Phân Lập Gen Mã Hóa Protein Lc Điều Hòa Tổng Hợp Anthocyanin Từ Cây Ngô Nếp Địa Phương

• Tác giả: Nguyễn Thị Khuyên
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Phân Lập Gen Điều Hòa Tổng Hợp Anthocyanin Từ Cây Ngô Nếp Địa Phương
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Sơ lược về cây ngô
• 2.1.1. Đặc điểm sinh học của cây ngô
• 2.1.2. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp
• 2.2. Hạn và phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn
• 2.2.1. Hạn và tính chống chịu stress oxy hóa
• 2.2.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa
• 2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp gây hạn nhân tạo
• 3.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
• 3.3.3. Phương pháp RT-PCR
• 3.3.4. Tạo vector tái tổ hợp
• 3.3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.
• 3.3.6. Kiểm tra sản phẩm tách dòng
• 3.3.7. Phương pháp xác định trình tự gen
• 3.3.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập gen Lc từ giống ngô nếp địa phương NH
• 4.2. Kết quả tách dòng phân tử mang gen Lc từ giống NH
• 4.3. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen Lc ở giống ngô nếp NH
• 4.4. Đặc điểm trình tự gen Lc của giống ngô nếp địa phương NH
• 4.5. So sánh trình tự gen Lc của giống NH với các trình tự trên GenBank. Phân tích sự tương đồng gen Lc của giống NH với các gen khác trong họ bHLH
• 4.6. Đặc điểm trình tự protein Lc suy diễn của giống ngô nếp địa phương NH
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Gen Anthocyanin Ngô Nếp Địa Phương

Ngô (Zea mays L.) là cây lương thực quan trọng, đặc biệt ở các vùng trung du và miền núi phía Bắc Việt Nam. Các giống ngô nếp địa phương có chất lượng hạt tốt, khả năng chịu hạn cao, phù hợp với canh tác đất dốc. Tuy nhiên, năng suất thấp khiến nhiều giống quý bị mai một. Nghiên cứu về gen anthocyanin và khả năng chịu hạn là rất cần thiết để bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu lai giống. Anthocyanin là sắc tố dịch bào có màu đỏ, đỏ tía, tím, xanh đậm, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nước. Nghiên cứu xác định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn, trong đó có chỉ thị sắc tố anthocyanin và các gen liên quan. Đề tài "Phân lập gen mã hóa protein Lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương" được thực hiện nhằm phân lập và phân tích đặc điểm trình tự gen Lc từ cây ngô nếp địa phương.

1.1. Giá trị kinh tế và dinh dưỡng của ngô nếp địa phương

Ngô nếp là nguồn lương thực quan trọng, đặc biệt ở vùng núi phía Bắc. Hạt ngô nếp có độ dẻo, mùi vị thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, dễ hấp thu hơn so với ngô tẻ. Hàm lượng các amino acid không thay thế như triptophan và lyzin cao. Hàm lượng lipit cao (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên. Protein của ngô được chia thành ba loại chính: protein hoạt tính, protein cấu trúc và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất. Hàm lượng protein dao động từ 4,8- 16,6% ở mỗi giống.

1.2. Tầm quan trọng của việc bảo tồn nguồn gen ngô nếp

Các giống ngô nếp địa phương có ưu điểm chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn và kháng sâu bệnh tốt, có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau đang đứng trên nguy cơ bị suy giảm quỹ gen vì năng suất thường thấp. Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá một cách toàn diện nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết cho công tác giống và bảo tồn nguồn gen quý.

II. Thách Thức Ảnh Hưởng Của Hạn Đến Sinh Trưởng Ngô Nếp

Hạn hán là một trong những yếu tố môi trường gây ảnh hưởng lớn đến năng suất ngô nếp. Tình trạng thiếu nước làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, đặc biệt là trong giai đoạn trỗ cờ và phun râu. Hạn hán gây ra stress oxy hóa, làm tăng các gốc tự do (ROS), gây tổn thương tế bào. Cây trồng có cơ chế tự bảo vệ bằng cách tăng cường sản xuất các chất chống oxy hóa như anthocyanin. Nghiên cứu về cơ chế chịu hạn và vai trò của anthocyanin trong điều kiện hạn hán là rất quan trọng để phát triển các giống ngô nếp chịu hạn tốt.

2.1. Cơ chế tác động của hạn hán lên cây ngô nếp

Hạn hán gây ra nhiều tác động tiêu cực đến cây ngô nếp, bao gồm giảm khả năng hấp thụ nước và dinh dưỡng, ức chế quá trình quang hợp, và tăng cường quá trình hô hấp. Thiếu nước làm giảm áp suất trương nước của tế bào, gây ra hiện tượng héo và làm chậm quá trình sinh trưởng. Hạn hán cũng có thể gây ra tổn thương cho các cơ quan của cây, như lá và rễ.

2.2. Stress oxy hóa và vai trò của anthocyanin trong điều kiện hạn

Stress oxy hóa xảy ra trong điều kiện hạn tạo ra hàng loạt các dạng oxy hoạt hóa (ROS) gây tổn thương, thậm chí làm chết tế bào. Anthocyanin có khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp bảo vệ tế bào khỏi tác động của ROS. Anthocyanin được coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó.

2.3. Các giai đoạn sinh trưởng của ngô nếp dễ bị ảnh hưởng bởi hạn

Trong quá trình phát triển của cây có những giai đoạn bị khủng hoảng: bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan sinh sản, kết thúc vào lúc thụ phấn hoàn toàn. Đây là thời kỳ cây cần nước nhất và kém chịu đựng nhất. Hạn xảy ra trong thời gian này làm giảm năng suất một cách đáng kể. Ở ngô sự trỗ cờ và phun râu phải xảy ra đồng thời. Hiện tượng phun râu ngô chậm gắn liền với sự chịu hạn bởi vì râu ngô chứa phần lớn là nước.

III. Phương Pháp Phân Lập Gen Điều Hòa Tổng Hợp Anthocyanin

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương. Quy trình bao gồm tách chiết mRNA tổng số, khuếch đại cDNA bằng kỹ thuật RT-PCR, tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vào tế bào vi khuẩn, và xác định trình tự gen. Mục tiêu là xác định trình tự gen Lc, một gen quan trọng trong quá trình điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin. Kết quả phân tích trình tự gen sẽ cung cấp thông tin quan trọng về cấu trúc và chức năng của gen Lc trong cây ngô nếp.

3.1. Quy trình tách chiết RNA và khuếch đại cDNA

Quy trình tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo phương pháp tiêu chuẩn. Sau đó, cDNA được tổng hợp từ mRNA bằng enzyme phiên mã ngược. Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn cDNA chứa gen Lc. Các mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen Lc đã biết từ các giống ngô khác.

3.2. Tạo dòng và xác định trình tự gen Lc từ ngô nếp

Đoạn cDNA chứa gen Lc được gắn vào vector tái tổ hợp và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli. Các dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp được chọn lọc và nhân dòng. Plasmid được tách chiết và trình tự gen Lc được xác định bằng phương pháp Sanger.

3.3. Phân tích trình tự gen và protein Lc suy diễn

Trình tự gen Lc thu được được phân tích bằng các phần mềm tin sinh học để xác định các vùng mã hóa, vùng điều hòa, và các motif chức năng. Trình tự protein Lc suy diễn được so sánh với các protein tương đồng từ các loài thực vật khác để xác định các vùng bảo tồn và dự đoán chức năng.

IV. Kết Quả Phân Lập Gen Lc Từ Giống Ngô Nếp Địa Phương NH

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập gen Lc từ giống ngô nếp địa phương Nà Hạo (NH). Kết quả phân tích trình tự nucleotide cho thấy gen Lc của giống NH có sự tương đồng cao với các trình tự gen Lc đã được công bố trên GenBank. Tuy nhiên, cũng có một số sai khác về nucleotide và amino acid. Phân tích sự tương đồng gen Lc của giống NH với các gen khác trong họ bHLH cho thấy mối quan hệ di truyền gần gũi.

4.1. Đặc điểm trình tự nucleotide của gen Lc ở giống ngô nếp NH

Trình tự nucleotide của gen Lc ở giống ngô nếp NH được xác định và phân tích. Kết quả cho thấy gen Lc có chiều dài khoảng X kb, chứa Y exon và Z intron. Các vùng mã hóa và vùng điều hòa được xác định.

4.2. So sánh trình tự gen Lc của giống NH với các trình tự trên GenBank

Trình tự gen Lc của giống NH được so sánh với các trình tự gen Lc đã được công bố trên GenBank. Kết quả cho thấy sự tương đồng cao, nhưng cũng có một số sai khác về nucleotide. Các sai khác này có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein Lc.

4.3. Phân tích sự tương đồng gen Lc với các gen khác trong họ bHLH

Gen Lc thuộc họ gen bHLH, một họ gen quan trọng trong quá trình điều hòa phiên mã ở thực vật. Phân tích sự tương đồng gen Lc của giống NH với các gen khác trong họ bHLH cho thấy mối quan hệ di truyền gần gũi.

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu Gen Anthocyanin Trong Cải Thiện Giống

Kết quả nghiên cứu về gen anthocyanin có thể được ứng dụng trong cải thiện giống ngô nếp thông qua chọn tạo các giống có khả năng chịu hạn tốt hơn và hàm lượng anthocyanin cao hơn. Các marker phân tử liên kết với gen Lc có thể được sử dụng trong chọn giống có sự hỗ trợ của marker (marker-assisted selection). Ngoài ra, công nghệ biến đổi gen cũng có thể được sử dụng để tăng cường biểu hiện gen Lc và tăng hàm lượng anthocyanin trong ngô nếp.

5.1. Sử dụng marker phân tử trong chọn giống ngô nếp chịu hạn

Các marker phân tử liên kết với gen Lc có thể được sử dụng để xác định các cá thể có kiểu gen mong muốn trong quần thể chọn giống. Phương pháp này giúp rút ngắn thời gian chọn giống và tăng hiệu quả chọn lọc.

5.2. Công nghệ biến đổi gen để tăng cường biểu hiện gen Lc

Công nghệ biến đổi gen có thể được sử dụng để đưa gen Lc vào các giống ngô nếp có năng suất cao nhưng khả năng chịu hạn kém. Việc tăng cường biểu hiện gen Lc có thể giúp tăng hàm lượng anthocyanin và cải thiện khả năng chịu hạn của cây.

5.3. Tạo giống ngô nếp giàu anthocyanin và giá trị dinh dưỡng cao

Nghiên cứu về gen anthocyanin có thể giúp tạo ra các giống ngô nếp giàu anthocyanin, có giá trị dinh dưỡng cao và khả năng chống oxy hóa mạnh. Các giống ngô này có thể được sử dụng làm thực phẩm chức năng hoặc nguyên liệu cho các sản phẩm chế biến.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Gen Anthocyanin Ngô Nếp Tương Lai

Nghiên cứu về phân lập gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương là một bước quan trọng trong việc hiểu rõ cơ chế chịu hạn và cải thiện giống. Các hướng nghiên cứu tương lai bao gồm: (1) Nghiên cứu chức năng của protein Lc và các yếu tố điều hòa khác trong quá trình sinh tổng hợp anthocyanin; (2) Phân tích đa dạng di truyền của gen Lc trong các giống ngô nếp địa phương khác nhau; (3) Ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen để tạo ra các giống ngô nếp có đặc tính mong muốn.

6.1. Nghiên cứu chức năng của protein Lc và các yếu tố điều hòa

Nghiên cứu chức năng của protein Lc và các yếu tố điều hòa khác trong quá trình sinh tổng hợp anthocyanin là rất quan trọng để hiểu rõ cơ chế điều hòa phức tạp của quá trình này. Các nghiên cứu này có thể sử dụng các phương pháp sinh học phân tử, sinh hóa, và di truyền học.

6.2. Phân tích đa dạng di truyền của gen Lc trong các giống ngô nếp

Phân tích đa dạng di truyền của gen Lc trong các giống ngô nếp địa phương khác nhau có thể giúp xác định các alen có lợi cho khả năng chịu hạn và hàm lượng anthocyanin. Thông tin này có thể được sử dụng trong chọn giống và lai tạo.

6.3. Ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen để cải thiện giống ngô nếp

Công nghệ chỉnh sửa gen, như CRISPR-Cas9, có thể được sử dụng để chỉnh sửa gen Lc và các gen liên quan đến sinh tổng hợp anthocyanin để tạo ra các giống ngô nếp có đặc tính mong muốn, như khả năng chịu hạn cao hơn và hàm lượng anthocyanin cao hơn.

Tổng quan nghiên cứu

Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất trên thế giới, đóng vai trò thiết yếu trong cung cấp lương thực và thức ăn cho gia súc. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực thứ hai sau lúa, đặc biệt phổ biến ở các vùng trung du và miền núi phía Bắc. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê năm 2016, diện tích trồng ngô tại các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La và Lào Cai lần lượt là 53.500 ha, 40.100 ha, 152.400 ha và 37.600 ha, vượt trội so với diện tích trồng lúa. Tuy nhiên, do đặc điểm địa hình đồi núi chiếm khoảng 75% diện tích và lượng mưa không đồng đều, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất ngô, đặc biệt là các giống ngô nếp địa phương.

Ngô nếp địa phương có chất lượng hạt cao và khả năng chịu hạn tốt, phù hợp với điều kiện đất dốc ở miền núi, nhưng năng suất thấp khiến nhiều giống quý có nguy cơ bị mai một. Anthocyanin, một loại sắc tố flavonoid có khả năng chống oxy hóa mạnh, được xem là chỉ thị sinh học quan trọng liên quan đến khả năng chịu hạn của cây trồng. Việc phân lập và nghiên cứu gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin ở ngô nếp địa phương nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý và phát triển các giống ngô chịu hạn có năng suất cao là rất cần thiết.

Đề tài tập trung phân lập gen Lc mã hóa protein điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ giống ngô nếp địa phương Nà Hạo (NH), phân tích đặc điểm trình tự gen và protein suy diễn, góp phần làm rõ cơ chế sinh học phân tử liên quan đến tính chịu hạn của cây ngô. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống – Đại học Nông lâm, trong năm 2018.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về sinh tổng hợp anthocyanin và cơ chế chịu hạn ở thực vật. Anthocyanin là sắc tố flavonoid có cấu trúc aglucon đặc trưng, có khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp cây chống lại stress oxy hóa do hạn hán gây ra. Quá trình sinh tổng hợp anthocyanin được điều hòa bởi các gen cấu trúc như CHS, DFR, ANS và các yếu tố phiên mã (TF) thuộc họ MYB, bHLH (MYC) và WD40. Gen Lc thuộc họ bHLH đóng vai trò điều hòa chính, tương tác với gen C1 để kích hoạt biểu hiện các gen cấu trúc, từ đó tăng tổng hợp anthocyanin.

Cơ chế chịu hạn ở ngô liên quan đến sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu, phát triển bộ rễ, và khả năng chống stress oxy hóa thông qua các enzyme như SOD, APX và các hợp chất chống oxy hóa như anthocyanin. Gen Lc được xem là một trong những nhân tố quan trọng trong việc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin, góp phần tăng khả năng chịu hạn của cây.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là giống ngô nếp địa phương Nà Hạo (NH) được lựa chọn dựa trên khả năng chịu hạn tốt nhất trong số 10 giống nghiên cứu trước đó. Thí nghiệm gây hạn nhân tạo được tiến hành trên cây ngô non giai đoạn 3 lá bằng phương pháp tưới hạn chế nước trong chậu chứa hỗn hợp cát và đất mùn, mỗi chậu trồng 30 cây.

RNA tổng số được tách chiết từ phần thân và bẹ lá sau 7 ngày gây hạn, sử dụng phương pháp Trizol và xử lý DEPC để loại bỏ tạp chất. Phản ứng RT-PCR được thực hiện với cặp mồi thiết kế dựa trên trình tự gen Lc từ ngân hàng gen quốc tế, nhằm khuếch đại đoạn cDNA gen Lc dài khoảng 1,8 kb. Sản phẩm PCR được gắn vào vector pBT, biến nạp vào chủng E.coli DH5α, chọn lọc khuẩn lạc trên môi trường LB có kháng sinh carbenicillin.

Các dòng khuẩn lạc được kiểm tra bằng phản ứng clony-PCR và enzyme giới hạn BamHI để xác định sự có mặt của gen Lc. Trình tự nucleotide của gen Lc được xác định bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên thiết bị ABIPRISM 3100. Phân tích trình tự gen và protein suy diễn được thực hiện bằng phần mềm BioEdit, DNAstar và so sánh với các trình tự trên GenBank.

Cỡ mẫu bao gồm nhiều dòng khuẩn lạc tái tổ hợp được chọn lọc, đảm bảo tính đại diện và độ tin cậy. Phương pháp phân tích dữ liệu tập trung vào so sánh trình tự nucleotide và amino acid, đánh giá sự tương đồng di truyền và phân tích mối quan hệ di truyền giữa gen Lc của giống NH với các gen họ bHLH khác.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập thành công gen Lc từ giống ngô nếp NH: Sản phẩm RT-PCR có kích thước khoảng 1,8 kb, tương ứng với đoạn cDNA gen Lc. Các dòng khuẩn lạc tái tổ hợp mang gen Lc được xác nhận qua phản ứng clony-PCR và enzyme BamHI, với đoạn DNA cắt r