagglutinin (HA) là kháng nguyên đích chủ yếu kích thích cơ thể sinh kháng thể trung hòa ức chế ngưng kết hồng cầu (HI). Cấu trúc tự nhiên của HA gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân được phân cắt bởi protease tế bào chủ thành hai tiểu đơn vị HA1 và HA2 nối với nhau bằng cầu nối disulfide. Điểm phân cắt protease chứa chuỗi amino acid kiềm đặc trưng cho độc lực (chuỗi -RRRKK- ở phân dòng Quảng Đông hoặc -RRRK- ở phân dòng Phúc Kiến đối với các chủng cường độc). Vị trí bám thụ thể tại amino acid 226 của tiểu đơn vị HA1 quyết định tính đặc hiệu vật chủ (chuỗi liên kết acid sialic Gal α-2,3 ở gia cầm và Gal α-2,6 ở người).

Về dịch tễ, tác giả điểm lại lịch sử dịch cúm A/H5N1 từ các ca phát hiện đầu tiên (1959 tại Scotland; 1996 tại Quảng Đông, Trung Quốc; 1997 tại Hồng Kông) và diễn biến tại Việt Nam qua các giai đoạn: 2003–2005 (thống trị bởi clade 1), 2006–2009 (xuất hiện clade 2.3.4, phân nhánh 1.1, clade 7), 2010–2012 (bùng phát các subclade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c), 2013–2014 và giai đoạn 2015–2020 với sự tồn tại đan xen của clade 1.1, 2.3.2.1c cùng sự xuất hiện của phân type H5N6 mang gen H5 từ nhánh 2.3.4.4.

Các nghiên cứu phát triển vaccine cúm phổ rộng và vaccine sản xuất từ thực vật được điểm lại bao gồm:

• Công nghệ thiết kế kháng nguyên COBRA (Computationally Optimized Broadly Reactive Antigen): Giles & Ross (2011) tạo kháng nguyên VLP H5N1 HA COBRA clade 2 bảo vệ hoàn toàn chuột và chồn; Chen et al. (2013), Kane et al. (2013) mở rộng trên mô hình linh trưởng; Crevar et al. (2015) phối hợp 3 kháng nguyên COBRA H5N1 tạo hiệu giá HI > 1:40 kháng lại 25 biến chủng thuộc 11 clade; Carter et al. (2016) trên H1N1 và H3N2.
• Biểu hiện kháng nguyên ở thực vật: Bắt đầu từ Curtiss & Cardineau (1990) với kháng nguyên SpaA, Mason et al. (1992) với kháng nguyên HBsAg; D'Aoust et al. (2008) biểu hiện hạt giống virus (VLP) mang HA trên N. benthamiana; Kalthoff et al. (2010) sử dụng hệ thống vector MagnICON tạo kháng nguyên HA bảo vệ gà chống virus cúm độc lực cao; Shoji et al. (2009, 2011) biểu hiện HA dung hợp LicKM; Phan Trọng Hoàng, Udo Conrad et al. (2013, 2017) phát triển hệ thống HA trimer hóa nhờ motif GCN4pII, dung hợp ELP (Elastin-like polypeptides) và công nghệ oligomer hóa dựa trên tương tác S-Protein/S-Tag hoặc phân đoạn Fc của IgM.

Khoảng trống luận án tập trung giải quyết: Kết hợp công nghệ thiết kế trình tự nhân tạo COBRA mang tính đại diện cho các clade virus cúm A/H5N1 lưu hành phổ biến ở Việt Nam (clade 1 và clade 2.1) với công nghệ oligomer hóa kháng nguyên qua đoạn Fc của IgM và công nghệ dung hợp ELP, thực hiện trên nền tảng biểu hiện tạm thời qua Agrobacterium tumefaciens trên cây thuốc lá N. benthamiana, thiết lập quy trình tinh sạch đơn giản bằng mITC và đánh giá hiệu lực bảo hộ trực tiếp trên động vật thí nghiệm (chuột và gà).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

• Cơ chế sinh miễn dịch của kháng nguyên HA: Kháng nguyên HA ở trạng thái trimer và oligomer đa tụ mô phỏng cấu trúc bề mặt virion tự nhiên, làm tăng khả năng nhận diện của tế bào lympho B, gia tăng liên kết chéo với thụ thể tế bào B và kích hoạt đáp ứng tạo kháng thể trung hòa hiệu quả hơn so với dạng monomer hòa tan.
• Nguyên lý biểu hiện tạm thời qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltration): Dựa trên việc chuyển T-DNA mang cassette biểu hiện mục tiêu vào nhân tế bào nhu mô lá cây thuốc lá thông qua áp lực chân không mà không cần tái sinh mô sẹo hay chuyển gen cố định vào hệ gen cây chủ. Quá trình phiên mã diễn ra nhanh chóng, cho phép thu nhận protein tái tổ hợp sau 5–7 ngày.
• Cơ chế oligomer hóa qua motif GCN4pII và đoạn Fc của phân tử IgM: Motif GCN4pII định hướng tự cuộn gập thành dạng trimer. Vùng Fc của IgM chuột gồm 3 domain hằng định (Cµ2, Cµ3, Cµ4) cùng đoạn đuôi peptide (tailpiece - tp) chứa gốc Cysteine ở vị trí 575 (Cys575) hình thành liên kết disulfide giữa các chuỗi nặng, dẫn dắt các tiểu đơn vị trimer liên kết lại thành phức hợp đa tụ lục thể (hexameric trimer, tương đương 18 phân tử monomer HA).
• Cơ chế chu kỳ chuyển tiếp nghịch đảo dựa trên màng lọc (mITC): Peptide giống elastin (ELP) gồm các đơn vị lặp (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)n có tính chất chuyển pha thuận nghịch theo nhiệt độ. Khi bổ sung muối hoặc chất gây kết tủa như Polyethylene glycol (PEG 8000) ở nhiệt độ phòng, protein dung hợp ELP chuyển pha không tan và được giữ lại trên màng lọc vi mô, sau đó được hòa tan trở lại trong dung dịch đệm lạnh.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Thiết kế trình tự và mô phỏng tin sinh học: Thu thập các trình tự gen HA của các chủng H5N1 tại Việt Nam từ cơ sở dữ liệu NCBI/GenBank; căn chỉnh đa trình tự bằng phần mềm BioEdit và ClustalW; xác định amino acid bảo thủ phổ biến tại mỗi vị trí để xây dựng trình tự HACOBRA1 và HACOBRA2; tối ưu hóa bộ ba mã hóa (codon optimization) cho hệ thống biểu hiện thực vật; mô phỏng cấu trúc không gian 3D bằng phần mềm RaptorX.
• Kỹ thuật tạo dòng và thiết kế vector: Cắt nối đoạn gen đích vào vector tách dòng pRTRA mang promoter CaMV 35S, tín hiệu bài xuất LeB4, tín hiệu lưu giữ lưới nội sinh chất KDEL, đuôi ái lực 6xHis, motif GCN4pII, đoạn Fc (Cµ2-Cµ4 kèm đuôi tp) và đoạn mã hóa 100xELP bằng các enzyme giới hạn (BamHI, PspOMI, NcoI, NotI); biến nạp vào chủng Escherichia coli DH5α và Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pGV2260).
• Biểu hiện tạm thời trên thực vật: Gieo ươm hạt Nicotiana benthamiana in vitro, chuyển sang hệ thống thủy canh trong phòng sinh trưởng; sử dụng cây 5 tuần tuổi; xâm nhiễm dịch khuẩn A. tumefaciens chứa vector biểu hiện mục tiêu kết hợp chủng mang gen p19 (ức chế câm gen) vào lá thuốc lá bằng buồng hút chân không ở áp suất 100 mbar; tối ưu hóa mật độ vi khuẩn $OD_{600}$ và thời gian thu hoạch lá (ngày thứ 5 sau biến nạp).
• Tinh sạch protein tái tổ hợp:
  • Đối với protein dung hợp ELP: Tinh sạch bằng phương pháp mITC cải tiến sử dụng màng lọc cellulose acetate (kích thước lỗ 0,2 µm hoặc 0,45 µm) kết hợp bổ sung PEG 8000 ở nồng độ tối ưu.
  • Đối với protein dạng trimer và oligomer TP: Tinh sạch bằng sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC) qua cột agarose gắn ion $\text{Ni}^{2+}$ (Ni-NTA).
• Đánh giá đặc tính hóa sinh và cấu trúc: Điện di SDS-PAGE biến tính và không biến tính; lai miễn dịch Western blot với kháng thể kháng chuỗi His-tag hoặc kháng HA; phản ứng liên kết chéo với hóa chất Bis(sulfosuccinimidyl)suberate ($\text{BS}^3$); sắc ký rây phân tử (Size Exclusion Chromatography - SEC); phản ứng gây ngưng kết hồng cầu gà (HA test) xác định hiệu giá ngưng kết.
• Đánh giá khả năng sinh miễn dịch trên động vật:
  • Thí nghiệm trên chuột: Chuột BALB/c (6–8 tuần tuổi) được tiêm miễn dịch dưới da 2 lần (cách nhau 14 ngày) với các kháng nguyên tinh sạch có hoặc không có chất bổ trợ; thu mẫu huyết thanh ở các mốc thời gian; đánh giá hiệu giá kháng thể IgG đặc hiệu bằng ELISA gián tiếp; xác định hiệu giá ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) với kháng nguyên đồng gen và dị chủng.
  • Thí nghiệm trên gà và công cường độc: Gà thí nghiệm 3 tuần tuổi được tiêm bắp 2 lần với kháng nguyên tinh sạch hoặc dịch chiết thô lá thuốc lá; đánh giá kháng thể IgY bằng Western blot và ELISA; xác định hiệu giá HI trước và sau công cường độc; thử nghiệm công cường độc bằng cách tiêm virus sống độc lực cao chủng A/duck/TG/NAVET (3)/2013 (clade 1.1) hoặc chủng A/Chicken/DL/NAVET_0292/2013 (clade 2.3.2.1c) tại liều $100 \times LD_{50}$; theo dõi tỷ lệ sống sót và bệnh lý trong 14 ngày.

Kháng nguyên	Chủng gốc / Thiết kế	Clade	Cấu trúc dung hợp	Phương pháp tinh sạch
H5TG trimer	A/duck/Vietnam/TG24-O1/05	1	GCN4pII + 6xHis + KDEL	IMAC
H5TG oligomer ELP	A/duck/Vietnam/TG24-O1/05	1	GCN4pII + 100xELP + 6xHis + KDEL	mITC
H5HT trimer	A/duck/Vietnam/HT-O2/2014	2.1c	GCN4pII + 6xHis + KDEL	IMAC
H5HT oligomer ELP	A/duck/Vietnam/HT-O2/2014	2.1c	GCN4pII + 100xELP + 6xHis + KDEL	mITC
H5HT oligomer TP	A/duck/Vietnam/HT-O2/2014	2.1c	GCN4pII + Fc (Cµ2-Cµ4) + tp + 6xHis	IMAC
HACOBRA1 trimer	Đồng thuận nhân tạo	1	GCN4pII + 6xHis + KDEL	IMAC
HACOBRA1 oligomer ELP	Đồng thuận nhân tạo	1	GCN4pII + 100xELP + 6xHis + KDEL	mITC
HACOBRA1 oligomer TP	Đồng thuận nhân tạo	1	GCN4pII + Fc (Cµ2-Cµ4) + tp + 6xHis	IMAC
HACOBRA2 trimer	Đồng thuận nhân tạo	2	GCN4pII + 6xHis + KDEL	IMAC
HACOBRA2 oligomer ELP	Đồng thuận nhân tạo	2	GCN4pII + 100xELP + 6xHis + KDEL	mITC
HACOBRA2 oligomer TP	Đồng thuận nhân tạo	2	GCN4pII + Fc (Cµ2-Cµ4) + tp + 6xHis	IMAC

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của nghiên cứu phát triển vaccine cúm gia cầm thế hệ mới tại Việt Nam dựa trên công nghệ biểu hiện tạm thời ở thực vật. Xác định mục tiêu chế tạo các dạng kháng nguyên HA trimer, oligomer TP và oligomer ELP của các chủng virus tự nhiên và nhân tạo COBRA; nêu 4 nội dung nghiên cứu chính tương ứng với các giai đoạn thực nghiệm.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Tổng hợp 120 tài liệu khoa học trong và ngoài nước về đặc điểm sinh học, biến chủng phân tử của virus cúm A/H5N1, dịch tễ học tại Việt Nam qua các năm; phân tích cơ chế hình thành kháng thể trung hòa kháng HA; tổng quan các công nghệ sản xuất vaccine từ thực vật (molecular farming), hệ thống biểu hiện tạm thời qua Agrobacterium tumefaciens; phân tích nguyên lý thiết kế vaccine phổ rộng COBRA, công nghệ trimer hóa bằng motif GCN4pII, oligomer hóa qua domain Fc-IgM và phương pháp tinh sạch bằng chu kỳ chuyển tiếp nghịch đảo ELP/mITC.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn vật liệu thực vật (Nicotiana benthamiana), chủng vi sinh vật (E. coli DH5α, A. tumefaciens C58C1), nguồn động vật thí nghiệm (chuột BALB/c, gà thí nghiệm); liệt kê danh mục 26 mồi giải trình tự và nhân dòng gen; trình bày chi tiết các hóa chất, đệm và quy trình thực nghiệm: thiết kế vector pRTRA, biến nạp hút chân không ở áp suất 100 mbar, quy trình tinh sạch mITC cải tiến với PEG 8000, quy trình sắc ký ái lực IMAC, các phép phân tích SDS-PAGE, Western blot, liên kết chéo $\text{BS}^3$, thử nghiệm ngưng kết hồng cầu (HA), ức chế ngưng kết hồng cầu (HI), ELISA gián tiếp và quy trình công cường độc chủng H5N1 độc lực cao trên gà cách ly an toàn sinh học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Trình bày kết quả nghiên cứu thực nghiệm được chia thành 4 nhóm nội dung chính kèm theo phần thảo luận chuyên sâu:

1. Lựa chọn và thiết kế gen mã hóa kháng nguyên HA:

   • Đã thu thập và phân tích các trình tự HA của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam. Chọn lọc 2 trình tự đại diện tự nhiên: gen H5TG từ chủng A/duck/Vietnam/TG24-O1/05 (clade 1) và gen H5HT từ chủng A/duck/Vietnam/HT-O2/2014 (clade 2.1c).
   • Thiết kế thành công 2 trình tự đồng thuận nhân tạo bằng phương pháp COBRA: HACOBRA1 (đại diện cho các biến thể clade 1) và HACOBRA2 (đại diện cho các biến thể clade 2). Trình tự amino acid được tối ưu hóa bộ mã di truyền cho cây thuốc lá mà không làm thay đổi các epitope kháng nguyên chủ chốt.

2. Thiết kế vector và biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá:

   • Thiết kế thành công 11 cấu trúc vector biểu hiện thực vật thuộc các dạng: HA trimer, HA oligomer ELP và HA oligomer TP.
   • Xác định điều kiện biểu hiện tối ưu: Cây thuốc lá thủy canh 5 tuần tuổi, mật độ dịch khuẩn biến nạp $OD_{600} = 0{,}8$–$1{,}0$, thời gian thu hoạch lá tốt nhất là 5 ngày sau biến nạp.
   • Mức độ tích lũy kháng nguyên: Các dạng dung hợp ELP đạt mức độ biểu hiện cao nhất trong mô lá tươi (lên đến 0,8–1,2 g/kg lá tươi), cao hơn rõ rệt so với các dạng trimer không dung hợp ELP. Dịch chiết thô lá thuốc lá biểu hiện các dạng HA oligomer thể hiện hoạt tính ngưng kết hồng cầu gà rõ rệt với hiệu giá đạt từ $2^5$ đến $2^7$ HAU.

3. Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hóa và hoạt tính sinh học:

   • Cải tiến quy trình tinh sạch mITC: Bổ sung 4% PEG 8000 giúp kết tủa hoàn toàn HA oligomer ELP ở nhiệt độ phòng, loại bỏ trên 90% protein tạp của lá cây, hiệu suất thu hồi protein đạt trên 85%.
   • Tinh sạch HA trimer và HA oligomer TP qua cột IMAC đạt độ tinh sạch trên 90%.
   • Phân tích liên kết chéo với $\text{BS}^3$ và sắc ký SEC khẳng định: HA trimer tồn tại ở cấu trúc bộ ba bền vững; HA oligomer TP hình thành phức hợp đa tụ bậc cao (oligomer) với kích thước phân tử trên 1000 kDa tương tự dạng lục thể IgM.
   • Hoạt tính ngưng kết hồng cầu (HA test) của kháng nguyên sau tinh sạch: HA oligomer TP và HA oligomer ELP có hoạt tính ngưng kết cao hơn từ 4 đến 8 lần so với dạng HA trimer tương ứng trên cùng một nồng độ protein.

Nhóm kháng nguyên	Cấu trúc phân tử	Hàm lượng biểu hiện (g/kg lá tươi)	Độ tinh sạch sau xử lý (%)	Hoạt tính ngưng kết hồng cầu (HAU/µg protein)
H5TG trimer	Trimer (GCN4pII)	~0,15	>90% (IMAC)	16
H5TG oligomer ELP	Oligomer (100xELP)	~0,95	>85% (mITC + PEG)	64
H5HT trimer	Trimer (GCN4pII)	~0,18	>90% (IMAC)	16
H5HT oligomer TP	Multimer (Fc-IgM)	~0,25	>90% (IMAC)	128
HACOBRA1 trimer	Trimer (GCN4pII)	~0,16	>90% (IMAC)	32
HACOBRA1 oligomer TP	Multimer (Fc-IgM)	~0,28	>90% (IMAC)	128

4. Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và hiệu lực bảo hộ trên động vật:
   • Trên chuột BALB/c: Kháng nguyên HA trimer và HACOBRA1 trimer tinh sạch kích thích sinh kháng thể IgG đặc hiệu cao (chuẩn độ ELISA đạt điểm kết thúc $1:128.000$). Kháng huyết thanh chuột tiêm HACOBRA1 trimer có hiệu giá HI kháng chéo đồng thời với cả chủng virus clade 1 (hiệu giá 6 log2) và các chủng thuộc clade 2 (hiệu giá 5 log2).
   • Trên gà thí nghiệm: Kháng nguyên H5TG trimer và H5HT oligomer TP tinh sạch cũng như dịch chiết thô chứa H5HT oligomer TP kích thích tạo kháng thể IgY đặc hiệu cao sau 2 mũi tiêm. Hiệu giá kháng thể HI trung bình đạt $\ge 6 \log_2$.
   • Thử nghiệm công cường độc trên gà:
     • Gà được tiêm H5TG trimer tinh sạch sống sót 100% khi công cường độc với chủng virus H5N1 clade 1.1 (A/duck/TG/NAVET (3)/2013), trong khi nhóm đối chứng chết 100% trong vòng 4–5 ngày.
     • Gà được tiêm H5HT oligomer TP tinh sạch hoặc dịch chiết thô lá thuốc lá mang H5HT oligomer TP đạt tỷ lệ sống sót 100% trước thử thách công cường độc của chủng virus H5N1 clade 2.3.2.1c (A/Chicken/DL/NAVET_0292/2013) ở liều $100 \times LD_{50}$. Không ghi nhận triệu chứng bệnh lâm sàng ở nhóm gà được bảo hộ.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt học thuật và lý luận

• Thiết kế thành công các trình tự kháng nguyên nhân tạo HACOBRA1 và HACOBRA2 có tính đại diện cao cho các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 1 và clade 2 lưu hành tại Việt Nam; chứng minh trên mô hình động vật rằng kháng nguyên COBRA có khả năng kích thích sinh kháng thể trung hòa phản ứng chéo rộng rãi giữa các phân nhóm virus khác nhau.
• Sáng tạo và làm rõ cơ chế oligomer hóa kháng nguyên HA trong tế bào thực vật thông qua việc dung hợp domain Fc của IgM chuột (tiểu phần Cµ2–Cµ4 kèm đuôi peptide chứa Cys575), tạo ra phức hợp đa tụ bậc cao mô phỏng cấu trúc lục thể; chứng minh dạng oligomer này có hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hiệu lực kích thích miễn dịch vượt trội so với dạng trimer và monomer.
• Làm sáng tỏ ảnh hưởng của chuỗi 100xELP đối với sự tích lũy của kháng nguyên HA trimer trong mô thực vật: Dung hợp ELP làm tăng mức độ tích lũy protein tái tổ hợp lên nhiều lần mà không làm cản trở quá trình trimer hóa tự nhiên của protein.

Những đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Xây dựng hoàn chỉnh quy trình công nghệ biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp mang hoạt tính sinh học trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana thủy canh bằng kỹ thuật hút chân không quy mô phòng thí nghiệm, cho phép thu hoạch sinh khối kháng nguyên chỉ sau 5 ngày với năng suất cao.
• Cải tiến thành công quy trình tinh sạch kháng nguyên HA ELP hóa bằng phương pháp mITC kết hợp PEG 8000, cho phép thu hồi protein mục tiêu với độ tinh sạch trên 85% và hiệu suất trên 85% mà không đòi hỏi hệ thống sắc ký đắt tiền, tạo tiền đề thuận lợi cho việc nâng quy mô sản xuất.
• Đã chứng minh dịch chiết thô từ lá thuốc lá chứa kháng nguyên H5HT oligomer TP có khả năng bảo hộ 100% gà thí nghiệm chống lại liều công cường độc của virus cúm H5N1 độc lực cao, mở ra hướng ứng dụng sản xuất vaccine thú y dạng dịch chiết thô đơn giản, giá thành thấp, đáp ứng khẩn cấp khi dịch cúm bùng phát.

Kiến nghị

• Tiếp tục mở rộng thử nghiệm đánh giá khả năng bảo hộ chéo của kháng nguyên HACOBRA1 và HACOBRA2 trên gà trước các biến chủng virus cúm H5 mới xuất hiện tại Việt Nam (như H5N6, H5N8).
• Nghiên cứu hoàn thiện quy trình biểu hiện và tinh sạch ở quy mô bán công nghiệp (pilot), đồng thời tối ưu hóa công thức chất bổ trợ và chất bảo quản nhằm nâng cao độ ổn định nhiệt độ của chế phẩm vaccine có nguồn gốc từ thực vật.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Các thử nghiệm công cường độc trên động vật mới tập trung đánh giá hiệu lực bảo hộ đối với các chủng virus đại diện cho clade 1.1 và clade 2.3.2.1c; chưa mở rộng thử nghiệm công cường độc trực tiếp với các phân type H5N6 hoặc H5N8 tái tổ hợp mới xuất hiện.
  • Việc sử dụng chế phẩm dịch chiết thô lá thuốc lá chưa qua tinh sạch cần được theo dõi, đánh giá thêm về độ ổn định phân tử theo thời gian bảo quản và xác định mức độ phản ứng mô cục bộ ở quy mô đàn thương phẩm lớn.
• Hướng nghiên cứu phát triển tiếp:
  • Đánh giá phổ bảo hộ của các ứng viên HACOBRA trước các phân dòng virus cúm biến đổi mới.
  • Chuẩn hóa dạng bào chế, thử nghiệm các chất bổ trợ nhũ dầu thương mại thích hợp và kiểm tra thời gian tồn lưu kháng thể bảo hộ kéo dài trên đàn gia cầm nuôi thực tế.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên và các nhà nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Miễn dịch học, Thú y học và Bệnh học truyền nhiễm.
  • Các viện nghiên cứu, doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế và thuốc thú y định hướng phát triển công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên nền tảng thực vật (plant molecular farming).
• Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên môn cao:
  • Chiến lược thiết kế kháng nguyên phổ rộng bằng phương pháp tin sinh học COBRA.
  • Thiết kế cassette biểu hiện đa tính năng chứa các motif chức năng (LeB4, KDEL, His-tag, GCN4pII, Fc-IgM, 100xELP).
  • Quy trình thực nghiệm biểu hiện tạm thời bằng buồng hút chân không trên N. benthamiana thủy canh.
  • Phương pháp tinh sạch mITC cải tiến sử dụng PEG 8000 đối với protein dung hợp ELP.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Kháng nguyên HA dạng trimer và oligomer trong luận án được thiết kế dựa trên các cấu trúc phân tử nào?

Kháng nguyên dạng trimer được tạo ra bằng cách dung hợp đầu C của ectodomain HA với motif trimer hóa GCN4pII (kèm tín hiệu lưu giữ lưới nội sinh chất KDEL và đuôi 6xHis). Dạng oligomer TP được tạo ra bằng cách dung hợp tiếp cấu trúc HA trimer với phân đoạn Fc của phân tử IgM chuột (gồm các tiểu phần Cµ2, Cµ3, Cµ4 và đoạn đuôi peptide - tailpiece chứa gốc Cysteine 575), giúp các trimer liên kết chéo tự nhiên tạo thành phức hợp đa tụ bậc cao dạng lục thể (hexameric trimer).

2. Phương pháp mITC cải tiến với PEG 8000 trong tinh sạch HA ELP hóa có ưu điểm gì?

Phương pháp mITC (membrane-based Inverse Transition Cycling) dựa trên đặc tính chuyển pha theo nhiệt độ của chuỗi 100xELP. Khi bổ sung 4% PEG 8000 vào dịch chiết thô ở nhiệt độ phòng, protein dung hợp ELP chuyển pha không tan và bị giữ lại hoàn toàn trên màng lọc cellulose acetate kích thước 0,2–0,45 µm, sau đó được hòa tan trở lại bằng đệm lạnh. Quy trình này loại bỏ hơn 90% protein tạp của lá thuốc lá, đạt hiệu suất thu hồi trên 85% mà không cần ly tâm phân đoạn tốc độ cao hay sử dụng cột sắc ký ái lực đắt tiền.

3. Công nghệ thiết kế COBRA trong luận án giải quyết vấn đề gì của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam?

Do virus cúm A/H5N1 liên tục đột biến tích lũy gây trôi dạt kháng nguyên trên gen HA, các vaccine đơn dòng thông thường nhanh chóng mất hiệu lực bảo hộ. Công nghệ COBRA (Computationally Optimized Broadly Reactive Antigen) phân tích và lựa chọn các amino acid bảo thủ xuất hiện với tần suất cao nhất tại từng vị trí từ ngân hàng dữ liệu các chủng phân lập tại Việt Nam, từ đó tạo ra kháng nguyên nhân tạo (HACOBRA1 cho clade 1 và HACOBRA2 cho clade 2) có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể trung hòa phản ứng chéo bảo vệ chống lại nhiều biến thể trong cùng clade và khác clade.

4. Kết quả thử nghiệm công cường độc trên gà cho thấy mức độ bảo hộ của các kháng nguyên tái tổ hợp như thế nào?

Thử nghiệm công cường độc với liều gây chết $100 \times LD_{50}$ của các chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao thực địa (chủng A/duck/TG/NAVET (3)/2013 thuộc clade 1.1 và chủng A/Chicken/DL/NAVET_0292/2013 thuộc clade 2.3.2.1c) cho thấy: 100% gà được tiêm kháng nguyên H5TG trimer tinh sạch, H5HT oligomer TP tinh sạch hoặc dịch chiết thô lá thuốc lá mang H5HT oligomer TP đều sống sót khỏe mạnh, không có triệu chứng bệnh và duy trì hiệu giá HI bảo hộ cao, trong khi 100% gà ở nhóm đối chứng không tiêm phòng bị chết trong vòng 4–5 ngày sau nhiễm.

5. Dịch chiết thô lá cây thuốc lá biểu hiện kháng nguyên HA oligomer TP có thể định hướng ứng dụng trực tiếp làm vaccine không?

Có. Kết quả nghiên cứu của luận án chứng minh rằng dịch chiết thô lá thuốc lá chứa kháng nguyên H5HT oligomer TP sau khi nghiền và lọc đơn giản vẫn giữ nguyên hoạt tính ngưng kết hồng cầu ($2^5$–$2^7$ HAU) và khi tiêm bắp cho gà thí nghiệm đã tạo ra đáp ứng kháng thể IgY đặc hiệu cùng hiệu giá HI đạt $\ge 6 \log_2$, bảo hộ 100% gà sống sót sau công cường độc. Điều này chứng minh tiềm năng ứng dụng trực tiếp dịch chiết thô làm vaccine thú y giá thành thấp, rút ngắn thời gian tinh chế trong các tình huống dịch bệnh khẩn cấp.

---

Kết luận

Luận án của NCS. Phạm Thị Vân đã nghiên cứu ứng dụng hệ thống biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium tumefaciens trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana để tạo thành công các dạng kháng nguyên Hemagglutinin tái tổ hợp (trimer, oligomer ELP và oligomer TP) của virus cúm A/H5N1 tự nhiên và nhân tạo COBRA. Nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình tinh sạch kháng nguyên dung hợp ELP bằng phương pháp mITC cải tiến với PEG 8000 và làm sáng tỏ hiệu quả kích thích miễn dịch vượt trội của cấu trúc đa tụ oligomer TP. Kết quả thử nghiệm sinh học khẳng định các kháng nguyên tái tổ hợp tinh sạch cũng như dịch chiết thô thực vật kích thích sinh kháng thể trung hòa phổ rộng và bảo hộ 100% gà thí nghiệm chống lại liều công cường độc của virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao. Công trình cung cấp cơ sở khoa học và quy trình thực nghiệm giá trị, mở ra triển vọng chủ động phát triển vaccine cúm gia cầm thế hệ mới tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 (Influenza A virus subtype H5N1) thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Alphainfluenzavirus, loài virus cúm A (Influenza A virus). Virus cúm A được phân loại thành các phân nhóm theo sự kết hợp của hai protein bề mặt virus hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA).

Cho đến nay có 18 phân nhóm HA khác nhau và 11 phân nhóm NA khác nhau và trong tự nhiên các phân nhóm HA và NA có thể tái tổ hợp luân chuyển (reassortment) tạo nên các phân type HxNy mới. Tùy thuộc vào vật chủ gốc, virus cúm A có thể được phân loại là cúm gia cầm (ví dụ: cúm gia cầm A/H5N1, A/H9N2, A/H5N6… ), cúm lợn (ví dụ: cúm lợn A/H1N1, A/H3N2…) hoặc các loại virus cúm động vật khác. Virus cúm A có phổ thích ứng rộng có thể gây bệnh trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau như: chim, gia cầm, thuỷ cầm, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và người. Đặc điểm thích ứng đa vật chủ là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi hoặc tái tổ hợp các phân đoạn gen (đặc biệt là gen kháng nguyên HA và NA) giữa các chủng lưu hành để tạo ra chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới.

Đặc biệt hơn, các phân type hay chủng mới gây bệnh khi chúng vượt qua được “rào cản loài” (species-barrier) dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [5]. Sự xuất hiện của một loại virus cúm A mới và rất khác biệt có khả năng lây nhiễm sang người và lây truyền từ người sang người là rất có thể và có khả năng gây ra đại dịch cúm toàn cầu. Virus cúm A/H5N1 gây bệnh nặng ở gia cầm và dẫn đến tỷ lệ tử vong cao nên còn được gọi là virus cúm gia cầm thể độc lực cao (highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV) type A và phân type (subtype) H5N1, HPAI A(H5N1)) [https://en.org/wiki/Influenza_A_virus_subtype_H5N1]. Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu đường kính từ 50–100 nm.

Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm và dài từ 200–300 nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi chứa RNA. Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm luan an 5 đã được đặc hiệu hóa để gắn protein màng của virus vào, bao gồm một số protein được glycosyl hoá (glycoprotein) và một số protein dạng trần không được glycosyl hoá (non-glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA, protein enzyme cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix).

Lipid tập trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin. Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhô lên từ bề mặt của virus, mỗi gai có độ dài từ 10–14 nm. Các gai này được cấu tạo bởi hai loại glycoprotein HA và NA.

Các gai HA thường nhiều hơn và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4–5):1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8]. Hệ gen virus cúm A/H5N1 là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn RNA riêng biệt (Hình 1.1), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và NS2) [6]. Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50–100 nm, đường kính 9–10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) luan an 6 với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein của virus (vRNP) (Hình 1.

Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có độ dài từ 10.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm A) và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus. Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có chứa khoảng 0,8–1,1% RNA, 70–75% là protein, 20–24% lipid và 5–8% là carbohydrate [7]. Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch cúm trong lịch sử ở động vật và người [6, 9]. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lây truyền trong quần thể sinh vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người (zoonotic infections).

Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học là chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi gen thông qua H9N2 (trên lợn) [5, 10]. Virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể sử dụng nguồn phôi gà để sản xuất vaccine vô hoạt cho gia cầm. Để khắc phục điều này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã kiến tạo thành công hướng sản xuất vaccine H5N1 bằng phương pháp di truyền ngược (reverse genetics - based technology). Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo tái tổ hợp gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch nhưng không gây bệnh.

Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi nội gen và xảy ra nhanh nên việc sản xuất vaccine cũng gặp không ít khó khăn và đòi hỏi sự cập nhật liên tục. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A Nhóm virus cúm A đều có hệ gen là RNA chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên tục, nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hóa cho một loại protein của virus. Hai đầu 5' và 3' của RNA hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn trong tất cả virus cúm A, đó là 5'-AGUAGAACAAGG. và 3'- UCG(U/C)UUUCGUCC.

Sáu phân đoạn từ 1–6, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho các protein riêng biệt, phân đoạn 7 và 8 mã hoá cho từng phần của luan an 7 gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông tin và mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối ghép (splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp protein [8]. Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). RNP kết hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của virus. Phân đoạn 1 mã hoá cho enzyme polymerase PB2 (polymerase basic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã, có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84 kDa (thực tế là: 87 kDa) [8].

Phân đoạn 2 mã hoá cho enzyme polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNAtranscriptase), có độ dài 2341 nucleotide, với trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) [11]. Phân đoạn 3 mã hoá cho enzyme kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNAtranscriptase) tham gia tổng hợp RNA, có độ dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực tế: 85 kDa) [11]. Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu). Có 18 loại HA, trong đó chỉ có H1, H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người.

Virus mang gen H5, H7 và H9 có thể lây nhiễm từ chim sang người. HA được phân bố rải rác trên bề mặt của virus, là protein kháng nguyên bề mặt type I liên quan đến sự bám dính của virus và gắn virus vào thụ thể acid sialic của tế bào, có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu gà và tham gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của virus, hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus. HA có phân tử lượng là 63 kDa (nếu không được glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48 kDa và HA2 là 29 kDa) [12], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type virus, đối với H5N1 là 1704–1707 bp, H7N1 là 1683–1695 bp, H9N1 là 1683 bp, H1N1 là 1701 bp. Phân đoạn 5 mã hoá cho protein nucleoprotein (NP) có trọng lượng phân tử tính toán là 56 kDa, gen NP của H5N1 có độ dài là 1497 bp [8].

Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu hiện đặc tính kháng nguyên luan an 8 đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein. Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA). NA có trọng lượng phân tử theo tính toán 50 kDa (thực tế: 48–63kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1 là 1350–1410 bp [12]. NA là protein màng type II tồn tại như các gai hình nấm trên bề mặt của virus.

NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính enzyme phân cắt liên kết giữa thụ thể acid sialic và HA, để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào, nhờ vậy mà đẩy nhanh quá trình lan truyền virus trong tế bào chủ. Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng bám dính vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình xâm nhập, nhân lên và giải phóng virus. Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1 và M2. Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng bao gói và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus.

Tiểu phần M2 là protein nội màng, có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân tử tính toán của M1 là 28 kDa (thực tế: 25 kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa), phân đoạn M có độ dài khoảng 1027 bp [14].