Đặt vấn đề Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, cung cấp lương thực cho loài người và là thức ăn cho gia súc (với 70% chất tinh trong khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất và chế biến lương thực - thực phẩm - dược phẩm, là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Giá trị sử dụng rộng rãi của ngô được chứng minh bằng 670 mặt hàng khác nhau. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung du và miền núi phía Bắc, và là cây lương thực chính của đồng bào các dân tộc thiểu số ở các vùng núi cao. Năm 2016, tỉnh Hà Giang có diện diện tích trồng lúa là 37500 ha, ngô là 53500 ha; tỉnh Cao Bằng có diện tích trồng lúa là 28900 ha, ngô là 40100 ha; tỉnh Sơn La có diện tích trồng lúa là 51700 ha, ngô là 152400 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là 31600 ha, ngô là 37600 ha (theo số liệu của Tổng cục Thống kê) [13].
Nước ta có 75% diện tích là đồi núi, lượng mưa hàng năm không đồng đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra dẫn đến năng suất của các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa phương nói riêng bị giảm. Trong những năm gần đây, các giống ngô nếp địa phương có chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn tốt và phù hợp với điều kiện canh tác đất dốc của từng vùng ở miền núi, nhưng do năng suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần do hướng sản xuất ngô ở nước ta là tăng cường diện tích ngô lai có năng suất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến. Vì vậy, việc nghiên cứu và chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết, góp phần bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu cho lai giống. Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của quá trình trao đổi chất.
Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện trong các bộ phận của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm. Ngoài việc tạo màu sắc đẹp để bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có hoạt tính sinh học rất quý 1 c là khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nước khi mất cân bằng áp suất thẩm thấu. Anthocyanin được coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó. Hiện nay, định hướng nghiên cứu xác định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang được quan tâm, trong đó có chỉ thị sắc tố anthocyanin và các gen liên quan.
Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Phân lập gen mã hóa protein Lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương”. Mục tiêu của đề tài Phân lập và phân tích được đặc điểm trình tự gen Lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương. Nội dung nghiên cứu - Tạo dòng gen Lc từ giống ngô nếp địa phương chịu hạn tốt Nà Hạo (NH): Tách chiết mRNA tổng số, khuếch đại cDNA bằng kỹ thuật PCR, tách dòng phân tử cDNA gen Lc. - Phân tích đặc điểm trình tự gen Lc và protein suy diễn.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lược về cây ngô 1. Đặc điểm sinh học của cây ngô Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L, thuộc chi Zea, họ Hoà thảo (Poaceae), bộ Hoà thảo (Poales). Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa.
Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ. Ngoài ra, ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [7]. Ngô có lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm và rộng 5-10 cm. Thân cây thẳng, cao 2–3 m, nhiều mấu, các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn.
Dưới các lá này và ôm sát thân cây là các bắp. Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ [7]. Các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông được bao bọc trong một số lớp lá, và được các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu ngô. Râu ngô là các núm nhụy thuôn dài, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng.
Hạt ngô là dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt. Các hạt ngô bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10- 25cm, chứa khoảng 200- 400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng.
Khi được nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì [7]. Ngô nếp (Zea mays L. Ceratina Kulesh), là một trong những loài phụ chính của Zea mays L. Bề ngoài hạt ngô nếp tương tự với ngô đá, nhưng bóng hơn.
Lớp ngoài cùng của mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng như ở ngô tẻ, có tính chất quang học giống như lớp sáp. Do vậy, ngô nếp còn có tên gọi 3 c khác là ngô sáp. Tinh bột của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong khi ngô thường chỉ chứa 75% amylopectin và 25% amylase [7]. Theo Peter Thompson (2005), đặc tính của ngô nếp được quy định bởi đơn gen lặn đó là gen wx [52].
Ngô có 10 cặp nhiễm sắc thể (n=10). Chiều dài tổng cộng của các nhiễm sắc thể là 1500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có "bướu nhiễm sắc thể" - các vùng lặp lại cao với vết màu sẫm. Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô.
Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minh thuyết “Yếu tố di truyền vận động” [66]. Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (DOE) đã xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô. Bộ gen ngô có 50000– 60000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ base [65]. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp Ngô nếp được sử dụng chủ yếu làm lương thực và thức ăn cho con người.
Khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, dễ hấp thu hơn so với tinh bột của ngô tẻ [68]. Một trong những nguyên nhân là do trong ngô nếp có hàm lượng các amino acid không thay thế như triptophan và lyzin cao. Hàm lượng lipit cao (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên. Lipit được tập trung ở phôi và tầng alơron.
Dầu ngô chứa đến 50% axit linoleic liên kết với các glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic. Hàm lượng lipit là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt. Protein của ngô được chia thành ba loại chính: protein hoạt tính (chủ yếu là enzyme), protein cấu trúc và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất. Hàm lượng protein dao động từ 4,8- 16,6% ở mỗi giống.
Lợi dụng tính chất hoà tan của protein trong các dung môi, người ta có thể tách chiết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu như đánh giá chất lượng, khả năng chịu hạn. 4 c Thân cây ngô được sử dụng chủ yếu để nuôi gia cầm và gia súc: cỏ khô, cỏ ủ chua. Hạt ngô cũng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: tổng hợp chất dẻo hay vải sợi; sản xuất xi rô chứa nhiều fructose, chưng cất một số dạng rượu. Ethanol từ ngô cũng được dùng ở hàm lượng thấp (10% hoặc ít hơn) như là phụ gia của xăng làm nhiên liệu cho một số động cơ để gia tăng chỉ số octan, giảm ô nhiễm và giảm mức tiêu thụ xăng (ngày nay gọi chung là "các nhiên liệu sinh học").
Trong nhiều nền văn hóa, người ta sử dụng các món cháo ngô, bánh ngô, bánh mèn mén. Một vài dạng ngô cũng được trồng làm cây cảnh do lá hay bắp nhiều màu, kích thước lớn, bắp dài [65]. Cũng như tình trạng chung trên thế giới, các nghiên cứu về ngô ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào ngô tẻ. Đối với các giống ngô nếp địa phương, đến nay chỉ có một số ít công trình được công bố [3].
Thời gian gần đây, các nhà tạo giống Việt Nam đã bắt đầu chuyển sang hướng tạo giống nếp lai và đã tạo được một số giống nếp lai không quy ước có triển vọng như các giống lai VN2, MX2, MX4, Bạch ngọc. Trong khi đó, các giống ngô nếp địa phương có ưu điểm chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn và kháng sâu bệnh tốt, có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau đang đứng trên nguy cơ bị suy giảm quỹ gen vì năng suất thường thấp. Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá một cách toàn diện nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết cho công tác giống và bảo tồn nguồn gen quý. Hạn và phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn 1.
Hạn và tính chống chịu stress oxy hóa 1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển. Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiếu hụt mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chịu hạn. 5 c Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện), và hạn sinh lí.
Hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào dẫn đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài. Hạn đất tác động mạnh lên bộ rễ của cây. Hiện tượng này gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn, biểu hiện thích ứng toàn cơ thể. Hạn có thể tạo ra những hạt khô, nhăn nheo, không có phẩm chất tốt và thậm chí mất mùa hoàn toàn.
Ở ngô sự trỗ cờ và phun râu phải xảy ra đồng thời. Hiện tượng phun râu ngô chậm gắn liền với sự chịu hạn bởi vì râu ngô chứa phần lớn là nước.